Summary
O método apresentado oferece um modo para detectar auto-anticorpos funcionais eficazes cardiotrópicos no plasma de pacientes com cardiomiopatia dilatada, independentemente do antigénio específico, por meio da análise do impacto da imunoglobulina paciente isolado no encurtamento celular e os transientes de cálcio intracelular em cardiomiócitos de ratos isolados.
Abstract
Cardiomiopatia dilatada (CMD) é uma das principais causas para a insuficiência cardíaca em adultos mais jovens 1. Embora predisposição genética e exposição a substâncias tóxicas são causas conhecidas para essa doença em cerca de um terço dos pacientes, a origem de DCM permanece amplamente claro. Num número substancial de pacientes, os auto-anticorpos contra epítopos cardíacos foram detectados e são suspeitos de desempenhar um papel crucial na iniciação e progressão da doença de 2,3. A importância dos anticorpos cardíacos é sublinhado por uma melhoria hemodinâmica observada em pacientes com CMD após a eliminação de auto-anticorpos por imunoadsorção 3-5. Uma variedade de antigénios específicos já foram identificados 2,3 e anticorpos contra estes objectivos podem ser detectados por imunoensaios. No entanto, estes ensaios não pode discriminar entre o estímulo (ou seja funcionalmente eficaz) e bloqueio de auto-anticorpos. Há cada vez mais evice que esta distinção é 6,7 crucial. Pode também considerar-se que os objectivos estabelecidos para um certo número de anticorpos cardiotrópicos ainda não identificado e, portanto, não pode ser detectada por imunoensaios. Assim, foi estabelecido um método para a detecção de anticorpos funcionalmente activos cardiotrópicos, independentemente do seu antigénio correspondente. O pano de fundo para o método é a elevada homologia normalmente observada para as regiões funcionais de proteínas cardíacas em mamíferos entre 8,9. Isto sugere que os anticorpos dirigidos contra antigénios cardíacos humanos reagem de forma cruzada com as células-alvo não-humanos, o que permite o teste de IgG de pacientes com CMD em cardiomiócitos de ratos adultos. O nosso método consiste em três passos: primeiro, a IgG é isolada a partir de plasma de paciente com Sepharose acoplada anti-IgG de anticorpos obtidas a partir de colunas de imunoadsorção (PlasmaSelect, Teterow, Alemanha). Em segundo lugar, os cardiomiócitos adultos são isolados através de perfusão com colagenase num aparelho de perfusão Langendorff usando aprotocolo modificado de trabalhos anteriores 10,11. Os cardiomiócitos obtidos estão ligados a esfregaços laminina revestidos septadas e coradas com Fura-2, um corante fluorescente de cálcio selectivo que pode ser facilmente levado para dentro da célula para observar o cálcio intracelular (Ca2 +) conteúdo 12. No último passo, o efeito de IgG do paciente sobre a redução das células e os transientes de Ca 2 + de cardiomiócitos de campo estimulado é monitorizada utilizando uma linha de cálcio comercial miócito e contractilidade sistema de monitorização (IonOptix, Milton, MA, EUA), ligado a um padrão inverso fluorescente microscópio.
Protocol
1. IgG isolamento de amostras de pacientes
- Prepare mini-colunas de imunoadsorção preenchendo 3 ml anti-IgG Sepharose por paciente 2 ml de EDTA plasma em um vazio coluna Econo Pac. IgG isolamento requer, pelo menos, 2 ml de plasma do paciente.
- Colocar um filtro na parte superior da sefarose anti-IgG, cortou a ponta inferior da coluna e prima do filtro para atingir uma taxa de fluxo de cerca de 1 gota / seg. Deixe a solução de preservação correr para fora da coluna.
- Lavar a coluna com 3 volumes de NaCl a 0,9% por volume de plasma.
- Pipetar a plasma na coluna. Quando o plasma foi completamente imerso na sefarose anti-IgG, lava-se com o mesmo volume de NaCl 0,9%.
- Pipeta de volume de plasma de uma glicina 0,2 M de HCl, pH 2,8 na coluna e deixar o imergir em sefarose. Adicionar outra quantidade de glicina HCl na coluna. Recolher o fluxo através de um tubo de 15 ml e ajustar o pH para 7,3 com 0,5 M de Tris-HCl, pH 8,0.
- Para regenerar a coluna, Lava-se com 3 volumes de plasma glicina HCl. Após uma lavagem final com dois volumes de NaCl a 0,9%, a coluna pode ser utilizada para a amostra de plasma a seguir. Alternativamente, a coluna pode ser preenchida com uma solução de preservação e armazenado a 4-8 ° C durante até 4 semanas.
