Summary
Krystalstrukturen af protein-DNA-komplekser kan give indsigt i proteinfunktion, mekanisme, såvel som af arten af den specifikke interaktion. Her rapporterer vi hvordan man kan optimere længde, sekvens og ender duplex DNA for co-krystallisering med
Abstract
Escherichia coli SeqA er en negativ regulator af DNA-replikation, der forhindrer for tidlig reinitieringsaktivitet hændelser ved sekvestrering hemimethyleret GATC klynger i replikationsorigin 1. Ud over oprindelse, SeqA findes på replikationsgafler, hvor det organiserer nyligt replikeret DNA i højere ordnede strukturer 2. SeqA associerede kun svagt med enkelte GATC sekvenser, men danner høj affinitet komplekser med DNA-duplekser indeholder multiple GATC sites. Den minimale funktionel og strukturel enhed af SeqA er en dimer, hvilket forklarer kravet om mindst to GATC-sekvenser til dannelse af en høj-affinitet kompleks med hemimethyleret DNA 3. Derudover SeqA arkitektur med oligomerisering og DNA-bindende domæner adskilt af en fleksibel linker, tillader binding til GATC repeats er adskilt af op til tre spiralformede vindinger. Derfor forstå funktionen af SeqA på et molekylært niveau kræver strukturelle analysis af SeqA bundet til flere GATC-sekvenser. I protein-DNA krystallisation, kan DNA har ingen til en ekstraordinær effekt på emballagen interaktioner afhængig af de relative størrelser og arkitektur af proteinet og DNA. Hvis proteinet er større end DNA eller fodspor fleste af DNA'et, er krystallen emballagen primært medieret af protein-protein interaktioner. Omvendt, når proteinet er af samme størrelse eller mindre end DNA eller det kun omfatter en del af DNA, DNA-DNA og DNA-protein-interaktioner dominerer krystal pakning. Derfor krystallisation af protein-DNA-komplekser kræver systematisk screening af DNA længde 4 og DNA-ender (stump eller overhæng) 5-7. I denne rapport beskriver vi, hvordan man kan designe, optimere, rense og krystallisere hemimethyleret DNA-duplekser indeholdende tandem GATC repeats i kompleks med en dimer variant af SeqA (SeqAΔ (41-59)-A25R) til opnåelse af krystaller er egnede til strukturbestemmelse.
Protocol
1. Proteinoprensning
Den fleksible linker forbinder N-(oligomerisering) og C-terminal (DNA binding) domæner af SeqA hjælpemidler anerkendelsen af hemimethyleret GATC repeats er adskilt af 1-3 omdrejninger på DNA'et. Til denne undersøgelse anvendte vi et dimert variant af SeqA (SeqAΔ (41-59)-A25R) med en punktmutation i det N-terminale domæne, der forhindrer yderligere oligomerisering og en forkortet linker, som begrænser DNA binding til tandem GATC gentager adskilt udelukkende af en omdrejning på DNA (figur 1) 2,8.
- Transformere BL21 (DE3)-celler med plasmidet kodende SeqA under kontrol af T7-promotoren,
- Plade omdannelsen reaktionen i LB-agarplader med 100 ug / ml ampicillin,
- Pick blandede kolonier til at inokulere et mindre overnatskultur (LB-medier med 100 ug / ml ampicillin),
- Den næste morgen inokulere en 1 L af medier ved anvendelse af en 1:100 fortynding af overniGHT kultur,
- Dyrk cellerne til en OD600 på ~ 0,7 og inducere proteinproduktion ved tilsætning af isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG) til en slutkoncentration på 1 mM,
- Fortsæt inkubation i 3 timer ved 37 ° C med orbital omrystning og derefter høste cellerne ved centrifugering (10 minutter ved 3300 g),
- Resuspender cellepelleten i oprensning puffer A og lyseres ved sonikering,
- Fjerne lysatet ved centrifugering (40 minutter ved 39.000 g) og indlæse supernatanten på en heparin-søjle ækvilibreret med rensning puffer,
- Eluerer SeqA anvendelse af en lineær gradient til 1 M NaCI (SeqA eluerer ved ~ 0,7 M NaCI),
- Samle SeqA-holdige fraktioner sammen, fortyndes at sænke ionstyrken af prøven og belastning i en kationbytningskromatografi ækvilibreret med rensning puffer,
- Anvendelse af en lineær saltgradient, ren SeqA eluerer ved ~ 0,4 M NaCl,
- Pool de SeqA fraktioner sammen, concentrate (3 mg / ml) og opbevares i opbevaringspuffer.
