Summary
Кристаллическая структура белка-ДНК может дать представление о функции белка, механизма, а также, характера конкретного взаимодействия. Здесь мы сообщаем о том, как оптимизировать длину, последовательность и концы ДНК-дуплекса для совместной кристаллизации с
Abstract
Кишечная палочка SeqA является негативным регулятором репликации ДНК, что предотвращает преждевременное возобновление событий изолирующих hemimethylated GATC кластеров в начало репликации 1. Помимо происхождения, SeqA находится на репликацию вилки, где он организует новореплицированные ДНК в более упорядоченной структуры 2. SeqA ассоциируется только с одним слабо GATC последовательностей, но он образует комплексы высокого сходства с ДНК-дуплексов, содержащих несколько GATC сайтов. Минимальные функциональные и структурные единицы SeqA представляет собой димер, тем самым объясняя требование по крайней мере два GATC последовательности, чтобы сформировать высоким сродством комплексе с ДНК hemimethylated 3. Кроме того, архитектура SeqA, с олигомеризации и ДНК-связывающих доменов, разделенных гибкий линкер, позволяющий привязки к GATC повторов, разделенных до трех винтовых поворотов. Таким образом, понимание функции SeqA на молекулярном уровне требует структурного Anaлизис SeqA связан с несколькими GATC последовательности. В белок-ДНК кристаллизации, ДНК может иметь никто не исключительный эффект на упаковке взаимодействий в зависимости от относительных размеров и архитектуры белков и ДНК. Если белка больше, чем ДНК или отпечатки большая часть ДНК, кристаллической упаковки в первую очередь опосредовано белок-белковых взаимодействий. И наоборот, когда белка такое же или меньшего размера, чем ДНК или она покрывает лишь часть ДНК, ДНК-ДНК и ДНК-белковых взаимодействий доминировать кристаллической упаковки. Таким образом, кристаллизация белок-ДНК комплексов требует систематического скрининга ДНК 4 длины и ДНК концами (тупым или навес) 5-7. В этом докладе мы опишем, как разрабатывать, оптимизировать, очистить и кристаллизуются hemimethylated дуплексов ДНК, содержащий тандем GATC повторяется в комплексе с димерный вариант SeqA (SeqAΔ (41-59)-A25R), чтобы получить кристаллы подходят для определения структуры.
Protocol
1. Очистки белков
Гибкий линкер подключения N-(олигомеризации) и C-терминал (связывание ДНК) областях SeqA средствами признание hemimethylated GATC повторяет отделена от одного до трех поворотов на ДНК. Для этого исследования мы использовали димерный вариант SeqA (SeqAΔ (41-59)-A25R) с точечной мутации в N-концевой домен, который предотвращает дальнейшее олигомеризации и сокращенный линкера, который ограничивает связывания ДНК в тандеме GATC повторяет отделена исключительно один оборот на ДНК (рис. 1) 2,8.
- Преобразование BL21 (DE3) с плазмидой SeqA кодирования под контролем промотора T7,
- Плита преобразования реакции в LB-агаром в том числе 100 мкг / мл ампициллина,
- Возьмите смешанные колонии привить мелким ночной культуры (LB среды с 100 мкг / мл ампициллина),
- На следующее утро привить 1 л массовой информации, использующих разведении 1:100 из ОверниGHT культуры,
- Рост клеток к OD 600 ~ 0,7 и вызывает производство белка добавлением изопропилового β-D-1-тиогалактопиранозид (IPTG) до конечной концентрации 1 мМ,
- Продолжить инкубации в течение 3 часов при 37 ° C с орбитальной встряхивании, а затем собрать клеток путем центрифугирования (10 мин при 3300 г),
- Ресуспендируют осадок клеток в очистку буфера и лизируют с помощью ультразвука,
- Снимите лизата центрифугированием (40 мин при 39000 г) и загрузить супернатанта на гепарин, уравновешенную очистки буфера,
- Elute SeqA с использованием линейного градиента до 1 М NaCl (SeqA элюируется ~ 0,7 М NaCl)
- Бассейн SeqA Фракции, содержащие вместе, развести, чтобы снизить ионной силы образца и нагрузки на катион-обменной хроматографии, уравновешенную очистки буфера,
- Использование линейного градиента соль, чистый SeqA элюируется на ~ 0,4 М NaCl,
- Бассейн SeqA Фракции, содержащие вместе, concentratе (3 мг / мл) и хранят в памяти буфера.
