Summary
여러 후보 생체의 높은 처리량 검증은 동결 / 해동 사이클을 최소화하고 귀중한 플라즈마 샘플을 사용하기 위해 순차적 엘리사에 의해 수행 할 수 있습니다. 여기, 우리는 순차적으로 여섯 가지 검증 플라즈마 생체에 대한 ELISAs을 수행하는 방법을 보여줍니다
Abstract
편견 발견 단백질 체학 전략은 임상 환경에서 진단 및 전조 테스트를 개선 할 수 있으며, 가이드 치료 개입에 도움이 될 수 있습니다 새로운 생체 많은 수의을 식별 할 수있는 가능성이 있습니다. 후보 단백질의 큰 번호가 식별되면, 이러한 급성 발병시와 같은 유한 볼륨, 이벤트 중심과 바꾸어 놓을 수없는 아르 환자 플라즈마 샘플에서 신속하고 효율적인 방식으로 후보 생체를 확인하기 어려울 수 있습니다 그래프트 - 대 - 호스트 질환 (GVHD), allogeneic 조혈 줄기 세포 이식 (HSCT)의 잠재적 생명을 위협하는 합병증.
최소화하기 위해 순차적 방식으로 IL-2Rα 5, TNFR1 6, HGF 7, IL-8 8 elafin 2, REG3α 3 (도 PAP1라고도 함) : 여기 여섯 확인 GVHD 단백질에 대한 상업적으로 이용 가능한 ELISAs을 수행하는 과정을 설명 동결 - 해동 사이클, 플라즈마 시간 및 플라즈마 사용을 해동. 최적의 연속 엘리사의 성능을 촉진하기 사소한 조정으로 제조업체 엘리사 키트 및 프로토콜을 사용하여 저희 연구실 년에 설립 된로 샘플 희석 요인에 의해 결정이 절차를 들면 우리는 순서대로 ELISAs을 수행합니다. 그 결과 플라즈마 biomarker 농도 그런 다음 컴파일하고 환자 일대에서 상당한 결과를 분석 할 수 있습니다. 이러한 생체는 연구 목적으로 현재 있지만, 임상 치료에의 설립은 현재 임상 시험에서 조사되고있다.
이 기술은 (들)은 다른 시약과 혼합 할 필요가 없습니다 샘플을 제공 같은 샘플에서 여러 단백질 / 관심 크린 시토 킨에 대한 ELISAs을 수행하기 위해 적용 할 수 있습니다. 엘리사 키트는 사전 코팅 플레이트, 96도 반 잘 플레이트 또는 384 잘 접시와 함께 제공되지 않을 경우 자세한 샘플 / 시약의 사용을 최소화하는 데 사용할 수 있습니다.
Introduction
급성 이식 - 대 - 호스트 질환 (GVHD), allogeneic 조혈 줄기 세포 이식 (HSCT) 후 비 재발 사망률 (NRM)의 주요 원인은 3 장기 시스템의 장애에 의해 측정된다 : 피부, 간, 위장 (GI) 기관 4. 급성 GVHD는 일반적으로 두 사람 사이와 팔주 이식 후 발생하지만 나중에 발생할 수 있으며, 종종 조절 처방 독성, 감염이나 약물의 부작용 등의 사후 HSCT 합병증의 임상 구분할 수 있습니다. 연속 엘리사를 사용하여 proteomic 전략과 높은 처리량 검증의 사용을 통해, 우리는 누구의 농도 GVHD의 임상 발현의 발병에 수치가 올라 6 단백질을 확인했습니다. 4 biomarker 패널로 결합 IL-2Rα, TNFR1, HGF와 IL-8은 임상 증상의 발병에 GVHD 진단 할 수 있으며 독립적으로 GVHD 심각도 1 포스트 HSCT 생존을 예측할 수 있습니다. Elafin, SK의 GVHD를위한 biomarker에서, 약물 폭발과 같은 다른 원인에서 GVHD 발진과 발진을 구별 할 수 있으며 이식 생존 2 예측할 수 있습니다. 우리는 최근에 낮은 위장관의 GVHD의 biomarker로 REG3α 확인했습니다, 표적 장기는 대부분의 NRM과 관련된. 플라즈마 REG3α 농도가 안정적 후 HSCT 설사의 원인으로 GVHD 파악하고 진단 장 biopsies에 GVHD의 histologic 정도 상관 관계를 할 수 있습니다. GI GVHD의 발병에 REG3α 농도는 GVHD 치료와 NRM 3 응답을 예측 할 수 있습니다. 임상 치료에 이러한 검증 GVHD 생체의 결합은 현재 임상 시험에서 조사되고있다.
