Summary
Dolaşımdaki tümör hücreleri hücresel hasara maruz kalmadan kanserli hastaların kandan izole edilir. Tümör hücrelerinin izolasyonu epiteliyal belirteçler karşı antikorların yanısıra E-selektin bir iki moleküllü yüzey kullanılarak gerçekleştirilir. Bir nanotüp kaplama özellikle yüksek yakalama saflık sonuçlanan kanser hücre adezyon teşvik etmektedir.
Abstract
Sirkülasyon tümör hücrelerinin (CTC) dolaşım sistemi boyunca primer tümörün yayılması ve nihayetinde uzak bölgelerde ikincil tümörler oluşabilir hücrelerdir. CTC sayımı, kan ve hastalığın şiddetine 1 in CTC konsantrasyonu arasındaki korelasyon üzerine dayanan hastalığın ilerleyişini takip etmek için kullanılabilir. Bir tedavi aracı olarak CTC kişiselleştirilmiş tedaviler geliştirmek için laboratuar okudu olabilir. Bu amaçla, CTC izolasyon hiçbir hücresel hasara ve özellikle diğer hücre tipleri, lökositler tarafından kontaminasyona neden gerekir, mümkün 2 olarak kaçınılmalıdır. CTC sayımı için tek FDA onaylı cihaz dahil, geçerli teknikleri, çoğu, (Daha fazla bilgi için Ref. 2) izolasyon sürecinin bir parçası olarak CTC yok. Uygulanabilir CTC yakalamak için bir cihaz mikroakışkan epiteliyal belirteçler 3 karşı antikorların yanısıra E-selektin glikoproteini ile fonksiyonelleştirilmiş bir yüzey oluşan, tarif edilmektedir. Cihazın performansı artırmak içinBir nanoparçacık kaplama Mance halloysitten nanotüpler, kil 4 hasat bir alüminosilikat nanoparçacık oluşan uygulanan edildi. E-selektin moleküllerin alternatif mikroakışkan cihazları üzerinde bir avantaj daha uzun işlem süreleri bir yüzey etkileşim için yeterli zamana sahip hedef hücreleri sağlamak için gerekli olan neyin kredi, cihaz üzerinden pompalanan hızlı hareket CTC yakalamak için bir yol sağlar. Epitel hedeflere antikorlar gibi izolasyon ayarlamak için, kolayca ayarlanabilir parametre sağlamak gibi, cihaza CTC-özgüllük sağlar. Son olarak, halloysitten nanotüp kaplama önemli ölçüde geliştirilmiş izolasyon, hızlı hareket eden hücreler yakalamak için yardımcı protein adsorpsiyonu için, yüzey alanı artırılmış sağlayarak ve tehlike lökosit 3,4 kovucu diğer tekniklere nazaran sağlar. Bu cihaz, off-raf malzemeleri kullanarak basit bir teknik ile üretilir, ve başarılı bir şekilde metastatik kandan kanser hücrelerinin yakalamak için kullanılmıştırkanser hastası. Yakalanan hücre izolasyonu takiben kültürde 15 gün için kadar korudu ve bu örneklerin genellikle her hastadan>% 50 canlı primer kanser hücreleri oluşur edilir. Bu cihaz, seyreltilmiş ve tam kan buffy tabaka örneklerinin her iki canlı CTC yakalamak için kullanılmıştır. Sonuçta, biz Kişiye özel kanser tedavileri geliştirmek için bir klinik ortamda işlevselliği ile bir teknik sunduk.
Protocol
Aşağıdaki protokol tek bir mikrotüp cihazın üretimi için.
1. Halloisit Nanotube Çözüm hazırlanması
- Sonikasyon (10-13 W (RMS)) 250 uL halloysitten nanotüp solüsyonu (su içinde ağırlıkça% 6.6) 30 sn. Bir kez soğuk su ve tekrar sonication ile serin bir çözüm. Tekrar soğutun.
- Bir şırınga içine sonike çözüm çizin, bir 0.45 mikron şırınga filtre takın ve temiz mikrofuge'de tüpe filtre çözüm. Homojenliği sağlamak için zaman zaman Vortex çözüm.