2. Очистки ДНК
- Заказ дополнительных неметилированный и метилированных олигонуклеотидов из ваших любимых компаний,
- Растворите 1 мкмоль лиофизированные одной нити ДНК в 800 мкл из автоклавного DDH 2 O, вихрь и оставьте на 10-20 мин,
- Добавить 800 мкл предварительно нагретого 2X буфером загрузки каждого олигонуклеотида,
- За 20-30 нуклеотидов олигонуклеотиды, подготовить большую 10% денатурации гель (160 х 250 х 1 мм):
* Тщательно перемешайте 80 мл 10% PAGE смеси, 80 мкл TEMED и 800 мкл персульфата аммония в гель и залить,
* После полимеризации удалите гребень и промыть лунки с DDH 2 O тщательно,
* Соберите гелей на гель литья в том числе охлаждающей пластиной, а затем заполнить верхний и нижний резервуары проточной буфера (1X TBE),
* Предварительно запуск геля на 700-750 V, чтобы нагреть гель до 55 ° C,
* Остановите перспективе и промыть лунки Thoroughly работает с буфером. - Нагрейте олигонуклеотидов до 90 ° C в течение 2 мин,
- Vortex и спина образцов и непосредственно перед загрузкой гель,
- Выполнить геля при ~ 700 В и остановить его, как только ваш олигонуклеотида перекочевал на полпути. (Заметим, что на 10% полиакриламидном геле бромфеноловый синий совместного мигрирует с олигонуклеотиды ~ 20 баз долго и ксилол cyanol FF с ~ 60 баз в длину),
- Остановить геля, разобрать его из геля и снимите распорки,
- На плоской поверхности, удалить одну стеклянную пластину и покрывают гелем полиэтиленовой пленкой,
- Поверните гель вокруг, удалить другие стеклом и накройте ее полиэтиленовой пленкой,
- Отметить полос с использованием УФ-светом и флуоресцентным пластине за гелем, чтобы увидеть ДНК тень,
- Отрежьте полосу с лезвием бритвы на небольшие куски и передавать их в стерильные 15 мл трубки,
- Добавить 9 мл буфера элюирования и элюирования в течение ночи при 37 ° C при перемешивании,
- Осторожно передать решениедля автоклавного трубки центрифуги помощью гель-загрузки пипетки, чтобы избежать переноса части акриламида и добавить 1 мл 3 М ацетата натрия при рН 7 (1:10) плюс 25 мл охлажденной 100% этанола (2,5 объема),
- Инкубировать при -20 ° C в течение 3 ч,
- Спином вниз и передать супернатанта в отдельную трубу,
- Сухой осадок на скорости переменного тока на среднем огне,
- Ресуспендируют осадок в 400 мкл из автоклавного DDH 2 O и перенести в новую пробирку,
- Добавить 40 мкл 3 М ацетата натрия при рН 7 и 1 мл 100% этанола, хорошо перемешать (вихрь) и инкубировать 30 минут при комнатной температуре, затем 30 мин при -20 ° C,
- Побочные в течение 15 мин при 18000 г и отбросить супернатант,
- Промойте осадок 100 мкл 70% холодного этанола для удаления остатков соли из гранул и спина в течение 6 мин при 18000 г. Откажитесь от этанола и сухой осадок на скорости переменного тока,
- Ресуспендируют гранул в общей сложности 100 мкл из автоклавного DDH
- Для отжига hemimethylated дуплексов ДНК, смешать эквимолярной концентрации дополнительного одной нити и нагреть смесь до 95 ° C на водяной бане в течение 5 мин и затем дайте им остыть медленно до комнатной температуры в водяной бане.
3. Белок-ДНК комплекса формирования и анализа
- Смешать в равных объемах очищенных SeqAΔ (41-59)-A25 (81 мкМ) и hemimethylated ДНК (81 мкм),
- Выдержите при комнатной температуре в течение 15 мин и хранят при 4 ° C, пока вы не готовы его использовать,
- Экран для условий кристаллизации с использованием коммерческих разреженных матриц экранов,
- После начальной приводит кристаллизации были выявлены, оптимизацию условий для выращивания кристаллов дифракция качества,
- Cryoprotect в результате SeqA-ДНК кристаллов путем увеличения количества PEG 400 присутствующих в кристаллизации решение до конечной концентрации 25% (V / V) или добавлением 20% глицерина (V / V) к кристаллизации раствора,
- Совок отдельные кристаллы с нейлоновой петлей, и флэш-заморозить их в жидком азоте,
- Проверьте дифракционный предел каждого кристалла при 100 К.
