Summary
蛋白质-DNA复合物的晶体结构，可以提供蛋白质的功能，机制，以及特定的相互作用的性质的洞察。这里，我们报告如何优化共结晶与双链DNA的长度，序列和两端
Abstract
大肠杆菌 SeqA是一个负调节DNA复制，以防止过 早封存半甲基化的GATC集群内再引发事件的起源，复制1。除了 原点，SeqA被发现在复制叉，它举办新复制的DNA到更高的有序结构。 SeqA联营公司只有微弱的单GATC序列，但它形成高亲和力DNA双链包含多个GATC网站的配合。功能和结构的最小单元SeqA一个二聚体，由此说明的要求中的至少两个的GATC序列与半甲基化DNA的3形成的高亲和性的络合物。此外，SeqA的体系结构，与低聚和由柔性连接器分离的DNA结合结构域，允许绑定GATC重复分离最多三螺旋匝。因此，在分子水平上理解的功能SeqA需要的结构模拟裂解SeqA绑定到多个GATC序列。在蛋白质-DNA结晶，DNA可以没有一个特殊的效果取决于蛋白质和DNA的相对大小和体系结构在包装上的相互作用。如果蛋白质的DNA或脚印大多数的DNA的比大时，晶体堆积主要是介导的蛋白质 - 蛋白质相互作用。相反，当该蛋白质是相同的尺寸或小于该DNA，或者它仅覆盖的一小部分的DNA，DNA-DNA和DNA-蛋白质相互作用支配晶体包装。因此，蛋白质-DNA复合物的结晶化需要的DNA长度为4的系统的筛选和DNA末端（钝或悬）5-7。在这份报告中，我们将介绍如何设计，优化，净化，结晶半甲基化DNA双链串联GATC重复复杂的二聚体的变种SeqA（SeqAΔ（41-59）-A25R），以获得合适的晶体结构的决心。
Protocol
1。蛋白质纯化
的柔性连接器连接的N-（低聚化）和C-末端（DNA结合）域的SeqA辅助识别由一至三个匝上的DNA分离的半甲基化的GATC重复。在这项研究中，我们使用了二聚体的变种SeqA（SeqAΔ（41-59）-A25R）的N-端结构域的点突变，防止进一步寡聚化和DNA结合的串联GATC重复分离完全由一个的缩短链接器限制一匝的DNA上（ 图1）2,8。
- 与质粒编码SeqA的T7启动子的控制下，变换的BL21（DE3）细胞，
- 板包括100μg/ ml氨苄青霉素的LB-琼脂平板上的转化反应中，
- 任选混合菌落接种到一个小规模的过夜培养物（LB培养基，用100微克/毫升氨苄青霉素），
- 第二天早晨，接种1 L的媒体采用1:100的稀释度的overniGHT文化，
- 生长细胞的OD 600〜0.7，通过加入异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）至终浓度为1mM，诱导蛋白质的生产
- 与轨道摇动，在37℃下继续培养3小时，然后通过离心收集细胞（10分钟3300克），
- 重悬细胞沉淀，净化缓冲液A中，并通过超声裂解，
- 清除的溶胞产物通过离心（40分钟39000克），并加载到肝素柱纯化缓冲液平衡的上清液，
- 厄鲁特SeqA 1 M氯化钠（SeqA洗脱在〜0.7 M氯化钠），用线性梯度
- 游泳池SeqA含馏分一起，稀释至样品的离子强度和负载降低到纯化缓冲液平衡的阳离子交换层析柱，
- 使用的线性盐梯度，纯SeqA〜0.4M的NaCl的洗脱，
- 游泳池的SeqA含部分，concentratE（3毫克/毫升），并存储在存储缓冲器中。
2。 DNA的纯化
- 订购互补的未甲基化和甲基化寡核苷酸从您最喜爱的公司，
- 1μmol的每个冻干的单链DNA溶解于800μl的灭菌DDH 2 O，涡让它坐10-20分钟，
- 预热2X上样缓冲液中加入800μl的每个寡核苷酸，
- 20-30个核苷酸的寡核苷酸，准备一个大10％的变性凝胶（160×250×1毫米）：
*拌匀，倒80毫升10％PAGE组合，80μLTEMED和800μL过硫酸铵每凝胶，
*聚合后，取出梳子和DDH 2 O彻底冲洗井，
*组装凝胶凝胶铸造包括冷却板，然后填充有运行缓冲液（1X TBE缓冲液）的顶部和底部的水库，
*预运行凝胶在700-750 V温暖的凝胶，高达55°C，
*停止运行，冲洗井thoroughly与运行缓冲液。 - 的寡核苷酸加热至90℃，持续2分钟，
- 涡街流量计和旋样品，并立即装货前的凝胶，
- 〜700 V和运行的凝胶，一旦你的寡核苷酸迁移中途停止。 （请注意，在10％聚丙烯酰胺凝胶的溴酚蓝共迁移与〜20个碱基长，和二甲苯青FF〜60个碱基长的寡核苷酸），
- 停止凝胶，拆解从凝胶中删除的间隔，
- 在一个平坦的表面，除去一块玻璃板，并用保鲜膜覆盖凝胶，
- 将周围的凝胶，删除其他的玻璃板，并用保鲜膜覆盖，
- 标记带紫外光和荧光板背后的凝胶看到的DNA阴影，
- 用剃刀刀片切带切成小块，并将它们传送到一个无菌的15毫升的试管中，
- 加入9毫升的洗脱缓冲液洗脱，边搅拌边在37℃下过夜，
- 小心地将溶液转移蒸压使用凝胶加载的移液管尖，以避免传输的丙烯酰胺件和添加3M乙酸钠（1:10稀释）在pH为7的1毫升，冰鲜100％乙醇（2.5体积）中加25毫升的离心管，
- 在-20℃下孵育至少3小时，
- 自旋向下，将上清转移到一个单独的管，
- 干燥沉淀的速度，真空中火，
- 将沉淀重悬于400μl的灭菌DDH 2 O，并转移到一个新的管，
- 加入40μl的3M醋酸钠在pH 7和1毫升100％乙醇;拌匀（涡流），并在室温下孵育30分钟，然后在-20℃下30分钟，
- 旋转为15分钟18000克和弃去上清液，
- 用100微升70％冷乙醇洗涤沉淀，在18000克的6分钟，以除去残留的盐从粒料和自旋。弃乙醇和速度真空干燥沉淀，