2. Halloisit Nanotüpler ile mikrotüp İç Yüzey Kaplama
- 50 cm Micro-Renathane microtubing uzun bölümü (300 mikron iç çapı, 35.3 uL iç hacmi) edinin. Diyagonal bir anda mikrotüp bir ucunu kesin ve küçük bir IDEX adaptör parça takın. Mikrotüp diğer ucunda bir 3/10 cc 29G şırınganın iğne yerleştirin.
- Mikrotüp temizlemek için, mikrotüp açık ucundan (ucu yerleştirmekadaptör ile)% 70 etanol ve çekilişe ~ şırıngaya 50 uL etanol mikrotüp doldurmak için.
- Şırıngaya distile su cömert bir hacim çizerek mikrotüp dışarı etanol durulayın.
- Mikrotüp gelen şırınga ayırmak, şırınga boşaltılması ve ardından mikrotüp için takın.
- % 0.02 su içinde a / h poli-L lisin çözeltisi hazırlayın. Mikrotüp içine 50 uL çizin ve oda sıcaklığında (RT) az 5 dakika oturup bekleyin.
- Mikrotüp içine 100 uL filtre nanotüp çözüm çizin ve RT az 3 dakika inkübe sağlar.
- Nanotüp çözüm durulama mikrotüp ile 100 uL su çizin. RT gece, su ile dolu, oturup kaplı mikrotüp izin verin.
3. Hücre İzolasyon için mikrotüplerdeki hazırlanması
- 1X Dulbecco fosfat içinde 10 ug / mL protein G çözeltisi hazırlayın (- 7.2 PBS, pH 7.0) tamponlu tuz. Mikrotüp ile 50 uL PBS çizin ve sonra 50 uL çekmekProtein G-solüsyonu ve oda sıcaklığında 1,5 saat inkübe izin verir.
- 5 ug / mL E-selektin-IgG ve PBS içerisinde 50 ug / mL antikoru (en kanseri numuneler için, anti-PSMA prostat kanseri numuneler için anti-EpCAM) ihtiva eden bir solüsyon hazırlanır. Mikrotüp içine E-selektin ve antikor çözeltisi 50 uL çekecek ve oda sıcaklığında 2 saat inkübe izin verir.
- Nonspesifik hücresel adezyon% 5 süt proteini bloke edilir. % 5 (a / h) PBS içinde süt proteini çözeltisi hazırlayın. Mikrotüp içine 50 uL süt proteini çözeltisi çekecek ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe izin verir.
- Tüpe 50 uL PBS çizin ve kan veya buffy coat örnekleri işlem için hazır olana kadar oda sıcaklığında bekletin.
- Önceden izolasyon için mikrotüp kullanılarak ila 10 dakika, selektin molekülleri aktive Ca2 + ("PBS +") ile doyurulmuş olan 50 uL PBS çizer.
4. Hücre izolasyon için örneklerinin hazırlanması
- Hasta heparinize içine 10 ml kan çizin veya eldetüp.
- 50 ml santrifüj tüpüne Yeri 10 ml Ficoll-Paque lenfosit izolasyonu çözüm. Ficoll üstüne hafifçe tabaka 10 ml tam kan, böylece kan ve Ficoll karıştırmak değil.
- ° C ile 4 Minimal yavaşlama azından 15 dakika süreyle 2000x g'de santrifüj;.
- Yeni tüp buffy coat tabakası ve yer çıkarın.
- PBS ile yıkama buffy coat (10 dakika 230X g de santrifüj, süpernatant atın).
- Yavaşça 1 ml eritrosit lizis tamponu ile tekrar süspansiyon hücreleri ve eritrositler lyse RT az 10 dakika inkübe edilir.
- 10 ml PBS, yavaşça karıştırın ve 10 dakika 230X g santrifüj ekleyin. Süpernatant atın ve yavaşça 4 ml PBS + için 3 pelletini.
5.. Hücre izolasyonu
- IDEX bağdaştırıcılar kullanılarak bir 5 mL şırıngaya fonksiyonlandırılmış mikrotüp bir ucunu.
- Bir şırınga pompası üzerine şırınga yerleştirin.