4. Представитель Результаты
Для получения кристаллической структуры SeqAΔ (41-59)-A25R связаны с hemimethylated ДНК, мы последовательно оптимизированы трех параметров на ДНК: (I) расстояние между hemimethylated GATC последовательности; (II) длиной дуплекс, и (III) отсутствие / наличие 5 'свесы.
Электро-подвижности анализы показывают, что сдвиг SeqAΔ (41-59)-A25R преимущественно связывается GATC повторяет разделенные на 9-10 пар оснований (рис. 1). Таким образом, мы изначально скрининг дуплексы 23-24 пар оснований (бит) длиной, содержащий два hemimethylated GATC последовательностей, разделенных либо 9 или 10 бит. Три дуплексы дали красиво формы кристаллов (рис. 2). Alхотя ни один из кристаллов дифрагированного с высоким разрешением, 23-бит долго дуплекс с двумя GATC сайтов разделенных на 9 б.п. дифрагированных рентгеновских лучей лучше, чем остальные, указывая, что GATC отделение из 9 бит был предпочтительнее для кристаллизации. Таким образом, мы установили между GATC расстоянии до 9 бит для всех последующих экранах.
Как правило, ДНК кристаллизации благоприятствует для двусторонней длины соответствующих точных винтовых поворотов, потому что несколько молекул ДНК может сложить головы к хвосту, образуя непрерывную B-ДНК внутри кристалла 9. Таким образом, мы сократили общую длину дуплексов на 21 базисных пунктов (то есть два спиральных витков). В то время как 21-бит дуплекс с тупыми концами не дал дифракционного качества кристаллов (данные не приводятся), что на 21 б.п. дуплекс с одной 5 'навеса нуклеотидной на каждом конце же дают кристаллы, которые дифрагированного до 5 А в нашем доме источник. Улучшение на дифракционный предел предположил, что из конца в конец дуплекс ассоциация была действительно способствуютния кристаллической упаковки.
С SeqA взаимодействует с GATC последовательностей, которые находятся на том же лице ДНК, противоположной стороне ДНК-дуплекса должно подвергаться воздействию растворителей. Для дальнейшего улучшения кристаллов комплекса, мы тогда изменение последовательности дуплекс включить динуклеотид CG между двумя GATC сайтов для продвижения паз-основа взаимодействия с соседними молекулами ДНК в кристалл на противоположной стороне дуплекса, метод , которые были использованы для повышения ДНК кристаллизации в прошлом 10. Тем не менее, дифракционный предел кристаллов, выращенных с CG-содержащих дуплекс было идентичны тем, которые выросли с аналогичным дуплексной ДНК, которые не содержат динуклеотид CG (рис. 3). Этот результат показал, что паз-основы взаимодействия не важно в данном случае. Впоследствии мы оптимизировали длина свесов, сравнивая кристаллов, выращенных с помощью ДНК-дуплекс, что было два дополнительных нуклеотидов в каждом5 'конца. Это изменение было резкое влияние на морфологию кристаллов, а также, дифракционный предел о том, что дополнительный нуклеотид резко изменилась молекулярных контактов и расширения организации кристалла (рис. 3).
Кристаллическая структура SeqAΔ (41-59)-A25R связаны с этим последним дуплексной ДНК подтвердил, что свободные лицо ДНК-дуплекса не участвует в кристалле контактов, как и ожидалось от ограниченного эффект от внедрения CG-динуклеотид. Несмотря на относительный размер белков и ДНК, большинство взаимодействий между симметрией товарищей опосредованы белок-белковых и белок-ДНК взаимодействия (рис. 4). Интересно, что в данном конкретном случае, положительный эффект динуклеотид свес 5 'не связано с формированием псевдо-непрерывные ДНК. Вместо этого, 5 'конца метилированных проектов пряди от оси ДНК и взаимодействует с молекулой проксимального SeqA комплекса, объясняя, почему два нуклеотида W прежде чем строго необходимо для изменения кристаллической упаковки 8,11.