- 重悬沉淀共100μl的灭菌DDH
- 要退火的半甲基化的DNA双链，混合等摩尔浓度的互补单链，并加热该混合物至95℃，在水浴中5分钟，然后让它们慢慢冷却至室温的内部温度的水浴。
3。蛋白质-DNA复合物的形成与分析
- 混合纯化SeqAΔ相等体积的（41-59）-A25（81μM）和半甲基化的DNA（81μM），
- 在室温下孵育15分钟并存储在4°C，直到您准备使用它，
- 屏幕的结晶条件下使用商业稀疏矩阵屏幕，
- 一旦初始结晶线索已经确定，优化的条件下成长衍射晶体，
- Cryoprotect所得SeqA-DNA的晶体通过增加的量的结晶溶液中至最终浓度为25％的PEG 400本（体积/体积）或到的结晶溶液中加入20％甘油（V / V），
- 炒到单独的晶体用尼龙的循环，和闪存的在液氮中冻结，
- 测试，在100 K，每个晶体的衍射极限
4。代表性的成果
要获得的晶体结构SeqAΔ（41-59）-A25R绑定到半甲基化的DNA，我们连续优化的DNA上的三个参数：（ⅰ）分离半甲基化的GATC序列之间，（ii）长度的双面;及（iii）的没有/ 5'突出存在的。
电迁移率变动分析表明SeqAΔ（41-59）-A25R优先结合GATC重复由9-10个碱基对（ 图1）隔开。因此，我们初步筛选复式月23-24个碱基对（BPS）long，它包含两个分离的半甲基化的GATC序列由9或10个基点。三复式取得了很好的板状结晶（ 图2）。铝虽然没有高分辨率的晶体衍射，23个基点长全双工与两个GATC网站，相隔9个基点衍射的X射线比其他人更好，这表明，GATC首选的结晶分离的9个基点。因此，我们固定的间GATC的间距为9个基点，随后的所有画面。
一般来说，DNA结晶为双面的长度对应于精确的螺旋匝的青睐，因为可以堆叠多个DNA分子的头-尾，以形成连续的B-DNA内的晶体9。因此，我们缩短的双链体的总长度，以21个基点（ 即两个螺旋圈）。虽然21个基点复式两端钝圆并没有产生衍射晶体（数据未显示），21个基点复式一个5'突出核苷酸的每一端，并产生晶体的衍射5Å在我们的主场源。上的衍射极限的改进建议，端至端的双工关联确实利于ING水晶包装。
由于SeqA与GATC序列的DNA，在同一面上，交互的DNA双链的相反面应暴露于溶剂。为了进一步提高复合物的结晶的，我们再修改的序列包括两个GATC站点之间的CG二核苷酸与相邻的DNA分子在晶体促进槽骨干的相互作用，通过相反侧的面的双面，方法的双工已被用于提高DNA在过去10结晶。然而，含CG-双工与生长的晶体的衍射极限是具有类似的DNA双链中不包含的CG二核苷酸（ 图3）生长的那些相同。这一结果表明，槽骨干相互作用是在这种情况下，并不重要。其后，我们通过比较，在每个有两个额外的核苷酸与DNA双链的晶体生长优化的悬伸长度5'末端。这种变化有重大影响的晶体形态，以及表明的额外核苷酸极大地改变了分子接触和增强的晶体组织（ 图3），衍射极限。
这最后的确认，不从事晶体接触的自由面的DNA双螺旋的DNA双螺旋结合的晶体结构SeqAΔ（41-59）A25R，如预期推出的CG二核苷酸的效果有限。尽管蛋白质和DNA的相对大小，对称配合的大部分之间的相互作用介导的蛋白质-蛋白质，蛋白质-DNA相互作用（ 图4）。有趣的是，在这个特殊的情况下，一个5'二核苷酸悬的有益效果是没有由于形成伪连续DNA。相反，在5'末端的甲基化链项目远离的DNA轴并与之交互的复杂的近端SeqA分子，解释为什么两个核苷酸瓦特 ERE严格要求改变晶体包装8,11。
图1。半甲基化DNA结合SeqAΔ（41-59）A25R。 （A）示意图的领域SeqA，介导蛋白质寡聚化和DNA结合。（B）电泳迁移率变动分析受到越来越多的碱基对分开的两个半甲基化的GATC序列的DNA片段包含的SeqAΔ（41-59）A25R（ X）。最左侧的车道（标记为空白）包含与5的等摩尔混合物的DNA，7，12，21，25和34个碱基对没有SeqAΔ（41-59）之间的两个GATC序列A25R。（C）的图中描绘了三个变量的DNA双链上进行了优化，以获得衍射晶体。
upload/4266/4266fig2.jpg“佛：内容的宽度=”6英寸的FO：src =“/ files/ftp_upload/4266/4266fig2highres.jpg”/>
图2。间GATC的距离。摘要23日至24日bp的复式含9个或10个碱基对分开的两个半甲基化的GATC网站获得的寡核苷酸和晶体不同的影响 。所有图片晶体在相同的放大倍率和规模栏显示为100微米。分辨率极限每个SeqAΔ（41-59）A25R-DNA晶体在Rigaku RU-300 X-射线发生器系统的基础上收集衍射图像。 点击此处查看大图 。
图3。改变DNA的影响结束。摘要吨他用寡核苷酸，获得的晶体，用21个基点长双链含有分离两个半甲基化的GATC网站，由9个碱基对，并包括0，1或2个核苷酸的5'末端出挑。所有图片晶体在相同的放大倍率和规模栏显示为100微米。分辨率极限每个SeqAΔ（41-59）-A25R-DNA晶体在光束线X12C和X29（NSLS，BNL）的基础上收集衍射图像。 点击此处查看大图 。
图4。水晶包装SeqAΔ（41-59）-A25R绑定到DNA核苷酸悬：从（A）顶部和侧面（B）。的不对称单位包含两个SeqAΔ（41-59）-A25R-DNA复合物，其中的蛋白质以灰色显示，而该DNA以橙色显示。对称Ry的：相关SeqAΔ（41-59）-A25R-DNA分子以白色表示的蛋白质和黄色的DNA。本图是使用PyMOL 12。这个数字与动画1。 点击此处查看大图 。