- Hücre suspensio inmeye fonksiyonlandırılmış mikrotüp açık ucundann.
- 1-4 mL / saat hızda mikrotüp yoluyla hücre süspansiyonu işlemek.
- PBS içeren bir tüpe mikrotüp açık ucuna transfer + ve mikrotüp ilişkisizleştirilir ve gevşek bağlı hücreleri çıkarmak için 0.016 ml / dk şırıngaya 300 uL PBS + çizin.
- Temiz bir tüp içine mikrotüp açık ucuna yerleştirin. Mikrotüp gelen şırınga çıkarın ve Accutase ile doldurulmuş bir şırınga takın. Yavaşça doldurmak için mikrotüp (~ 50 uL) içine yeterince Accutase serpmek ve 10 dakika süreyle oda sıcaklığında inkübe izin verir.
- Toplama, mikrotüp içine 1 büyüme ortamı mL (% 79 RPMI,% 20 FBS,% 1 penisilin streptomisin) ve yayma ile doldurulmuş bir şırınga takın doku kültürü içine atık plaka iyi muamele.
- 37 de kültüre hücreleri ° C ile nemlendirilmiş koşullar altında% 5 CO2.
6. Temsilcisi Sonuçlar
Bu tekniğin amacı, kanser hastalarında kan uygulanabilir kanser hücreleri izole etmek için bir. Çeşitli yöntemler kültüründe kanser hücrelerini tanımlamak için vardır; cihazın başarısı için gerekli bir doğrulama. Biz, sağlam hücre çekirdeğine (Şekil 2 ve 3) tespit etmek DAPI ek olarak, bu tür EpCAM (epitel hücre adezyon molekülü) veya PSMA (prostat spesifik membran antijeni) epitel yarımlar karşı antikorları ile kültür içinde hücreleri leke seçmiştir. Kanser hücrelerinin sayısı, bu teknik kullanılarak ille başlangıç numunedeki nedenle kapalı zaman eğrileri sayısının bir fonksiyonu olduğu, ve hastanın değişkenliği yüksek olabilir yakalanır. Evre IV kanser tanısı almış hastalardan alınan numuneler işleme, biz rutin saflıklarda kan tüp başına 100 ve 500 arasında kanser hücrelerini,>% 50 yakalamak. Hemen izolasyon ardından, kontamine lökositlerin fazla sayıda mevcut olabilir. Ancak bu rakamlar kadar 5 gün için kültür ortamında aşağıdaki kuluçka tüketilmiş olacaktır.
Şekil 2. Kan örneklerinden CTC izolasyon Temsilcisi verileri bir meme kanseri hasta ve bir akciğer kanseri hastanın çekilen. CTC EpCAM boyama dayalı olarak tanımlanan uygulanabilir pozitif hücrelerin sayısı CTC yakalanan hücrelerin sayısı ile karşılaştırıldığında katı çubukları ve sol ordinat ve tespit edilmiştir hücrelerin yüzdesi ilgilendirmeyen ile temsil edilen açık çubuklar ile temsil edilir ve Sağ ordinat üzerinde ölçüldü. Sonuçlar kültür beş gün takip ediyoruz. 
Isolati ila 5 gün sonraki kültüründe CTC ayrı donör (A ve B) den Şekil 3. Örnek mikrografikleriBir kanser hastasının kan örneği üzerinde. Hücreler floresan çekirdeği (mavi) görselleştirmek için AlexaFluor 488 (yeşil) ve 4 ',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ile EpCAM için boyandı.
