Cirkulerande tumörceller isolerades från blodet från patienter med cancer utan att vålla cellulär skada. Isolering av tumörceller åstadkommes med användning av en bimolekylär yta av E-selektin i tillägg till antikroppar mot epiteliala markörer. En nanotube beläggning gynnar speciellt vidhäftning cancercell resulterar i höga fånga renheter.
Cirkulerande tumörceller (CTC) är celler som sprider från en primär tumör i hela det cirkulatoriska systemet och som kan slutligen bilda sekundära tumörer på avlägsna ställen. CTC räkna kan användas för att följa sjukdomens progression baserat på korrelationen mellan CTC koncentrationen i blodet och sjukdomens svårighetsgrad 1. Som en behandling verktyg, skulle CTC studeras i laboratorium för att utveckla personliga behandlingar. För detta ändamål måste CTC isolering orsakar någon cellulär skada och kontamination av andra celltyper, speciellt leukocyter, måste undvikas så mycket som möjligt 2. Många av de nuvarande tekniker, inklusive den enda FDA-godkända enhet för CTC räkning, förstöra CTC som en del av isoleringen processen (för mer information se ref. 2). En mikrofluidikanordning att fånga livskraftig CTC beskrivs, som består av en yta funktionaliserad med E-selektin glykoprotein förutom antikroppar mot epiteliala markörer 3. För att öka enhetens prestandaMance en nanopartikel applicerades bestående av halloysite nanorör, en aluminiumsilikat nanopartiklar skördas från lera 4. De E-selektinmolekyler vara ett sätt att fånga snabbrörliga CTC som pumpas genom enheten, låna en fördel jämfört med alternativa mikroflödessystem enheter där längre handläggningstider är nödvändiga för att målceller tillräckligt med tid att interagera med en yta. De antikroppar mot epitelceller mål ger CTC-specificitet till enheten, samt ge en lätt justerbar parameter för att ställa isolering. Slutligen tillåter halloysite nanotube beläggningen avsevärt förbättrad isolering i förhållande till andra tekniker genom att hjälpa att fånga snabbrörliga celler, vilket ger ökad yta för protein adsorption, och avvärja kontaminerande leukocyter 3,4. Denna anordning tillverkas genom en enkel teknik med användning off-the-shelf material, och har med framgång använts för att fånga cancerceller från blod av metastatiskcancerpatienter. Infångade cellerna bibehålls under upp till 15 dagar i odling efter isolering, och dessa prover består typiskt av> 50% viabla primära cancerceller från varje patient. Denna enhet har använts för att fånga livskraftig CTC från både utspätt helblod och buffy prover päls. I slutändan presenterar vi en teknik med funktionalitet i en klinisk miljö för att utveckla personliga cancerbehandlingar.
Det är ofta så att de tidiga stegen i upptäckten av nya cancer läkemedel använda cancer cellinjer, som bär tveksamt likhet med primära cancerceller men fortsätta att användas på grund av sin användarvänlighet i laboratoriet. Forskning om utveckling av nya cancerbehandlingar skulle påskyndas om primära humana cancerceller utnyttjades tidigt i romanen forskningen. CTC är den mest lättillgängliga typen av cancer cell, beroende på deras förekomst i blod och hur lätt en vanlig blodprovstagning. Dessutom cirkulerande tumörceller representerar ett nödvändigt steg i processen för metastas 5,6, så deras relevans för sjukdomen och användbarhet för målinriktning nya läkemedel är tydlig. Isolering av CTC från blod in vitro kompliceras av deras låga koncentrationer: på i storleksordningen en per miljoner leukocyter eller en per miljard erytrocyter 7. De flesta av dagens metoder för att detektera CTC i blod, bland annat den enda FDA-godkända tekniken Cell Sökning (Veridex), skada eller förstöra celler i identifieringsprocessen, utesluter användning utöver uppräkning. Den ovan beskrivna metoden inte äventyrar cellviabiliteten och därmed öppnar dörren för framtida klinisk forskning om cancer. Eller indrivning av intakta celler är målet med denna teknik är det absolut nödvändigt att celler hanteras varsamt, speciellt under stegen blodseparation.