이 실험은 바꾸어 놓을 수없는 제한된 수량의 아르 GVHD 발병시 2000 년과 2010 사이에 HSCT를받은 환자에서 수집 한 작은 플라즈마 aliquots에서 수행되었다. 이 샘플의 고귀한 특성으로 인해, 우리는 만난을 개발했습니다초과 동결 - 해동 사이클, 해동 시간과 플라즈마의 사용을 제거 할 수있는 효율적 재현 방식으로 여러 혈장 단백질의 농도를 측정 석탄 통. 이 기술은 (들)은 다른 시약과 혼합 할 필요가 없습니다 샘플을 제공 같은 샘플에서 여러 단백질 / 관심 크린 시토 킨에 대한 ELISAs을 수행하기 위해 적용 할 수 있습니다. 엘리사 키트는 사전 코팅 플레이트, 96도 반 잘 플레이트 또는 384 잘 접시와 함께 제공되지 않을 경우 자세한 샘플 / 시약의 사용을 최소화하는 데 사용할 수 있습니다. 이 원고는 GVHD 생체 측정의 기술적 측면에 초점을 맞추고 있습니다.
Protocol
1. 실험 일 0 : IL-2Rα, REG3α과 HGF에 대한 캡처 항체와 샘플 준비 및 엘리사 테스트 플레이트 코팅
- 분석 할 플라즈마 나누어지는 샘플은 해동과 플라즈마의 상단에있는 아래쪽과 지질의 혈전을 분리하는 10 분에 12,000 rpm으로 불렀고, 당겨 될 것입니다. undiluted 플라즈마의 150 μl는 미리 정의 된지도에 따라 수동으로 pipetting하여 (소스 판) 96 - 웰 V-바닥 판에 각 샘플에서 도금 될 것입니다. aliquots는 parafilm으로 포장 전체 과정에서 4 ° C에서 습한 챔버에 보관되며 더 이상보다 72 시간.
- IL-2Rα 및 HGF 캡처 항체는 재구성 및 제조업체 사양 및 50 μl 당 희석 한 후 밀봉과 4에서 하룻밤 incubated 아르 각각 96도 높은 구속력을 반 잘 플레이트의 각 잘 ° C.에 도금 할 수 또한, 많은 플레이트는 37 ° C에서 건조 ° C 나중에 사용하기 위해, 의존 4에 저장할 수 있습니다단백질의 안정성에 들죠.
- REG3α 캡처 항체 그런 다음 밀봉과 4에서 하룻밤 incubated하는 384 잘 Nunc 맥시 - Sorp 판의 각 잘 ° C.에 도금 될 것 제조업체 코팅 버퍼 25 μl를 사용하여 제조업체 프로토콜에 따라 희석 될 것입니다
2. 실험 1 일 : IL-2Rα 엘리사 (그림 1)
- IL-2Rα 테스트 판은 세척 TBS에서 곤드레 만드레 취한로 차단하고, 표준 재구성되어 8 포인트 표준 곡선은 제조업체 프로토콜에 따라 준비가되어 있습니다.
- 차단 단계에 따라 판을 세척 한 후, undiluted 플라즈마의 50 μl는 소스 판에서 엘리사 테스트 판에 중복으로 도금되어 있으며 각 표준의 50 μl가 중복으로 도금되어 있습니다. 판 300 rpm으로 설정 판 회선 근에 밀봉하고 상온에서 2 시간에 incubated 수 있습니다.