Рисунок 1. Связывание SeqAΔ (41-59)-A25R в hemimethylated ДНК. (А) Схематическое изображение областей SeqA, что промежуточное олигомеризации белка и ДНК-связывающего. (B) методом сдвига электрофоретической подвижности SeqAΔ (41-59)-A25R с ДНК, содержащей два hemimethylated GATC последовательностей, разделенных большее число пар оснований ( X). Самая левая полоса (помеченный пустой) содержит эквимолярной смеси ДНК с 5, 7, 12, 21, 25 и 34 пар оснований между двумя GATC последовательности в отсутствие SeqAΔ (41-59)-A25R. (C) схему, изображающую трех переменных оптимизированы на дуплексов ДНК для получения кристаллов дифракция качества.
upload/4266/4266fig2.jpg "FO: содержание ширина =" 6in "FO: SRC =" / files/ftp_upload/4266/4266fig2highres.jpg "/>
Рисунок 2. Влияние изменения между GATC расстояния. Резюме олигонуклеотидов, используемых и полученных кристаллов с 23-24 б.п. долго дуплексов, содержащих два hemimethylated GATC сайтов, разделенных 9 или 10 пар оснований. Все фотографии кристаллов были сделаны в то же увеличением и шкалы указывает 100 мкм. Предел разрешающей способности каждого SeqAΔ (41-59)-A25R ДНК-кристалл на основе дифракционных картин, собранных на Rigaku RU-300 генератор рентгеновского излучения системы. Нажмите, чтобы увеличить показатель .
Рисунок 3. Влияние изменения ДНК заканчивается. Резюме тОн олигонуклеотидов, используемых и полученных кристаллов с 21 бит долго дуплексов, содержащих два hemimethylated GATC сайтов разделенных на 9 пар оснований и в том числе 0, 1 или 2 нуклеотидных 5 'свесы конца. Все фотографии кристаллов были сделаны в то же увеличением и шкалы указывает 100 мкм. Предел разрешающей способности каждого SeqAΔ (41-59)-A25R ДНК-кристалл на основе дифракционных картин, собранных на beamlines X12C и X29 (NSLS, BNL). Нажмите, чтобы увеличить показатель .
Рисунок 4. Кристаллической упаковки SeqAΔ (41-59)-A25R связывается с ДНК с динуклеотид навеса: При осмотре (A) сверху и сбоку (B). Асимметричный блок содержит два SeqAΔ (41-59)-A25R ДНК-комплексов, где белок представлен на сером в то время как ДНК показано оранжевым цветом. Симметричныхры связанных SeqAΔ (41-59)-A25R-молекул ДНК, приведены в белый для белка и желтый для ДНК. Эта цифра была подготовлена с использованием PyMOL 12. Этот показатель связан с Фильм 1. Нажмите, чтобы увеличить показатель .
Фильм 1. Щелкните здесь для просмотра фильмов .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Одна из самых больших проблем в макромолекулярных рентгеновской кристаллографии является получение кристаллов дифракция качества. В случае белок или белок-ДНК комплексов, эта задача осложняется из-за дополнительных переменных, которые должны быть оптимизированы. Широко распространено мнение, что длина ДНК и наличия липкие выступы для повышения объединение соседних молекул ДНК в более псевдо-дуплекс являются основными параметрами для оптимизации. Тем не менее, мы показали, что характер и продолжительность этих выступов может иметь дополнительные эффекты на кристалле упаковки белок-ДНК комплекса. Хотя этот протокол был разработан для кристаллизации SeqA-ДНК, оптимизации длины ДНК, последовательность и концы обеспечивает общую основу для рационального проектирования олигонуклеотидов для кристаллизации любого ДНК-белкового комплекса.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Авторы выражают благодарность сотрудникам PXRR NSLS (Brookhaven National Laboratory) за помощь в сборе данных и Моника Pillon за помощь очистки ДНК. Эта работа была поддержана канадского института исследований в области здравоохранения (MOP 67189).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TRIS | Bioshop | TRS003.5 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | E478-500 | |
| Dithiotheitrol (DTT) | Bio Basic Inc. | DB0058 | |
| NaCl | Bioshop | SOD002.10 | |
| Glycerol | Caledon | 5350-1 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016-500G | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Bioshop | SDS001.500 | |