- Para utilização em cardiomiócitos, a fracção de IgG recolhido terá de ser dialisada contra tampão experimental (EB). Para a preparação de EB, adicionar 117 mM NaCl, 2,8 mM KCl, 0,6 mM MgCl2, 1,2 mM de KH 2 PO 4, 1,2 mM CaCl2, 10 mM de HEPES e 20 mM de glucose a 1 L de água destilada num agitador magnético e ajustar o pH para 7,3.
- Encher a fracção de IgG a um tubo de membrana de celulose de éster de diálise com um peso molecular de corte de 100 kDa. Colocar o tubo em 1 EB L e agitar lentamente com um agitador magnético, a 4 ° C. Depois de 8 horas, transferir o tubo de diálise em 3 L de EB fresco e dialisar para outro h 20 a 4 ° C.
- Seguindo calor diálise, a amostra durante 30 min a 57 ° C num banho de água a inactivatfactores do complemento e. Determinar a concentração de IgG total e se preparar alíquotas contendo 330 ug de IgG de cada. Quando a adição da amostra para a medição de cardiomiócitos (passo 4.3), enchem-se as alíquotas de 1 ml com EB. Alíquotas não diluídas podem ser armazenadas a -20 ° C até à sua utilização.
2. Isolamento de cardiomiócitos de ratos
- Para a preparação de Ca 2 + sem tampão de isolamento (IB), adicionar 110 mM NaCl, 2,6 mM KCl, 1,2 mM de MgSO4, 1,2 mM de KH 2 PO 4, 20 mM de HEPES e 11 mM de glucose a 1 L de água destilada, utilizando um campo magnético agitador. Ajustar o pH a 7,4 à temperatura ambiente e filtrar através de um filtro de 0,2 uM topo frasco para esterilização.
- Encher 80 ml de IB no reservatório superior de um sistema de controlo termostático Langendorff perfusão. Ajuste as configurações do termostato para manter uma temperatura de tampão de 37 ° C e arejar tampão com 95% de O2 / 5% de CO 2 durante 30 min.
- Pesar cerca de 10.000 - 12.000 U de collagenase tipo II, 175 mg de ácido gordo livre de BSA e dissolver em 20 ml contendo IB 22,5 ul de uma solução 100 mM de CaCl stock 2. Controlar o pH do tampão de isolamento no reservatório superior e ajustar se necessário.
- Anestesiar um rato Wistar de 175 - 200 g com 375 tiopental peso mg / kg de peso corporal. Adicionar 2500 UI de heparina à solução de tiopental. Após toracotomia do coração, a extirpar cuidadosamente com um arco aórtico intacta e transferi-lo para gelado de NaCl 0,9%. Limpar o coração a partir do sangue e do tecido circundante e da transferência de NaCl a 0,9% fresco. Expor a aorta, abra o redutor de fluxo do sistema de Langendorff para se obter uma velocidade de queda de 2-3/sec e anexar o coração à cânula.
- Perfundir o coração por até 3 min, com uma taxa de fluxo de 1 gota / segundo para lavar o sangue restante. Começam a circular as IB no sistema Langendorff. Remover 20 mL de tampão a partir do reservatório superior, preencher a solução de colagenase e de recarga como tampão tanto quanto necessário para atingir 80 ml. Circular o c solução ollagenase por outro 27 min. Taxa de fluxo deve ser controlado periodicamente e mantido a 1 gota / seg usando o redutor de fluxo.
- Retire o coração da cânula, limpa a partir de átrios e aorta e pique em pedaços pequenos. Permitir que a solução de colagenase a correr para o reservatório inferior, a reduzir o volume a um máximo de 40 ml e ainda mais digerir os ventrículos picados por 10 - 15 min sob arejamento contínuo com 95% O% 2/5 CO 2. Em seguida, filtrar a suspensão de células através de uma gaze de 200 ^ M de tamanho de malha para um tubo de 50 ml.
- Restabelecer o teor de Ca 2 + das células em 3 passos: centrifugar a suspensão de células a 43 xg durante 2 min à temperatura ambiente e Ressuspender as células em 10 ml IB contendo 200 ^ M de CaCl2. Centrifugar novamente e ressuspender as células em 10 ml de IB com 500 ^ M CaCl 2. Após uma centrifugação final, ressuspender em cardiomiócitos EB filtrada estéril (ver 1.8) a uma densidade de 50.000 células / ml.