Discussion
Genellikle yeni kanser tedavi keşfi erken adımları birincil kanser hücrelerinin şüpheli benzemeyenlerdendi kanser hücre hatları, henüz laboratuvar kullanım kolaylığı nedeniyle kullanmak kalır kullanan bu böyledir. Birincil insan kanser hücreleri erken roman araştırma yararlanılmıştır eğer yeni kanser tedavilerinin geliştirilmesine yönelik araştırmalar hızlandırılmalıdır olacaktır. CTC kanlarında varlığı ve standart bir kan beraberlik kolaylığı sayesinde kanser hücresinin en kolay ulaşılabilir tipi vardır. Buna ek olarak, dolaşımdaki tümör hücreleri metastazı 5,6 sürecinde gerekli bir aşama temsil eder, böylece yeni bir ilaç hedefleme için hastalığı ve yarar önemleri açıktır. In vitro kandan CTC izolasyonu onların düşük konsantrasyonlarda da karmaşık hale geliyor: Bir milyon nüfus başına lökosit veya eritrosit 7 milyar başına bir sırasına. Tek FDA onaylı tekniği Hücre dahil olmak üzere, kanda CTC tespit için mevcut yöntemlerin çoğunluğu Arama (Veridex), hasar veya numaralandırma ötesinde kullanımı engelleyen, algılama sürecinde hücrelerini yok. Yöntemi hücre canlılığı ödün vermeyen yukarıda açıklanan ve böylece kanser gelecekte yapılacak klinik araştırmalar için kapıyı açar. Sağlam hücreleri kurtarma bu tekniğin amacı olduğu için, hücreleri özellikle kan ayırma adımları sırasında, dikkatle şarttır.
Örneğin kanser türü olarak kritik bir özelliğine göre geliştirilmiş verim elde etmek için değiştirilebilir olabilir, bu sistemde ayarlanabilir parametrelerin vardır. Yukarıda tarif edilen adımlar olarak, anti-PSMA kullanılan bileşikler, prostat kanseri örnekleri işlerken dışında tüm kanserler için bir CTC-özgü antikor olarak EpCAM kullanmak seçmiştir. Kansere özgü antikorların daha da kesin ikamelerini bireysel hastalar için performansını iyileştirmek için kullanılabilir. Dahası, selektin ve antikor konsantrasyonları yakalama 8 geliştirmek için değiştirilebilir.
"> Cihazı elzem bir özelliği yüzeye E-selektin moleküllerinin birleşmesi. E-selektin normal endotelyal hücreler ve inflamasyon siteleri, hızlı hareket eden lökositlerin toplamak için fonksiyonun lümen yüzeyi üzerinde ifade edilir. Akan lökositlerin için geçici olarak bağlamak integrinler tarafından endotel hücre daha yavaş ve daha güçlü bir bağlayıcı kolaylaştıran bir yavaş, haddeleme davranış çıkan selektin moleküller. İkna edici deneysel kanıt CTC benzer bir mekanizma ile 9,10 extravasate olduğunu durumda yaptığı var. selektin eklenmesi de Cihaz yüksek debi de çalıştırılmasına olanak sağlar, aksi takdirde antikorlar 11 bağlanmasını hücreleri önleyecektir oranları. Böylece bizim cihaz fizyolojik biomimetically hücresel hasarı maruz kalmadan CTC akan yakalamak için bir venül taklit eder.Geliştirilmiş cihaz performansı lümen yüzeyine halloysitten nanotüp kaplamanın Ayrıca atfedilebilirCihazın. Önceki çalışmalar geliştirilmiş işlevsellik sağlıyor nanotüp kaplamanın üç ana bileşen olduğunu göstermiştir. İlk olarak, nanotüp kaplama yüzeyinin üzerinde daha büyük bir proteine 4 çökelmesine olanak, artan yüzey alanı sağlamaktadır. İkincisi, nanotüp kaplama atomik kuvvet mikroskobu yerine getirirken bireysel nanotüpler akışına yüzeyinden çıkıntı olduğunu tespit etti. Bu, hücre tüp 4 yoluyla çekilen ve önceki bunların yörüngesi içinde yüzeyine işe böylece selektin moleküller yüzeyi üzerinde bir gibi büyük bir mikron sunulabilir sağlar. Son olarak, halloysitten nanotüp kaplama lökosit yapışması önlemek ve CTC ile birlikte ele lökositlerin azaltılmış bir dizi izin veren, yüzey üzerinde yayılan ve böylece daha sonraki CTC saflıklarda 3 edebilmektedir.
Disclosures
MRK CellTraffix, Inc (Rochester, NY) bilimsel danışmanı.