| Urea | Bioshop | URE001.5 | |
| 40% 29:1 Bis/acrylamide | Bio Basic Inc. | A0007-500ml | Store at 4 °C |
| Boric acid | EMD | BX0865-1 | |
| Xylene cyanol FF | Bio-Rad | 161-0423 | |
| Bromophenol Blue | Bioshop | BR0222 | |
| Dual Adjustable Vertical Gel System | C.B.C. Scientific Company Inc. | DASG-250 | |
| Index crystallization screen | Hampton Research | HR2-144 | Store at 4 °C |
| Wizard I crystallization screen | Emerald BioSystems | EBS-WIZ-1 | Store at 4 °C |
| Wizard II crystallization screen | Emerald BioSystems | EBS-WIZ-2 | Store at 4 °C |
| Classics crystallization screen | Qiagen | 130701 | Store at 4 °C |
| Intelliplate trays | Art Robbins Instruments | 102-0001-00 | |
Solutions Protein purification buffer: 100 mM TRIS pH 8, 2 mM EDTA, 2 mM DTT and 5% glycerol. Protein storage buffer: 20 mM TRIS pH 8, 150 mM NaCl, 5 mM DTT, 0.5 mM EDTA and 5% glycerol. Gel loading mix: Add 20 g of sucrose, 25 mg of bromophenol blue, 25 mg of xylene cyanol FF, 1 ml of 10% w/v SDS and 10 ml of 10X TBE to 70 ml of autoclaved ddH2O. Stir with mild heating until sucrose is dissolved and adjust the final volume to 100 ml with autoclaved ddH2O. Store at 4 °C. 2X loading buffer: Add 11 g of urea to 10 ml of gel loading mix. Stir on a hot plate until urea dissolves. Aliquot in 2 ml tubes and store at 4 °C. 10X PAGE mix: Mix 420.4 g of urea, 100 ml of 10X TBE (autoclaved), 250 ml of 40% 29:1 Bis/Acrylamide in ddH2O. Stir until totally dissolved and adjust volume to 1 liter. Store in dark bottles at 4 °C. 10X TBE: Dissolve 108 g of TRIS, 55 g of boric acid and 9.3 g of EDTA in 1 liter of ddH2O. Autoclave and store at room temperature. Elution buffer: Dilute 8 ml of 5 M NaCl, 2 ml of 1 M TRIS pH 7.5, 0.4 ml of 0.5 M EDTA pH 8 on 200 ml of ddH2O. Autoclave and store at room temperature. |
|||
References
- Campbell, J. L., Kleckner, N. E. coli oriC and the dnaA gene promoter are sequestered from dam methyltransferase following the passage of the chromosomal replication fork. Cell. 62, 967-979 (1990).
- Guarné, A. Crystal structure of a SeqA-N filament: implications for DNA replication and chromosome organization. Embo. J. 24, 1502-1511 (2005).
- Brendler, T., Austin, S. Binding of SeqA protein to DNA requires interaction between two or more complexes bound to separate hemimethylated GATC sequences. Embo. J. 18, 2304-2310 (1999).
- Jordan, S. R., Whitcombe, T. V., Berg, J. M., Pabo, C. O. Systematic variation in DNA length yields highly ordered repressor-operator cocrystals. Science. 230, 1383-1385 (1985).
- Tan, S., Hunziker, Y., Pellegrini, L., Richmond, T. J. Crystallization of the yeast MATalpha2/MCM1/DNA ternary complex: general methods and principles for protein/DNA cocrystallization. J. Mol. Biol. 297, 947-959 (2000).
- Rice, P. A., Yang, S., Mizuuchi, K., Nash, H. A. Crystal structure of an IHF-DNA complex: a protein-induced DNA U-turn. Cell. 87, 1295-1306 (1996).
- Yang, W., Steitz, T. A. Crystal structure of the site-specific recombinase gamma delta resolvase complexed with a 34 bp cleavage site. Cell. 82, 193-207 (1995).
- Chung, Y. S., Brendler, T., Austin, S., Guarne, A. Structural insights into the cooperative binding of SeqA to a tandem GATC repeat. Nucleic Acids Res. , (2009).
- Anderson, J., Ptashne, M., Harrison, S. C. Cocrystals of the DNA-binding domain of phage 434 repressor and a synthetic phage 434 operator. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 1307-1311 (1984).
- Timsit, Y., Moras, D. DNA self-fitting: the double helix directs the geometry of its supramolecular assembly. Embo J. 13, 2737-2746 (1994).
- Chung, Y. S., Guarne, A. Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of SeqA bound to a pair of hemimethylated GATC sites. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 64, 567-571 (2008).
- DeLano, W. L. The PyMOL Molecular Graphic Systems. , DeLano Scientific. (2002).