动画1。 点击这里观看电影 。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
高分子X射线晶体学面临的最大挑战之一是获得衍射晶体。在蛋白质或蛋白质-DNA复合物的情况下，这一挑战，加剧了由于必须进行优化的附加变量。人们普遍相信，相邻的DNA分子，在更长的伪全双工的主要参数进行优化以提高关联的DNA的长度和存在的粘出挑。然而，我们已经表明，这些悬伸的性质及长度可以有额外的影响的蛋白质-DNA复合物的晶体堆积。虽然这个协议设计的合理设计的寡核苷酸为任何DNA-蛋白复合物的结晶，结晶SeqA-DNA复合物，DNA长序列和结束的优化提供了一个通用的框架。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
作者希望帮助DNA纯化感谢PXRR的工作人员在布鲁克海文国家实验室NSLS（）数据收集过程中的协助和莫妮卡皮隆方面奔去。这项工作是由加拿大卫生研究院（67189澳门元）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TRIS | Bioshop | TRS003.5 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | E478-500 | |
| Dithiotheitrol (DTT) | Bio Basic Inc. | DB0058 | |
| NaCl | Bioshop | SOD002.10 | |
| Glycerol | Caledon | 5350-1 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016-500G | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Bioshop | SDS001.500 | |
| Urea | Bioshop | URE001.5 | |
| 40% 29:1 Bis/acrylamide | Bio Basic Inc. | A0007-500ml | Store at 4 °C |
| Boric acid | EMD | BX0865-1 | |
| Xylene cyanol FF | Bio-Rad | 161-0423 | |
| Bromophenol Blue | Bioshop | BR0222 | |
| Dual Adjustable Vertical Gel System | C.B.C. Scientific Company Inc. | DASG-250 | |
| Index crystallization screen | Hampton Research | HR2-144 | Store at 4 °C |
| Wizard I crystallization screen | Emerald BioSystems | EBS-WIZ-1 | Store at 4 °C |
| Wizard II crystallization screen | Emerald BioSystems | EBS-WIZ-2 | Store at 4 °C |
| Classics crystallization screen | Qiagen | 130701 | Store at 4 °C |
| Intelliplate trays | Art Robbins Instruments | 102-0001-00 | |
Solutions Protein purification buffer: 100 mM TRIS pH 8, 2 mM EDTA, 2 mM DTT and 5% glycerol. Protein storage buffer: 20 mM TRIS pH 8, 150 mM NaCl, 5 mM DTT, 0.5 mM EDTA and 5% glycerol. Gel loading mix: Add 20 g of sucrose, 25 mg of bromophenol blue, 25 mg of xylene cyanol FF, 1 ml of 10% w/v SDS and 10 ml of 10X TBE to 70 ml of autoclaved ddH2O. Stir with mild heating until sucrose is dissolved and adjust the final volume to 100 ml with autoclaved ddH2O. Store at 4 °C. 2X loading buffer: Add 11 g of urea to 10 ml of gel loading mix. Stir on a hot plate until urea dissolves. Aliquot in 2 ml tubes and store at 4 °C. 10X PAGE mix: Mix 420.4 g of urea, 100 ml of 10X TBE (autoclaved), 250 ml of 40% 29:1 Bis/Acrylamide in ddH2O. Stir until totally dissolved and adjust volume to 1 liter. Store in dark bottles at 4 °C. 10X TBE: Dissolve 108 g of TRIS, 55 g of boric acid and 9.3 g of EDTA in 1 liter of ddH2O. Autoclave and store at room temperature. Elution buffer: Dilute 8 ml of 5 M NaCl, 2 ml of 1 M TRIS pH 7.5, 0.4 ml of 0.5 M EDTA pH 8 on 200 ml of ddH2O. Autoclave and store at room temperature. |
