Summary
癌症患者的血液循环肿瘤细胞的分离，而造成细胞损伤。肿瘤细胞的分离，实现使用的E-选择双分子表面，除了对上皮标记的抗体。碳纳米管涂层，特别是促进癌细胞粘附造成捕获纯度高。
Abstract
循环肿瘤细胞（CTC）的传播从整个循环系统的原发肿瘤的细胞，可以最终形成二次肿瘤，在遥远的地方。 CTC数量可以用来追踪病情恶化的基础上，四氯化碳浓度之间的相关血液和疾病的严重程度1。作为一种治疗工具，CTC可以研究在实验室中，制定个性化治疗。为此，反恐委员会的隔离必须不会引起细胞损伤，与其他类型的细胞，尤其是白细胞的污染，必须避免尽可能多尽可能2。许多目前的技术，包括唯一获得FDA批准用于反恐枚举设备，破坏隔离进程的一部分CTC（更多信息请参见参考文献2）。一个微流体装置，捕捉可行的反恐委员会介绍，除了对3上皮标记的抗体与E-选择素糖蛋白功能表面组成。为了提高设备perfor曼斯纳米粒子涂层组成的埃洛石纳米管，铝纳米粘土4收获。 E-选择素分子提供了一种手段来捕捉快速移动的反恐委员会通过泵装置，贷款比替代微流体器件的优势，其中较长的处理时间是必要的，以提供足够的时间与表面相互作用的靶细胞。上皮目标的抗体提供反恐特异性设备，以及提供一个现成的可调参数来调整隔离。最后，埃洛石纳米管涂层可显着增强的隔离相比其他技术，以帮助捕捉快速移动的细胞，提供蛋白质的吸附表面积增加，并击退污染白细胞3,4。该装置是由一个简单的技术使用的现成材料，并已成功地用于捕捉癌细胞从血液转移癌症患者。捕获细胞维持至15天的文化隔离后，这些样品通常> 50％可行的每个病人的原发肿瘤细胞组成。此设备已被用于捕捉可行的四氯化碳稀释的全血和白膜样品。最终，我们提出在临床上的功能来开发个性化的癌症治疗技术。
Protocol
下面的协议是一个单一的微管设备的生产。
1。埃洛石纳米管溶液的制备
- 超声粉碎（10-13 W（RMS））250μL，埃洛石纳米管溶液（6.6 wt％的水）30秒。用冷水重复超声一次冷静的解决方案。降温再次。
- 绘制到一个注射器超声波处理解决方案，将用0.45μm注射器过滤器，过滤成干净的离心管的解决方案。涡的解决方案偶尔保持同质。
2。埃洛石纳米管与微管内表面涂层
- 获得50厘米长的路段（300微米内径35.3μL积）微Renathane microtubing的。在对角线切割微管的一端插入小艺达思适配器一块。 29G的3/10毫升注射器针头插入另一端的微管。
- 要清理的微管，放置微管的开口端（结束适配器）到70％的乙醇和抽奖〜50μL注射器进入乙醇来填补微管。
- 乙醇冲洗出来的微管抽入注射器大方量的蒸馏水。
- 脱离微管的注射器，注射器清空，然后重新连接到微管。
- 准备一个0.02％W / V聚L赖氨酸在水中的解决方案。成微管吸取50微升，并允许在室温（RT）5分钟坐。
- 微管吸引到100μL的过滤碳纳米管的解决方案，允许3分钟在室温下孵育。
- 冲洗出来的碳纳米管溶液通过微管吸取100μL水。允许涂层微管坐，装满水，在室温下过夜。
3。微管细胞分离制备
- 准备解决的10微克/毫升杜尔贝科1X的磷酸盐G蛋白缓冲液（PBS，pH值7.0 - 7.2）。通过微管绘制为50μLPBS和然后吸取50μL的蛋白-G的解决方案，并允许在室温下为1.5小时孵化。
- 含5μg/ mL的E - 选择素IgG和50μg/ ml的抗体（抗-EpCAM的大多数癌症样本，抗PSMA的前列腺癌样本）在PBS准备的解决方案。吸引到了微管的E-选择素和抗体溶液50μL，并允许在室温下为2小时孵化。
- 非特异性细胞粘附与5％的牛奶蛋白被封锁。准备一个5％（W / V）牛奶蛋白在PBS的解决方案。微管吸引到50μL牛奶蛋白解决方案，并允许在室温下为1小时孵化。
- 绘制成管50μL的PBS及在室温下离开，直到血或白膜样品准备处理。
- 10分钟前使用隔离的微管，吸取50微升PBS已经饱和，以激活选择的分子与Ca 2 +（PBS +“）。
4。样品制备，细胞分离
- 绘制或索取10毫升的血液，从病人到肝素管。
- 地方10毫升到50 mL离心管Ficoll分离 - Paque淋巴细胞分离的解决方案。轻轻层Ficoll分离顶部10毫升全血，以免混合血液和Ficoll。
- 2000XĞ离心15分钟在4°C间最小减速。
- 除去白膜层和地点在新的管。
- 用PBS洗白膜（230XĞ离心10分钟，弃上清）。