- Brasão uma lamela 4 bem compartimentado com 10 mg por laminina bem e espere até que esteja completamente seco.
- Encha 1 ml da suspensão de cardiomiócitos em cada poço utilizando uma micropipeta com uma ponta de corte. Permitir que as células a aderir durante 1 hora à temperatura ambiente.
- Diluir 10 uL de 1 mg / ml de Fura-2:00 em solução de 5 ml de EB. Manter a solução de coloração no escuro.
- Tire tampão e solta células da lamela e pipeta 0,5 ml da solução de coloração em cada poço. Incubar as células durante 10 min sob agitação moderada. Subsequentemente, retire a solução de coloração, lavar as células uma vez com 1 ml de EB e, finalmente, encher EB 0,5 ml em cada poço. Evite luz direta durante o processo de coloração e sempre manter as células manchadas no escuro.
4. Gravação do Encurtamento celular e Ca 2 + Transients
- Coloque a lamela câmaras numa m fluorescência inversaicroscope cálcio ligado a um sistema de gravação de miócitos e contractilidade. Posicionar um eléctrodo feitos com um influxo e efluxo de tubo na primeira cavidade. Cardiomiócitos Superfuse com 1 EB ml / min e iniciar a estimulação eléctrica (20 V, 1 Hz, 5 ms de duração). Permitir que as células se adaptar à estimulação por cerca de 2 min.
- Escolha uma haste intacta forma de cardiomiócitos com estrias claras e contração constante. Posicionar a célula no centro do campo visual e abrir o canal da câmara. Orientar a célula horizontalmente dentro da área de vídeo através da rotação do adaptador enquadramento célula e mover a platina do microscópio.
- Ajuste a detecção de borda elementos de controle da área de vídeo (figura 2), abrir o canal de fluorescência e registro 10-15 contrações para obter a redução de células inicial e Ca 2 + transiente.
- Fechar o canal de luz do microscópio a fim de evitar o branqueamento do corante fluorescente. Comutar o fluxo através da EB para a amostracontornar com uma válvula de 3-vias e cardiomiócitos superfuse com 1 ml de IgG paciente. Parar a bomba antes do ar atingir o bem.
- Abrir o canal de luz e gravar outro 10-15 contrações para obter a resposta aguda de células. Pausar a gravação e fechar o canal de luz novamente. Repetir a gravação após 2 e 5 min.
- Retire o eletrodo do poço. Limpe cuidadosamente os tubos com EB e continuar com o bem próxima da lamela câmaras.
- Analisar o encurtamento celular e Ca 2 + transiente com o software IonWizard usando o "Edge-Length/Length" e "2-fura numérico subtraído / Ratio" janela, respectivamente. Calcula-se a percentagem de alteração a partir do encurtamento celular inicial e Ca 2 + transiente da altura do pico que se refere à linha de base (% de pico bl h) para a fase aguda, a 2 minutos e a resposta de 5 min.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dois exemplos para a medição do inotropismo celular no campo estimulado cardiomiócitos adultos (Figura 2), utilizando um dos miócitos Ca 2 + e do sistema de gravação de contratilidade são dadas abaixo. Figura 3 dá uma impressão de uma medida de controlo, enquanto que na Figura 4, o efeito dos anticorpos cardiodepressive de um paciente com DCM é mostrado.
Em ambos os exemplos, encurtamento celular inicial e Ca 2 + transitórios durante superfusão com EB exibem picos claros e constante, o que é um pré-requisito para a análise. Sabemos por experiência que as células que apresentam um pico inicial% bl h na faixa de 7 - terno 14% melhor para a nossa aplicação, enquanto cardiomiócitos, com maior ou menor contratilidade inicial tendem a apresentar alterações não provocados de encurtamento celular. Após a aplicação de IgG controle, isto é, IgG isolada de indivíduos saudáveis, inotropismo de cardiomiócitos permanece unchanged durante toda a medição (Figura 3A). Em contraste, a superfusão com IgG contendo os anticorpos cardiodepressive é seguido por um decréscimo de encurtamento celular (Figura 4A), acompanhada de redução de transientes de Ca 2 +, que é tipicamente menos pronunciado (Figura 4B). Nós normalmente observar que um novo estado de equilíbrio é estabelecido para ambas encurtamento da célula, e os transientes de Ca 2 +, 2 min após o qual é conservado até ao fim da medição, após 5 min. O exemplo dado mostra um efeito inotrópico negativo muito clara com uma diminuição do encurtamento das células em 54% e de transientes de Ca 2 + em 31%, após 5 min. No entanto, as mudanças são menos pronunciados. Por conseguinte, definiu-se um limite superior e inferior para inotropismo negativo e positivo na forma de média ± 2DP para IgG de controlo de um grupo de controlo saudável, para evitar resultados positivos falsos. Assim, as células só são considerados como positivos ou negativos inotrópico wmudanças de galinha de encurtamento célula exceder este limiar, o que foi determinado como sendo de aproximadamente ± 10%.