- 플라즈마는 IL-2Rα 엘리사 시험 접시에서 복원 및 해제에 다시 배치됩니다플라즈마 소스 판을 희석. 엘리사는 제조업체 프로토콜 (반 잘 접시에 따라 조정 볼륨) 및 450-570 nm의에 판 리더 집합을 사용하여 읽을 수 각도의 광학 밀도에 따라 완료하고, 데이터를 저장하고 분석합니다.
3. 실험 1 일 : REG3α 엘리사 (그림 1)
- undiluted 플라즈마의 10 μl는 별도의 V-아래 소스 판로 전송됩니다. 제조업체에서 제공 희석 버퍼의 90 μl은 1시 10분 희석 소스 판을 만드는 각 잘에 추가됩니다.
- REG3α 엘리사는 제조업체 프로토콜에 따라 수행됩니다 (볼륨 384 잘 접시에 따라 조정)과 각도의 광학 밀도는 450-620 nm의로 설정 접시 리더를 사용하여 읽을 수되며, 데이터 저장 및 분석 할 수 있습니다.
4. 실험 1 일 : Elafin 및 캡처 항체와 TNFR1 테스트 플레이트 코팅
- Elafin 및 TNFR1 캡처 항체는 재구성 및 dil 될 것입니다제조업체 사양 및 50 μl 당 uted 후 봉인하고 Elafin 동안 실온에서 하룻밤 incubated 아르 각각 96도 높은 구속력을 반 잘 플레이트의 각 잘에 도금 및 ° C 4에 TNFR1에 대한 것입니다.
5. 실험 일 1-2 : HGF 엘리사 (그림 1)
- IL-2Rα 엘리사를 완료하고 시험을 보장 한 후 반복 할 필요가 없습니다, undiluted 플라즈마의 60 μl는 새로운 소스 판에 전송하고 다음 1 개 PBS에 1 % BSA의 60 μl은을 각 잘에 추가됩니다 1시 2분 희석 플라즈마 소스 판.
- HGF 테스트 판은 세척 TBS에서 곤드레 만드레 취한로 차단하고, 표준 재구성되어 8 포인트 표준 곡선은 제조업체 프로토콜에 따라 준비가되어 있습니다.
- 차단 단계에 따라 판을 세척 한 후, 1시 2분 희석 플라즈마의 50 μl은 엘리사 테스트 판에 중복으로 도금되어 있으며 각 표준의 50 μl가 중복으로 도금되어 있습니다. 플레이트는 봉인되고300 RPM으로 설정 판 회선 근에 실온에서 하룻밤 incubated.
- 1시 2분 희석 플라즈마는 HGF 엘리사 테스트 판에서 복원하고 1시 2분 희석 플라즈마 소스 판에 다시 배치됩니다. 엘리사는 제조업체 프로토콜 (반 잘 접시에 따라 조정 볼륨) 및 450-570 nm의에 판 리더 집합을 사용하여 읽을 수 각도의 광학 밀도에 따라 완료하고, 데이터를 저장하고 분석합니다.
6. 실험 2 일 : Elafin 엘리사
- undiluted 플라즈마의 10 μl는 새로운 소스 판으로 전송됩니다 후 1 개 PBS에 1 % BSA의 190 μl는 플라즈마 dluted 1시 20분 200 μl를 각 잘에 추가됩니다.
- Elafin 엘리사는 450-570 nm의로 설정 접시 리더를 사용하여 읽을 수 제조업체 프로토콜 (볼륨이있는 반 잘 접시에 따라 조정), 그리고 각도의 광학 밀도에 따라 수행하고, 데이터를 저장하고 분석했다.
7. 실험 다Y 2 : TNFR1 엘리사
- PBS에 1 % BSA의 25 μl가 1시 25분 희석 플라즈마의 125 μl를 얻을 수 1시 20분 소스 판 (현재 1시 20분 플라즈마의 100 μl를 포함)에 추가됩니다.
- TNFR1 엘리사는 제조업체 프로토콜에 따라 완료 (반 잘 접시에 따라 조정 볼륨 포함)과 각도의 광학 밀도는 450-570 nm의로 설정 접시 리더를 사용하여 읽을 수 있으며, 데이터 저장 및 분석.