Det finns ett antal inställbara parametrar i detta system som skulle kunna förändras för att uppnå förbättrat utbyte beroende på kritiska egenskaper såsom cancer typ. I de steg som beskrivs ovan, hade vi valt att använda EpCAM som CTC-specifik antikropp för alla cancertyper, utom vid behandling av prostatacancer prover, där anti-PSMA användes. Ytterligare substitutioner av cancer-specifika antikroppar kan säkert användas för att förbättra prestanda för enskilda patienter. Dessutom kan selektin och antikropp koncentrationer ändras för att förbättra capture 8.
"> Ett väsentligt särdrag hos anordningen är införlivandet av E-selektin-molekyler på ytan. E-selektin uttrycks normalt på den luminala ytan av endotelceller och fungerar så att rekrytera snabbrörliga leukocyter till inflammationssäten. Flytande leukocyter binda transient till selektinmolekyler, vilket resulterar i en långsammare, rullande beteende som underlättar långsammare och starkare bindning av cellen till endotelet med integriner. Övertygande experimentella bevis finns som gör så att CTC kan extravasera genom en liknande mekanism 9,10. Införandet av selektin också gör att enheten kan användas vid högre flödeshastigheter, priser som annars skulle hindra celler från att binda till antikroppar 11. Således vår enhet härmar fysiologiskt ett venolen att biomimetically fånga strömmande CTC utan att tillfoga cellulär skada.Förbättrad enhetens prestanda kan hänföras till tillsättning av halloysite nanorör beläggningen till luminalytanav anordningen. Tidigare studier har visat att det finns tre viktiga komponenter i nanoröret beläggning som medger förbättrad funktionalitet. Först ger nanotube beläggningen ökat yta, som medger större protein avlagring på ytan 4. Andra, vid utförande av atomkraftsmikroskopi på nanoröret beläggningen har vi bestämt att individuella nanorör skjuta ut från ytan in i flödet. Detta tillåter selektinmolekyler att presenteras så mycket som en mikron ovanför ytan så att celler kan fångas och rekryteras till ytan tidigare i deras bana genom röret 4. Slutligen är halloysit nanorör beläggningen kan förhindra leukocytadhesion och sprids på ytan, vilket möjliggör ett reducerat antal leukocyter infångade tillsammans med CTC och därför större följande CTC renheter 3.
The authors have nothing to disclose.
Det arbete som beskrivs stöddes av Cornell Center på mikromiljön & Metastas via Award nummer U54CA143876 från National Cancer Institute. Innehållet är endast ansvar författarnas egna och inte nödvändigtvis officiella ståndpunkter National Cancer Institute och National Institutes of Health. Detta arbete ytterligare finansierades delvis av en National Science Foundation Graduate Research Fellowship (ADH).
Name of reagent | Company | Catalog Number |
300 um ID tubing | Braintree Scientific | MRE025 |
Larger tubing for connection to syringe | IDEX Health & Science | 1507L |
5mL syringe for pump | BD | 309603 |
Connector small to large tubing | IDEX Health & Science | P-770 |
Connector large tubing to syringe | IDEX Health & Science | F-120 and P-659 |
Syringe for microtube (3/10cc Insulin Syringe U-100 29G 1/2′) | BD | 309301 |
Accutase | MP Biomedicals LLC | 1000449 |
Ficol-Paque Plus | GE Healthcare Bio-Sciences AB | 17-1440-03 |
RBC Lysis Buffer (Buffer EL, 1000mL) | Qiagen | 1014614 |
Protein G, 5 mg | CalBiochem (calbiochem.com) | 539303 |
Human EpCAM/TROP-1 Antibody | R&D Systems | MAB960 |
PSMA Antibody (GCP-04) | abcam | ab66911 |
96 well plates (Microtest 96) | BD Falcon | 35-3072 |
Blotting Grade Blocker Non-Fat Dry Milk, 300g | Bio-Rad Laboratories | 216005508 |
Halloysite Nanotubes | NaturalNano | NN-HNT200 |
Calcium Carbonate, 5g | Aldrich Chemistry | 481807 |
rhE-Selectin/Fc Chimera, 100 ug | R&D Systems | 724-ES |
RPMI Medium 1640 | Gibco | 22400-089 |
DPBS | Gibco | 14190-095 |
Poly-L lysine 0.1% w/v in water | Sigma-Aldrich | P8920-100ML |
Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | Model 100 |
Fetal Bovine Serum | Atlanta Biochemicals | S11056H |
Penicillin Streptomycin | Sigma Life Siiences | P0781 |