Figura 1. Fluxograma de detecção de auto-anticorpos, medindo a contractilidade dos cardiomiócitos. Primeiro, IgG é extraída a partir de amostras de pacientes, utilizando anti-IgG colunas Sepharose (em amarelo). Em segundo lugar, os cardiomiócitos são isoladas a partir de corações de rato por digestão enzimática e coradas com Fura-2 (destacado em azul). Finalmente, encurtamento celular e Ca 2 + transientes são monitoradas on-line usando um Cálcio miócitos e Sistema Contratilidade de gravação (em destaque na cor verde).
Figura 2. Cardiomiócitos isolados de ratos posicionada na área de vídeo do sistema de miócitos Contratilidade Gravação. O gráfico abaixo da célula apresenta os traçados de intensidade calculados utilizados para a detecção de borda. As setas indicam os elementos de detecção de borda de controle. Clique aqui para ver maior figura .
Figura 3. Exemplo representativo de uma medida de controlo. Encurtamento celular (A) e Ca 2 + transiente (B) foi monitorizada em linha antes (inicial), imediatamente (aguda), 2 min e 5 min depois de superfusão com IgG. Linhas vermelhas indicam a pausa da medição.
"Figura 4" fo: conteúdo largura = "4.5in" fo: src = "files/ftp_upload/4237/4237fig4highres.jpg /" />
Figura 4. Exemplo, medição de uma amostra de IgG contendo os anticorpos cardiodepressive. Encurtamento celular (A) e Ca 2 + transiente (B) foi medida on-line antes (inicial), imediatamente (aguda), 2 min e 5 min depois de superfusão com IgG. Linhas vermelhas indicam a pausa da medição.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
O método apresentado oferece um modo adequado, para detectar auto-anticorpos funcionalmente eficazes cardíacos em pacientes com DCM de origem incerta. Em comparação com os outros métodos, por exemplo, a detecção de anticorpos funcionais activos contra o β1-adrenérgico por seu impacto sobre os níveis de cAMP 6, o nosso método é independente de um epitopo específico. Claro que há outros epítopos ensaios independentes descritos na literatura, ou seja, a taxa de contagem de cardiomiócitos neonatais de bater 13, medindo correntes de cálcio em cardiomiócitos adultos pela técnica de patch clamp ou contractilidade das fibras de Purkinje isoladas 14. Em vantagem com estes métodos, o ensaio aqui apresentado é menos demorado e fornece objectividade aumentado devido ao protocolo padronizado. Além disso, ele permite detectar o impacto sobre a contractilidade e transientes de cálcio intracelular, ao mesmo tempo.
Similar ao otela em ensaios in vitro, os resultados obtidos com o método apresentado pode ser desafiado pelas condições artificiais aplicadas às células. Cultivadas cardiomiócitos de ratos neonatos foram relatados para anexar preferencialmente entre micropillars com uma distância de 30 um ou inferior do que em superfícies planas. Quando ligado a este último, as células foram encontrados para exibir as fibras de stress de actina e desordenadas miofibras 15. No entanto, o impacto potencial das fibras de stress no ensaio de contractilidade descrito aqui pode ser desprezável, visto cardiomiócitos adultos são apenas cultivadas por um período de tempo muito curto, de até 6 horas, que pode reduzir a formação de tais fibras e encurtamento da célula e Ca 2 + transiente são referidos a contractilidade inicial da respectiva célula de minimizar a influência de diferenças individuais entre as células. Outra limitação é a grande demanda de animais de experimentação e de tempo. Portanto, o método não é adequado para rastreio de alto rendimento de patientos.
Implementações adicionais são possíveis para o método. Devido ao antigénio-independência que pode ser aplicada a outras doenças cardiovasculares idiopática, em que um impacto autoimune é assumida.