8. 실험 2 일 : IL-8 엘리사
- 1시 2분 희석 플라즈마의 60 μl는 새로운 소스 판에 전송하고 다음 IL-8 희석제 180 μl은 1시 6분 희석 플라즈마 소스 판을 각 잘에 추가됩니다.
- IL-8은 엘리사는 제조업체 프로토콜에 따라 완료 (반 잘 접시에 따라 조정 볼륨 포함)과 각도의 광학 밀도가 450-570 nm의로 설정 접시 리더를 사용하여 읽을 수되며, 데이터 저장 및 분석.
모든 ELISAs은 unuse에게 완료되면D 주식 플라즈마 해동 aliquots로 대체하고 나중에 사용하기 위해 냉동 될 것입니다.
Representative Results
biomarker의 워크 플로우 및 타임 라인은 각각 표 1과 표 2에 자세히 설명되어 있습니다. 일단, 완료 6 개의 단백질의 농도는 이제 플라즈마의 150 μL의 총을 사용하여 동일한 플라즈마 샘플을 계량되었습니다. 시험 당 중복에 샘플을 도금은 CV의 10 % 이하가 최적이되면, 내부 품질 보증 할 수 있습니다. 여러 접시, 높은 수준의 일관성 광학 밀도에 순차적 엘리사를 수행하는 것은 선호 및 측정의 개선 간 판의 신뢰성을 허용하는 경우, 표준 곡선 약물 과용이라면서은 엘리사 성능 불일치 (그림 2)에 대한 평가보고 판 사이에 비교할 수 있습니다. tetramethylbenzidine colorimetric 기판과 높은 농도 약물 과용이라면서을 사용하여 개발 시간이 저희 연구실의 각 biomarker에 대한 관찰은 표 3에 나열되어 있습니다.
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그림 1. IL-2Rα, REG3α 및 HGF ELISAs를위한 워크 플로우. 플라즈마 샘플은 IL-2Rα 엘리사 테스트 판에 도금 한 후 다른 ELISAs에 희석 소스 접시를 만들기 위해 복원합니다. HGF 엘리사를 들어, 플라즈마 IL-8의 1시 6분 희석 판을 준비하는 복원합니다. 큰 그림을 보시려면 여기를 클릭하세요 .
그림 2. 초기 REG3α GI GVHD의 biomarker 보고서 3 테스트 1084 환자에 해당하는 REG3α 농도를 측정하는 7 개의 엘리사 플레이트의 표준 곡선에 대한 광학 밀도. 플레이트들 사이 일관된 약물 과용이라면서은 플레이트들 사이 일관성있는 단백질 농도 측정을 보장합니다. 단백질의 농도플라즈마에서 샘플은 표준 곡선 광학 밀도에 샘플 광학 밀도를 비교하여 계산됩니다.
| 실험의 날 0 | 1. 샘플을 준비 |
| 2. IL-2Rα, HGF와 REG3α 캡처 AB | |
| 실험 1 일 | 1. IL-2RαELISA |
| 2. REG3αELISA | |
| 3. HGF 엘리사 (샘플 도금을 통해) | |
| 4. Elafin와 TNFR 캡처 AB | |
| 실험 2 일 | 1. HGF 엘리사 완료 |
| 2. Elafin 엘리사 | |
| 3. TNFR1 엘리사 | |
| 4. IL-8 엘리사 | |
| 5. 사용하지 않은 얼혈장 |
표 1. GVHD의 Biomarker 워크 플로우 개요
| 일 0 | 샘플 준비 및 야간 캡처 몸 보육 | ||||||
| 엘리사 | IL-2Rα | REG3α | HGF | Elafin | TNFR1 | IL-8 | |
| 시간 (시간) | 0.0 | 블로킹 | |||||
| 1.0 | 도금 샘플 | <TD> | |||||
| 3.0 | 감지 AB, 플라즈마 샘플을 복원 | 차단, 준비 '샘플 (1시 10분 희석) | |||||