- 1毫升红细胞裂解液轻轻悬浮细胞孵育10分钟在室温下溶解红细胞。
- 加入10毫升的PBS，轻轻混匀，离心10分钟230XĞ。弃上清，轻轻悬浮颗粒在3至4毫升PBS +。
5。细胞分离
- 附加功能化微管5毫升注射器，使用艺达思适配器的一端。
- 插入到注射泵的注射器。
- 淹没成细胞suspensio的官能微管的开口端N。
- 通过在1至4 mL / h的微管处理的细胞悬液。
- 转让的微管的开口端管PBS +和300μL，PBS +到注射器吸取0.016毫升/分钟，从松散的绑定和细胞的微管。
- 放入一个干净的管的微管的开口端。从微管断开注射器和附加Accutase预填充注射器。轻轻地灌注到微管填补（〜50μL）足够的Accutase和允许在室温下孵育10分钟。
- 将注射器1毫升培养基（79％，20％胎牛血清的RPMI 1％青霉素链霉素）和微管灌注预先填写，收集到组织文化的污水处理孔板。
- 培养细胞在37℃，湿条件下CO 2 5％。
6。代表结果
这项技术的目标是可行的癌细胞，癌症患者的血液从隔离。几种方法存在的文化，以确定癌细胞的设备成功的必要的核查。我们选择了除了到DAPI染色与针对上皮基，如EpCAM的上皮细胞粘附分子（）或PSMA的前列腺特异性膜抗原（）的抗体细胞培养，以确定完整的细胞核（图2和3）。夺取癌细胞的数量，使用这种技术必然是一个CTCs的数量开始样品中的功能，病人可变性高。在处理IV期癌症患者确诊样本中，我们经常捕获100和500之间每管血癌细胞，纯度> 50％。紧随隔离，污染白细胞更大的可能是存在的。然而，这些数字将被耗尽以下潜伏期长达5天，在培养基。
图2。反恐隔离的代表从乳腺癌患者和肺癌患者的血液样本得出的数据。验明正身CTC EpCAM的染色的活细胞的数量是由坚实的酒吧和涉及到的左坐标和鉴定细胞的百分比表示，作为反恐相比，捕获的细胞总数的代表是由开放的酒吧和测量正确的坐标。结果培养5天。 
从单独的捐助者（A和B）在文化CTC随后的5天到isolati代表显微图3。从一个癌症病人的血液样本。细胞荧光染色与AlexaFluor 488（绿色）和4',6-diamidino-2-苯基吲哚（DAPI）的可视化的核（蓝色）EpCAM的。
Discussion
这是经常发生的情况，在发现新的癌症疗法的早期步骤，利用肿瘤细胞株，其中承担问题的原发肿瘤细胞相似，但仍然在使用，因为他们在实验室中使用的方便。将加快发展进入新的癌症疗法的研究，如果早在新的研究主要利用人类癌细胞。反恐委员会是最容易进入癌细胞的类型，由于其存在于血液和易用性的标准抽血。此外，循环肿瘤细胞代表了在5,6转移过程中的必要步骤，因此其相关的疾病，并针对新药物的效用，是明确的。反恐血液在体外分离是复杂的，其低浓度：每百万亿红细胞7％的白细胞或秩序。目前的方法检测血液中的四氯化碳，包括唯一获得FDA批准的技术细胞中的大多数搜索（Veridex）的，在检测过程中损坏或破坏细胞，排除使用超出枚举。上面介绍的方法，不破坏细胞活力，从而打开了未来癌症临床研究的大门。作为完整的细胞恢复是这项技术的目标，这是势在必行，细胞被小心处理，特别是在血液中分离步骤。
有许多可调参数，在这个系统可以修改，以达到提高产量的关键特征，如癌症类型而定。在上述步骤，我们已经选择使用EpCAM的的CTC具体处理前列腺癌样本时除外抗体作为一个为所有类型的癌症，其中抗PSMA的使用。癌症特异性抗体的进一步换人当然是可以用于改善个别病人的性能。此外，选择和抗体浓度可以改变，以提高捕捉8。
“设备的基本特征是E-选择素分子在表面上成立。E-选择通常招募快速移动的白细胞向炎症部位的内皮细胞功能的壁面上表示。流动的白细胞结合瞬时到选择的分子，在较慢的，滚动的行为，有利于慢，通过整合内皮细胞结合。令人信服的实验证据存在的情况下，反恐委员会可以渗出9,10由一个类似的机制。选择列入使该器件能够在更大的流速经营，价格，否则将阻止细胞结合的抗体，11。因此我们的设备生理模仿小静脉，以biomimetically捕捉流动反恐不造成细胞损伤。增强设备性能，可以归结为埃洛石纳米管涂层除了壁面该设备。以往的研究表明，有三个主要组成部分的碳纳米管涂层，可以改进的功能。首先，碳纳米管涂层提供表面积增加，从而在表面上4蛋白沉积更大。其次，在表演上的碳纳米管涂层的原子力显微镜，我们已经决定从表面到流，单个碳纳米管突出。这使选择分子将高达1微米以上的表面，使细胞可以被捕获，并通过管4招募表面早在他们的轨迹。最后，埃洛石纳米管涂层能够防止白细胞粘附和蔓延，表面上允许的捕获与CTC沿白细胞数量减少，从而更大的后续反恐纯度3。