Além disso, as medições da contractilidade pode ser facilmente ajustado para estudar os efeitos funcionais de outras substâncias. Isto permite a análise de um impacto potencial das drogas sobre o coração, que pode ser por exemplo benéfica no desenvolvimento de drogas e ensaios. Além dos parâmetros básicos fornecidos pelas mudanças de encurtamento celular e Ca 2 + a partir de linha de base, a informação adicional pode ser obtida a partir das medições que permite uma definição mais detalhada do efeito observado. Por exemplo, a velocidade de saída e de retorno pode ser calculado a partir dos eventos celulares de encurtamento que pode indicar um determinado sistólica e diastólica efeito de uma droga ou anticorpo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pela Transregio Sonderforschungsbereich 19 (SFB/TR19, C2) da Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), o Ministério Federal da Economia e Tecnologia projeto ZIM-KF 2727801MD0 e do Centro de Competência Inovação - respostas imunes humoral em Doenças Cardiovasculares ( ZIK CAMINHADA, BMBF FKZ 03Z2CN12) do Ministério Federal da Educação e Pesquisa, na Alemanha. Habitação e experimentos com animais foram realizados de acordo com as recomendações da Sociedade para Laboratory Animal Science (Gesellschaft für Versuchstierkunde, GV-SOLAS) e da Federação Europeia de Laboratório Animal Science Association (FELASA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunosorba preservation solution | Fresenius Medical Care | 903609211 | |
| Collagenase type 2 | Cell System | LS004176 | |
| BSA, fatty acid free | Sigma-Aldrich | A6003 | |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Fura-2 AM | Sigma-Aldrich | F0888 | 1 mg/ml in DMSO |
| Econo Pac Chromatography Columns | BioRad | 732-1010 | |
| Spectra/Por Biotech Cellulose Ester Dialysis Membrane | Spectrumlabs | 131417 | |
| 4 well Chambered Coverglass | Nunc | 155383 | |
| Myocyte Calcium and Contractility Recording System | IonOptix | ||
| IonWizard 6.0 analysis software | IonOptix |
References
- Roger, V. L., et al. Heart disease and stroke statistics--2011 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 123 (4), e18 (2011).
- Caforio, A. L., Vinci, A., Iliceto, S. Anti-heart autoantibodies in familial dilated cardiomyopathy. Autoimmunity. 41 (6), 462 (2008).
- Yoshikawa, T., Baba, A., Nagatomo, Y. Autoimmune mechanisms underlying dilated cardiomyopathy. Circ. J. 73 (4), 602 (2009).
- Felix, S. B., et al. Hemodynamic effects of immunoadsorption and subsequent immunoglobulin substitution in dilated cardiomyopathy: Three-month results from a randomized study. Journal of the American College of Cardiology. 35 (6), 1590 (2000).
- Staudt, A., et al. Role of immunoglobulin G3 subclass in dilated cardiomyopathy: results from protein A immunoadsorption. Am. Heart J. 150 (4), 729 (2005).
- Nikolaev, V. O., et al. A novel fluorescence method for the rapid detection of functional beta1-adrenergic receptor autoantibodies in heart failure. J. Am. Coll. Cardiol. 50 (5), 423 (2007).
- Jahns, R., et al. Autoantibodies activating human beta1-adrenergic receptors are associated with reduced cardiac function in chronic heart failure. Circulation. 99 (5), 649 (1999).
- Gocayne, J., et al. Primary structure of rat cardiac beta-adrenergic and muscarinic cholinergic receptors obtained by automated DNA sequence analysis: further evidence for a multigene family. Proceedings of the National Academy of Sciences. 84 (23), 8296 (1987).
- Jaenicke, T., et al. The complete sequence of the human beta-myosin heavy chain gene and a comparative analysis of its product. Genomics. 8 (2), 194 (1990).
- Piper, H. M. Cell Culture Techniques in Heart and Vessel Research. , Springer. Berlin, Heidelberg, New York. (1990).
- Kubin, T., et al. Microvascular endothelial cells remodel cultured adult cardiomyocytes and increase their survival. Am. J. Physiol. 276 (6 Pt. 2), H2179 (1999).
- Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J. Biol. Chem. 260 (6), 3440 (1985).
- Magnusson, Y., et al. Autoimmunity in idiopathic dilated cardiomyopathy. Characterization of antibodies against the beta 1-adrenoceptor with positive chronotropic effect. Circulation. 89 (6), 2760 (1994).
- Wakefield, I. D., et al. The application of in vitro methods to safety pharmacology. Fundam. Clin. Pharmacol. 16 (3), 209 (2002).
- Kajzar, A., et al. Toward physiological conditions for cell analyses: forces of heart muscle cells suspended between elastic micropillars. Biophys. J. 94 (5), 1854 (2008).