| 4.0 | 도금 샘플 (1시 10분) | ||||||
| 5.0 | Streptavidin-HRP | 감지 AB | |||||
| 5.5 | TMB | Streptavidin-HRP | |||||
| 6.0 | 판 읽기 | TMB | 차단, 준비 '샘플 (1시 2분 희석) | ||||
| 6.5 | 판 읽기 | ||||||
| 7.0 | 도금 샘플 (1시 2분) | AB을 (하룻밤 배양) 캡쳐 | AB을 (하룻밤 배양) 캡쳐 | ||||
| 2 일 | |||||||
| 시간 (시간) | 0.0 | 플라즈마, 감지 AB를 복원 | 차단, 준비 '샘플 (1시 20분) | ||||
| 1.0 | 샘플 도금 (1시 2분) | 차단, 1시 20분 샘플 더 희석을 1시 25분 희석에 | |||||
| 2.0 | HRP | 샘플 도금 (1시 25분) | |||||
| 2.5 | TMB | ||||||
| 3.0 | 판 읽기 | 감지 AB | |||||
| 3.5 | 샘플 (1시 6분 희석)를 준비 | ||||||
| 4.0 | 감지 AB | 샘플 도금 (1시 6분) | |||||
| 5.0 | HRP | ||||||
| 5.5 | TMB | ||||||
| 6.0 | 판 읽기 HRP | 감지 AB | |||||
| TMB | |||||||
| 7.0 | 판 읽기 | TMB | |||||
| 7.5 | 판 읽기 | ||||||
| 완료 후 | aliquots에 소스 플라즈마를 교체하고 나중에 사용하기 위해 냉동 | ||||||
표 2. ELISAs을 수행하기위한 타임 라인.
| 플라즈마 희석 계수 | 높은 표준 농도 | 기판 개발 시간 (분) | 높은 OD | 곡선 | |
| IL-2Rα | 1시 1분 | 2000 PG / ML | 5 | 1 | 선의 |
| HGF | 1시 2분 | 4000 PG / ML | 22 | 2.1 | 4 매개 변수 |
| IL-8 | 1시 6분 | 200 PG / ML | 12 | 2.7 | 4 매개 변수 |
| REG3α | 1시 10분 | 100 NG / ML | 12 | 1.7 | 4 매개 변수 |
| Elafin | 1시 20분 | 2000 PG / ML | 20 | 1.9 | 4 매개 변수 |
| TNFR1 | 1시 25분 | 800 PG / ML | 8 | 2.7 | 선의 |
6 GVHD 생체에 대한 표 3. 엘리사 세부 정보.
Discussion
여기에 제시된 순서 엘리사 방법은 마우스 9,10에서 얻은 희귀 한 질병 또는 플라즈마 샘플과 인간의 과목에서 샘플로 바꾸어 놓을 수없는 취득 및 / 또는하기 어려울 수도 플라즈마의 작은 볼륨에 여러 혈장 단백질의 측정 할 수 있습니다. 연속 ELISAs는 일반적으로 필요로하는 ELISAs으로 증가 플라즈마 희석 계수의 순서로 수행 플라즈마 희석 ≥ 일반적으로 원하는 경우이 작업을 수행 할 수 있지만, 복원 할 필요가 없습니다 1시 10분 않고 있습니다. 연속 엘리사을 수행 할 수있는 능력은 플라즈마 다른 시약과 혼합되어 있거나하는 다른 희석 버퍼가 플라즈마에 필요한되는 엘리사 키트 / 프로토콜에 의해 제한되며이 다시 사용할 수있는 샘플로 인해 해당 호환되지 않는 문제에 ablility을 precludes 버퍼 / 시약은 특정 테스트의 성능에 영향을 것입니다. 신중한 계획을 통해 10 명 이상 ELISAs은 같은 플라즈마 샘플에서 수행 할 수 있습니다.