Acknowledgments
Açıklanan çalışma, Ulusal Kanser Enstitüsü Ödülü Numarası U54CA143876 aracılığıyla Mikroçevre & Metastaz üzerine Cornell Merkezi tarafından desteklenmiştir. Içeriği sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka Ulusal Kanser Enstitüsü veya Ulusal Sağlık Enstitüleri resmi görüşlerini temsil etmez. Bu çalışma ayrıca, Ulusal Bilim Vakfı Doktora Araştırma Bursu (ADH) tarafından kısmen finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 300 um ID tubing | Braintree Scientific, Inc. | MRE025 | |
| Larger tubing for connection to syringe | IDEX Health Science | 1507L | |
| 5mL syringe for pump | BD Biosciences | 309603 | |
| Connector small to large tubing | IDEX Health Science | P-770 | |
| Connector large tubing to syringe | IDEX Health Science | F-120 and P-659 | |
| Syringe for microtube (3/10cc Insulin Syringe U-100 29G 1/2') | BD Biosciences | 309301 | |
| Accutase | MP Biomedicals LLC | 1000449 | |
| Ficol-Paque Plus | GE Healthcare Bio-Sciences AB | 17-1440-03 | |
| RBC Lysis Buffer (Buffer EL, 1000mL) | Qiagen | 1014614 | |
| Protein G, 5 mg | CalBiochem (calbiochem.com) | 539303 | |
| Human EpCAM/TROP-1 Antibody | R&D Systems | MAB960 | |
| PSMA Antibody (GCP-04) | Abcam | ab66911 | |
| 96 well plates (Microtest 96) | BD Biosciences | 35-3072 | |
| Blotting Grade Blocker Non-Fat Dry Milk, 300g | Bio-Rad | 216005508 | |
| Halloysite Nanotubes | NaturalNano | NN-HNT200 | |
| Calcium Carbonate, 5g | Aldrich Chemistry | 481807 | |
| rhE-Selectin/Fc Chimera, 100 ug | R&D Systems | 724-ES | |
| RPMI Medium 1640 | GIBCO, by Life Technologies | 22400-089 | |
| DPBS | GIBCO, by Life Technologies | 14190-095 | |
| Poly-L lysine 0.1% w/v in water | Sigma-Aldrich | P8920-100ML | |
| Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | Model 100 | |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biochemicals | S11056H | |
| Penicillin Streptomycin | Sigma Life Siiences | P0781 |
References
- Allard, W. J. Tumor cells circulate in the peripheral blood of all major carcinomas but not in healthy subjects or patients with nonmalignant diseases. Clin. Cancer Res. 10, 6897-6904 (2004).
- Hughes, A. D., King, M. R. Nanobiotechnology for the capture and manipulation of circulating tumor cells. Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. , (2011).
- Hughes, A. D. Microtube Device for Selectin-Mediated Capture of Viable Circulating Tumor Cells from Blood. Clinical Chemistry. 58, 846-853 (2012).
- Hughes, A. D., King, M. R. Use of naturally occurring halloysite nanotubes for enhanced capture of flowing cells. Langmuir. 26, 12155-12164 (2010).
- Al-Mehdi, A. B. Intravascular origin of metastasis from the proliferation of endothelium-attached tumor cells: a new model for metastasis. Nat. Med. 6, 100-102 (2000).
- Gupta, G. P., Massague, J. Cancer metastasis: Building a framework. Cell. 127, 679-695 (2006).
- Lee, D., King, M. R. Microcontact Printing of P-Selectin Increases the Rate of Neutrophil Recruitment Under Shear Flow. Biotechnology Progress. 24, 1052-1059 (2008).
- Gout, S., Tremblay, P. L., Huot, J. Selectins and selectin ligands in extravasation of cancer cells and organ selectivity of metastasis. Clin. Exp. Metastasis. 25, 335-344 (2008).
- Geng, Y., Marshall, J., King, M. Glycomechanics of the Metastatic Cascade: Tumor Cell-Endothelial Cell Interactions in the Circulation. Annals of Biomedical Engineering. , 1-16 Forthcoming.
- Stott, S. L. Isolation of circulating tumor cells using a microvortex-generating herringbone-chip. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 18392-18397 (2010).