2. DNA-oprensning
- Bestil komplementære methylerede og methylerede oligonukleotider fra din favorit selskab,
- Opløs 1 pmol af hvert lyofiliseret enkeltstrenget DNA i 800 ul autoklaveret ddH 2 O, vortex, og lad det sidde i 10-20 min,
- Tilsættes 800 pi af forvarmet 2X loading buffer til hvert oligonukleotid,
- I 20-30 nucleotider lange oligonucleotider, forbereder et stort 10% denaturerende gel (160 x 250 x 1 mm):
* Bland godt 80 ml 10% PAGE mix, 80 pi TEMED og 800 pi ammoniumpersulfat pr gel og hæld,
* Når polymeriseret, fjernes kammen og skyl brøndene med Hedeselskabet 2 O grundigt,
* Saml geler på gel cast, herunder køling plade og derefter udfylde de øverste og nederste reservoirer med rindende buffer (1X TBE),
* Pre-køre gelen ved 700-750 V at opvarme gelen til 55 ° C,
* Stop kørslen og skyl brøndene Thorøughly med rindende puffer. - Opvarme oligonukleotider til 90 ° C i 2 min,
- Vortex og spin prøverne og umiddelbart før læsning af gelen
- Kør gelen ved ~ 700 V og stoppe det, når din oligonukleotid er flyttet halvvejs. (Bemærk, at på en 10% polyacrylamidgel bromphenolblåt-co-migrerer med oligonukleotider ~ 20 baser lange og xylencyanol FF med ~ 60 baser lange),
- Stop gelen, adskille det fra gelboksen og fjern afstandsstykkerne,
- På en flad overflade, fjern en glasplade og dække gelen med plastfolie,
- Vend gelen rundt, skal du fjerne den anden glasplade og dække det med plastfolie,
- Markerer bånd med UV-lys og en fluorescerende plade bag gelen for at se DNA skygge,
- Skær båndet med et barberblad i små stykker og overføre dem til et sterilt 15 ml rør,
- Tilsættes 9 ml elueringsbuffer og elueres natten over ved 37 ° C under omrøring,
- Omhyggeligt overføre opløsningentil et autoklaveret centrifugerør under anvendelse af en gel-loading pipettespidsen for at undgå overførsel af acrylamid stykker, og der tilsættes 1 ml 3 M natriumacetat ved pH 7 (1:10 fortynding) og 25 ml afkølet 100% ethanol (2,5 volumener),
- Inkuber ved -20 ° C i mindst 3 timer,
- Stop, og Overfør supernatanten til et separat rør,
- Tør pellet på speed-vac ved middel varme,
- Pellet resuspenderes i 400 pi af autoklaveret ddH 2 O og overføres til et nyt rør,
- Tilsættes 40 pi 3 M natriumacetat ved pH 7 og 1 ml 100% ethanol, bland godt (vortex) og inkuber 30 minutter ved stuetemperatur efterfulgt af 30 minutter ved -20 ° C,
- Spin i 15 minutter ved 18.000 g og kassér supematanten,
- Skylle pellet med 100 ul 70% kold ethanol til fjernelse af resterende salt fra pelletten og centrifugering i 6 minutter ved 18.000 g. Kassér ethanol og tør pellet på speed-vac,
- Pellet resuspenderes i i alt 100 ul autoklaveret ddH
- At anneale de hemimethyleret DNA-duplekser, blande ækvimolære koncentrationer af de komplementære enkeltstrenge og opvarme blandingen til 95 ° C i et vandbad i 5 minutter og derefter lade dem afkøle langsomt til stuetemperatur inden i vandbad.
3. Protein-DNA-kompleksdannelse og analyse
- Lige dele af oprenset SeqAΔ (41-59)-A25 (81 uM) og hemimethyleret DNA (81 pM),
- Inkubér ved stuetemperatur i 15 minutter og opbevares ved 4 ° C indtil du er klar til at bruge det,
- Screen for krystallisationsbetingelser anvendelse af kommercielle sparse matrix-skærme,
- Når de indledende krystallisation spor er blevet identificeret, optimere betingelserne for at dyrke diffraktion kvalitet krystaller,
- Cryoprotect de resulterende SeqA-DNA-krystaller ved enten at forøge mængden af PEG 400 til stede i krystallisation opløsning til en slutkoncentration på 25% (v / v) eller tilsætning af 20% glycerol (v / v) til krystallisation opløsningen,
- Scoop individuelle krystaller med en nylon loop, og lynfryser dem i flydende nitrogen,
- Test diffraktionsgrænsen af hver krystal ved 100 K.