|||
References
- Campbell, J. L., Kleckner, N. E. coli oriC and the dnaA gene promoter are sequestered from dam methyltransferase following the passage of the chromosomal replication fork. Cell. 62, 967-979 (1990).
- Guarné, A. Crystal structure of a SeqA-N filament: implications for DNA replication and chromosome organization. Embo. J. 24, 1502-1511 (2005).
- Brendler, T., Austin, S. Binding of SeqA protein to DNA requires interaction between two or more complexes bound to separate hemimethylated GATC sequences. Embo. J. 18, 2304-2310 (1999).
- Jordan, S. R., Whitcombe, T. V., Berg, J. M., Pabo, C. O. Systematic variation in DNA length yields highly ordered repressor-operator cocrystals. Science. 230, 1383-1385 (1985).
- Tan, S., Hunziker, Y., Pellegrini, L., Richmond, T. J. Crystallization of the yeast MATalpha2/MCM1/DNA ternary complex: general methods and principles for protein/DNA cocrystallization. J. Mol. Biol. 297, 947-959 (2000).
- Rice, P. A., Yang, S., Mizuuchi, K., Nash, H. A. Crystal structure of an IHF-DNA complex: a protein-induced DNA U-turn. Cell. 87, 1295-1306 (1996).
- Yang, W., Steitz, T. A. Crystal structure of the site-specific recombinase gamma delta resolvase complexed with a 34 bp cleavage site. Cell. 82, 193-207 (1995).
- Chung, Y. S., Brendler, T., Austin, S., Guarne, A. Structural insights into the cooperative binding of SeqA to a tandem GATC repeat. Nucleic Acids Res. , (2009).
- Anderson, J., Ptashne, M., Harrison, S. C. Cocrystals of the DNA-binding domain of phage 434 repressor and a synthetic phage 434 operator. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 1307-1311 (1984).
- Timsit, Y., Moras, D. DNA self-fitting: the double helix directs the geometry of its supramolecular assembly. Embo J. 13, 2737-2746 (1994).
- Chung, Y. S., Guarne, A. Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of SeqA bound to a pair of hemimethylated GATC sites. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 64, 567-571 (2008).
- DeLano, W. L. The PyMOL Molecular Graphic Systems. , DeLano Scientific. (2002).