다닐 "> 개인 실험실 시험 과목에서 샘플에 대한 관심의 단백질의 예상 플라즈마 농도에 따라 interpretable 결과를하기 위해 플라즈마 dilutions을 조정해야 할 수도 있습니다. 실험실 장비의 차이는 부화와 colorimetric 개발을 최적화 할 필요가 될 수 있습니다 시간, 세차의 수 및 / 또는 세탁은 특정 엘리사을 최적화하기 위해 시간을 즐겨보십시오.높은 처리량 용량과 정확성을 향상하고 비용 효율적인 방식으로 분석을 수행하기 위해 384 잘 접시에 분석 및 스태킹 장치와 자동 플레이트 와셔 할 수있는 로봇 액체 처리 플랫폼의 사용을 권장합니다. 이 장비는 여러 사용자에 의해 수행 분석의 정확성과 정밀도를 향상, 간 및 간 분석 편차를 줄이기 위해 분석의 일관성을 제공하는 데 도움이됩니다.
1)의 대부분을 : 우리는 두 가지 이유에 사용할 멀티 플랫폼을 통해 순차적 엘리사를 사용소설 단백질에 대한 항체 쌍 쉽게 구슬 또는 기타 자료에 복합뿐만 아니라 시간이 많이 걸릴 비싼 수 없습니다, 2) 각 엘리사의 assays 간 반응성 11 부재에 보조 멀티 플렉스 microarray 또는 구슬,보다 더 정확한 있습니다. 신뢰할 수있는 방법은 멀티 플렉스, 구슬 기반 microarrays를 수행하기 위해 설립되어있는 경우,이 순서 엘리사 과정을 대체 할 수 수 있지만, 구슬 및 /에 항체를 결합한 할 수있는 능력이나 할 원하는 단백질의 수에 의해 제한 될 수 있습니다 분석했다.
Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
NIH 보조금 RC1-HL-101102, P01-CA039542, T32-HL007622, Hartwell 재단, 그리고 도리스 듀크 자선 재단 지원. 박사 Paczesny은 에릭 Hartwell 기금과 에이미 Strelzer Manasevit 연구 프로그램의 수사관이다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Human IL-2 R alpha Duoset | R&D Systems | DY223 | |
| Human HGF Duoset | R&D Systems | DY294 | |
| Human IL-8 OptEIA KIT II | Becton Dickinson | 550999 | |
| Ab-Match ASSEMBLY Human PAP1 (REG3α) Kit | MBL International | 5323 | |
| Ab-Match UNIVERSAL Kit | MBL International | 5310 | |
| Human sTNFRI/TNFRSF1A Duoset | R&D Systems | DY225 | |
| Human Trappin-2/Elafin Duoset | R&D Systems | DY1747 | |
| 96-well polystyrene conical bottom plates | Thermo Scientific | 249570 | Used for plasma source plates |
| Costar half-well high-binding 96-well plates | Corning | 3690 | For IL-2Rα, HGF, TNFR1 and elafin ELISAs |
| Nunc 384-well MaxiSorp plates | Nunc | 464718 | For REG3α Elisa |
| HyClone Phosphate Buffered Saline, 1x | Thermo Scientific | SH30256.02 | |
| Bovine Serum Albumin, Fraction V, Heat Shock Treated | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
| Blocker BLOTTO in TBS | Thermo Scientific | 37530 | Blocking agent for IL-2Rα HGF and TNFR1 ELISAs |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 21600-069 | Wash buffer for IL-2Rα, HGF, Elafin and TNFR1 ELISAs |
| TMB Peroxide Susbtrate | Kirkegaard and Perry Laboratories | 50-76-00 | |
| Tween 20 | Acros Organics | 233362500 | Wash buffer for IL-2Rα, HGF, Elafin and TNFR1 ELISAs |
| Sulfuric Acid | Sigma-Aldrich | 84720 | (Diluted to 2N) for stop solution |
References
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- Paczesny, S. Elafin is a biomarker of graft-versus-host disease of the skin. Science Translational Medicine. 2, 13ra12 (2010).
- Ferrara, J. L. Regenerating islet-derived 3 alpha is a biomarker of gastrointestinal graft-versus-host disease. Blood. , (2011).
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- Holler, E. Role of tumor necrosis factor alpha in acute graft-versus-host disease and complications following allogeneic bone marrow transplantation. Transplant. Proc. 25, 1234-1236 (1993).
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