4. Repræsentative resultater
Til opnåelse af krystalstrukturen af SeqAΔ (41-59)-A25R bundet til hemimethyleret DNA, vi konsekutivt optimeret tre parametre på DNA: (i) adskillelse mellem hemimethyleret GATC-sekvenser, (ii) længde duplex, og (iii) fravær / tilstedeværelse af 5 'overhangs.
Electro-mobilitetsskift-analyser indikerer, at SeqAΔ (41-59)-A25R fortrinsvis binder GATC repeats er adskilt af 9-10 basepar (figur 1). Derfor har vi i første omgang screenet duplexer 23-24 basepar (bp) lange indeholdende to hemimethyleret GATC sekvenser adskilt af enten 9 eller 10 bps. Tre duplexer gav pænt formede krystaller (figur 2). Alom ingen af krystallerne diffrakterede til høj opløsning, de 23 bp lange duplex med de to GATC sites adskilt af 9 bps diffrakteret røntgenstråler bedre end resten, hvilket indikerer, at en GATC adskillelse af 9 bps blev foretrukket til krystallisation. Derfor har vi fastsat inter-GATC afstand til 9 bps for alle efterfølgende skærmbilleder.
Almindeligvis er DNA krystallisation foretrukket for duplex længde svarende til nøjagtige spiralformede vindinger fordi flere DNA-molekyler kan stable hoved-til-hale til dannelse af en kontinuert B-DNA i krystal 9. Vi derfor afkortes den totale længde af duplexerne til 21 bps (dvs. to skrueformede vindinger). Mens et 21 bps duplex med stumpe ender ikke gav diffraktion kvalitet krystaller (data ikke vist), et 21 bps duplex med en enkelt 5'-overhænget nukleotid i hver ende kunne opnås krystaller, diffrakteret til 5 Å i vores hjem kilde. Forbedringen af diffraktionsgrænsen foreslået, at end-to-end duplex associering faktisk var begunstigeING krystal emballage.
Da SeqA interagerer med GATC-sekvenser, som er på den samme side af DNA'et, bør den modsatte flade af DNA-duplexet blive udsat for opløsningsmidlet. For yderligere at forbedre krystaller af komplekset, vi derefter modificeres sekvensen af duplex omfatter en CG-dinukleotid mellem de to GATC sider for at fremme groove-backbone interaktioner med tilstødende DNA-molekyler i krystallen gennem den modsatte flade af duplex, en fremgangsmåde som har været anvendt til at forbedre DNA krystallisation i fortiden 10. Imidlertid diffraktionsgrænsen af krystallerne dyrkes med CG-holdige duplex var identisk med dem, der dyrkes med en tilsvarende DNA-duplex, der ikke indeholdt CG dinucleotid (figur 3). Dette resultat viste, at groove-backbone interaktioner ikke var vigtigt i denne sag. Vi efterfølgende optimeret længden af udhæng ved at sammenligne krystallerne dyrkes med en DNA-duplex, der var to ekstra nukleotider ved hver5'-enden. Denne ændring havde en dramatisk virkning på krystalmorfologi, samt, diffraktion grænse angiver, at yderligere nukleotid drastiske ændringer af den molekylære kontakter og forbedret krystal organisation (fig. 3).
Krystalstrukturen af SeqAΔ (41-59)-A25R bundet til denne sidste DNA-duplex bekræftede, at den frie flade af DNA-duplexet ikke foretager en krystal kontakter, som forventet ud fra den begrænsede medføre en CG-dinukleotid. På trods af den relative størrelse af protein og DNA, er de fleste interaktioner mellem symmetri hjælpere medieret af protein-protein-og protein-DNA interaktioner (figur 4). Interessant nok i det foreliggende tilfælde, er den gavnlige virkning af et 5'-dinukleotid overhænget ikke på grund af dannelsen af en pseudo-kontinuerlig DNA. I stedet for 5'-enden af de methylerede streng projekter væk fra DNA-akser og interagerer med den proximale SeqA molekyle af komplekset, hvorfor to nukleotider w førend strengt nødvendige for at ændre krystal pakning 8,11.