Disclosures
MRK的是一个CellTraffix公司（纽约州罗切斯特市）的科学顾问。
Acknowledgments
来自国家癌症研究所通过奖号码U54CA143876微环境及转移工作的过程中得到了康奈尔大学的中心。内容完全是作者的责任，并不代表官方意见的国家癌症研究所或国家卫生研究院。额外资助的这项工作是由国家科学基金会研究生研究奖学金（ADH）的部分。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 300 um ID tubing | Braintree Scientific, Inc. | MRE025 | |
| Larger tubing for connection to syringe | IDEX Health Science | 1507L | |
| 5mL syringe for pump | BD Biosciences | 309603 | |
| Connector small to large tubing | IDEX Health Science | P-770 | |
| Connector large tubing to syringe | IDEX Health Science | F-120 and P-659 | |
| Syringe for microtube (3/10cc Insulin Syringe U-100 29G 1/2') | BD Biosciences | 309301 | |
| Accutase | MP Biomedicals LLC | 1000449 | |
| Ficol-Paque Plus | GE Healthcare Bio-Sciences AB | 17-1440-03 | |
| RBC Lysis Buffer (Buffer EL, 1000mL) | Qiagen | 1014614 | |
| Protein G, 5 mg | CalBiochem (calbiochem.com) | 539303 | |
| Human EpCAM/TROP-1 Antibody | R&D Systems | MAB960 | |
| PSMA Antibody (GCP-04) | Abcam | ab66911 | |
| 96 well plates (Microtest 96) | BD Biosciences | 35-3072 | |
| Blotting Grade Blocker Non-Fat Dry Milk, 300g | Bio-Rad | 216005508 | |
| Halloysite Nanotubes | NaturalNano | NN-HNT200 | |
| Calcium Carbonate, 5g | Aldrich Chemistry | 481807 | |
| rhE-Selectin/Fc Chimera, 100 ug | R&D Systems | 724-ES | |
| RPMI Medium 1640 | GIBCO, by Life Technologies | 22400-089 | |
| DPBS | GIBCO, by Life Technologies | 14190-095 | |
| Poly-L lysine 0.1% w/v in water | Sigma-Aldrich | P8920-100ML | |
| Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | Model 100 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biochemicals | S11056H | |
| Penicillin Streptomycin | Sigma Life Siiences | P0781 |
References
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