Figur 1. Binding af SeqAΔ (41-59)-A25R til hemimethyleret DNA. (A) Skematisk diagram over områderne SeqA som medierer protein oligomerisering og DNA-binding. (B) Elektroforetisk mobilitet ændring-assay af SeqAΔ (41-59)-A25R med DNA'er indeholdende to hemimethyleret GATC-sekvenser adskilt af et stigende antal basepar ( X). Længst til venstre bane (mærket Blank) indeholder en ækvimolær blanding af DNA'er med 5, 7, 12, 21, 25 og 34 basepar mellem de to GATC-sekvenser i fravær af SeqAΔ (41-59)-A25R. (C) afbilder de tre variabler optimeret på DNA duplexer til opnåelse af diffraktion kvalitet krystaller.
upload/4266/4266fig2.jpg "fo: indhold-bredde =" 6in "fo: src =" / files/ftp_upload/4266/4266fig2highres.jpg "/>
Figur 2. Virkningen af at variere mellem GATC afstand. Resumé af de anvendte oligonukleotider og krystallerne opnået med 23-24 bp lange duplekser indeholdende to hemimethyleret GATC sites adskilt af 9 eller 10 basepar. Alle billeder af krystaller blev taget på samme forstørrelse og skalaen bjælke angiver 100 um. Resolutionen grænse for hver SeqAΔ (41-59)-A25R-DNA krystal er baseret på diffraktion billeder indsamlet på en Rigaku RU-300 X-ray generator system. Klik her for at se større figur .
Figur 3. Virkningen af at variere DNA-ender. Resumé af than oligonukleotider anvendes, og krystaller opnået med 21 bps lange duplekser, der indeholder to hemimethyleret GATC sites adskilt af 9 basepar og herunder 0, 1 eller 2 nucleotid 5'-enden udhæng. Alle billeder af krystaller blev taget på samme forstørrelse og skalaen bjælke angiver 100 um. Resolutionen grænse for hver SeqAΔ (41-59)-A25R-DNA krystal er baseret på diffraktion billeder indsamlet på beamlines X12C og X29 (NSLS, BNL). Klik her for at se større figur .
Figur 4. Krystal pakning af SeqAΔ (41-59)-A25R bundet til DNA med dinukleotid overhæng: Set fra (A) top og side (B). Den asymmetriske enhed indeholder to SeqAΔ (41-59)-A25R-DNA-komplekser, hvor proteinet er vist i gråt, medens DNA er vist i orange. Symmetriskry relateret SeqAΔ (41-59)-A25R-DNA-molekyler er vist i hvidt for proteinet og gul for DNA. Dette tal blev fremstillet under anvendelse PyMOL 12. Dette tal er relateret til Movie 1. Klik her for at se større figur .
Movie 1. Klik her for at se film .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En af de største udfordringer i makromolekylære røntgenkrystallografi er at få diffraktion kvalitet krystaller. I tilfælde af protein-eller protein-DNA-komplekser, er denne udfordring forværres på grund af de yderligere variabler, der skal optimeres. Det er en udbredt opfattelse, at længden af DNA'et og tilstedeværelsen af klæbrige overhangs at øge associeringen af tilstødende DNA-molekyler i en længere pseudo-duplex er de vigtigste parametre, der skal optimeres. Vi har imidlertid vist, at arten og længden af disse fremspring kan have yderligere virkninger på krystal pakning af et protein-DNA-kompleks. Selv om denne protokol blev udformet til at krystallisere SeqA-DNA-komplekset, optimering af DNA længde, sekvens og ender tilvejebringer en generel ramme for det rationelle design af oligonucleotider til krystallisation af en DNA-protein-komplekset.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke PXRR personale på NSLS (Brookhaven National Laboratory) for assistance under dataindsamlingen og Monica Pillon for at få hjælp med DNA oprensning. Dette arbejde blev støttet af den canadiske Institutes of Health Research (MOP 67.189).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TRIS | Bioshop | TRS003.5 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | E478-500 | |
| Dithiotheitrol (DTT) | Bio Basic Inc. | DB0058 | |
| NaCl | Bioshop | SOD002.10 | |
| Glycerol | Caledon | 5350-1 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016-500G | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Bioshop | SDS001.500 | |
| Urea | Bioshop | URE001.5 | |
| 40% 29:1 Bis/acrylamide | Bio Basic Inc. | A0007-500ml | Store at 4 °C |
| Boric acid | EMD | BX0865-1 | |
| Xylene cyanol FF | Bio-Rad | 161-0423 | |
| Bromophenol Blue | Bioshop | BR0222 | |
| Dual Adjustable Vertical Gel System | C.B.C. Scientific Company Inc. | DASG-250 | |
| Index crystallization screen | Hampton Research | HR2-144 | Store at 4 °C |
| Wizard I crystallization screen | Emerald BioSystems | EBS-WIZ-1 | Store at 4 °C |
| Wizard II crystallization screen | Emerald BioSystems | EBS-WIZ-2 | Store at 4 °C |
| Classics crystallization screen | Qiagen | 130701 | Store at 4 °C |
| Intelliplate trays | Art Robbins Instruments | 102-0001-00 | |
Solutions Protein purification buffer: 100 mM TRIS pH 8, 2 mM EDTA, 2 mM DTT and 5% glycerol. Protein storage buffer: 20 mM TRIS pH 8, 150 mM NaCl, 5 mM DTT, 0.5 mM EDTA and 5% glycerol. Gel loading mix: Add 20 g of sucrose, 25 mg of bromophenol blue, 25 mg of xylene cyanol FF, 1 ml of 10% w/v SDS and 10 ml of 10X TBE to 70 ml of autoclaved ddH2O. Stir with mild heating until sucrose is dissolved and adjust the final volume to 100 ml with autoclaved ddH2O. Store at 4 °C. 2X loading buffer: Add 11 g of urea to 10 ml of gel loading mix. Stir on a hot plate until urea dissolves. Aliquot in 2 ml tubes and store at 4 °C. 10X PAGE mix: Mix 420.4 g of urea, 100 ml of 10X TBE (autoclaved), 250 ml of 40% 29:1 Bis/Acrylamide in ddH2O. Stir until totally dissolved and adjust volume to 1 liter. Store in dark bottles at 4 °C. 10X TBE: Dissolve 108 g of TRIS, 55 g of boric acid and 9.3 g of EDTA in 1 liter of ddH2O. Autoclave and store at room temperature. Elution buffer: Dilute 8 ml of 5 M NaCl, 2 ml of 1 M TRIS pH 7.5, 0.4 ml of 0.5 M EDTA pH 8 on 200 ml of ddH2O. Autoclave and store at room temperature. |
|||
References
- Campbell, J. L., Kleckner, N. E. coli oriC and the dnaA gene promoter are sequestered from dam methyltransferase following the passage of the chromosomal replication fork. Cell. 62, 967-979 (1990).
- Guarné, A. Crystal structure of a SeqA-N filament: implications for DNA replication and chromosome organization. Embo. J. 24, 1502-1511 (2005).
- Brendler, T., Austin, S. Binding of SeqA protein to DNA requires interaction between two or more complexes bound to separate hemimethylated GATC sequences. Embo. J. 18, 2304-2310 (1999).
- Jordan, S. R., Whitcombe, T. V., Berg, J. M., Pabo, C. O. Systematic variation in DNA length yields highly ordered repressor-operator cocrystals. Science. 230, 1383-1385 (1985).
- Tan, S., Hunziker, Y., Pellegrini, L., Richmond, T. J. Crystallization of the yeast MATalpha2/MCM1/DNA ternary complex: general methods and principles for protein/DNA cocrystallization. J. Mol. Biol. 297, 947-959 (2000).
- Rice, P. A., Yang, S., Mizuuchi, K., Nash, H. A. Crystal structure of an IHF-DNA complex: a protein-induced DNA U-turn. Cell. 87, 1295-1306 (1996).
- Yang, W., Steitz, T. A. Crystal structure of the site-specific recombinase gamma delta resolvase complexed with a 34 bp cleavage site. Cell. 82, 193-207 (1995).
- Chung, Y. S., Brendler, T., Austin, S., Guarne, A. Structural insights into the cooperative binding of SeqA to a tandem GATC repeat. Nucleic Acids Res. , (2009).
- Anderson, J., Ptashne, M., Harrison, S. C. Cocrystals of the DNA-binding domain of phage 434 repressor and a synthetic phage 434 operator. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 1307-1311 (1984).
- Timsit, Y., Moras, D. DNA self-fitting: the double helix directs the geometry of its supramolecular assembly. Embo J. 13, 2737-2746 (1994).
- Chung, Y. S., Guarne, A. Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of SeqA bound to a pair of hemimethylated GATC sites. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 64, 567-571 (2008).
- DeLano, W. L. The PyMOL Molecular Graphic Systems. , DeLano Scientific. (2002).
