Summary
מבנה הגבישי של קומפלקסים-DNA חלבון יכול לספק תובנות לגבי תפקוד חלבון, מנגנון, כמו גם, את אופי האינטראקציה הספציפית. כאן, אנו מדווחים איך לייעל את האורך, רצף וקצוות של DNA דופלקס להתגבשות שיתוף עם
Abstract
Escherichia coli SeqA הוא רגולטור שלילי של שכפול הדנ"א שמונע פגי אירועי reinitiation לפי אשכולות GATC hemimethylated sequestering בתוך המקור של שכפול 1. מעבר למקור, SeqA נמצא במזלגות שהכפולים, שבו הוא מארגן את ה-DNA המשוכפל חדשה למבנים מסודרים גבוהים יותר 2. מקורבי SeqA רק בחולשה עם רצפי GATC בודדים, אבל הוא יוצר קומפלקסי זיקה גבוהות עם דופלקסים DNA המכילים אתרי GATC מרובים. היחידה התפקודית ומבנית המינימאלית של SeqA היא דימר, ובכך הסבירה את הדרישה של לפחות שני רצפי GATC כדי ליצור מורכבות-זיקה גבוהה עם DNA hemimethylated 3. בנוסף, ארכיטקטורת SeqA, עם oligomerization ותחומי ה-DNA מחייבים מופרדים מקשר גמיש, מאפשרת מחייבת לחוזר GATC המופרד עד שלושה סיבובי סליל. לפיכך, הבנת הפונקציה של SeqA ברמה מולקולרית דורשת ana המבניתמוגה של SeqA חייבת רצפי GATC מרובים. בהתגבשות החלבון ה-DNA, ה-DNA יכול להיות אף להשפעה יוצאת דופן על אינטראקציות האריזה בהתאם לגדלים והארכיטקטורה היחסיים של החלבונים והדנ"א. אם החלבון הוא גדול יותר מאשר ה-DNA או טביעות רגליים של רוב ה-DNA, אריזת הגביש מתווכת בעיקר על ידי אינטראקציות בין חלבונים. לעומת זאת, כאשר החלבון הוא באותו גודל או קטן יותר מאשר DNA או שהוא מכסה חלק קטן של ה-DNA, ה-DNA DNA-DNA וחלבון האינטראקציות רק שולט אריזת גביש. לכן, התגבשות של קומפלקסים-DNA חלבון דורשת הקרנה השיטתית של 4 אורך הדנ"א ומסתיים DNA (בוטה או סככה) 5-7. בדו"ח זה, אנו מתארים כיצד לעצב, לייעל, לטהר ולהתגבש דופלקסים DNA המכילים hemimethylated חוזר טנדם GATC במתחם בוריאצית dimeric של SeqA (SeqAΔ (41-59)-A25R) כדי לקבל גבישים מתאימים לקביעת מבנה.
Protocol
1. טיהור חלבון
המקשר הגמיש חיבור N-(oligomerization) ו-C-מסוף (DNA המחייב) תחומי SeqA עזרי ההכרה חוזרת GATC hemimethylated המופרד 02:59 מדליק את ה-DNA. במחקר זה, שהייתי גרסה של dimeric SeqA (SeqAΔ (41-59)-A25R) עם מוטציה נקודתית בתחום N-המסוף המונעת המשך oligomerization ומקשר קצר שמגביל את ה-DNA המחייבת לטנדם GATC חוזר מופרדת באופן בלעדי על ידי סיבוב אחד בדנ"א (איור 1) 2,8.
- מרה (DE3) BL21 תאים עם SeqA הקידוד פלסמיד תחת השליטה של אמרגן T7,
- צלחת השינוי בתגובת צלחות LB-אגר כולל 100 מיקרוגרם / המ"ל אמפיצילין,
- פיק מושבות מעורבות לחסן תרבות לילה בקנה מידה הקטנה (תקשורת LB עם 100 מיקרוגרם / המ"ל אמפיצילין),
- למחרת בבוקר לחסן 1 ליטר של מדיה באמצעות דילול של 1:100 overniתרבות ght,
- לגדל את התאים לOD 600 של ~ 0.7 ולגרום לייצור חלבון על ידי תוספת של איזופרופיל β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) לריכוז סופי של 1 מ"מ,
- המשך הדגירה של 3 שעות ב 37 ° C עם רעד מסלולית ולאחר מכן לקצור את התאים על ידי צנטריפוגה (10 דקות ב 3300 ז),
- Resuspend תא הגלול במאגר הטיהור וlyse ידי sonication,
- נקה lysate ידי צנטריפוגה (40 דקות ב 39000 ז) ולטעון את supernatant על עמודה מתאזנת עם חיץ הטיהור הפרין,
- Elute SeqA באמצעות שיפוע ליניארי לM NaCl 1 (SeqA elutes ב ~ 0.7 מ 'NaCl),
- ברכה את שברי SeqA המכילים יחד, לדלל להנמיך את העוצמת היונית של המדגם ועומס בעמודת כרומטוגרפיה קטיון מטבע מתאזן עם חיץ טיהור,
- שימוש בשיפוע מלח ליניארי, SeqA הטהור elutes ב ~ 0.4 מ 'NaCl,
- ברכה את שברי SeqA המכילים יחד, concentratדואר (3 מ"ג / מ"ל) וחנות במאגר האחסון.
2. טיהור DNA
- להזמין oligonucleotides unmethylated והמפוגל משלימים מהחברה האהובה עליך,
- ממס μmol 1 מתוך כל דנ"א גדיל הבודד lyophilized בשנת 800 μl של autoclaved DDH 2 O, מערבולת ולתת לו לשבת במשך 10-20 דקות,
- הוסף 800 μl של חיץ הטעינה 2X חומם מראש לכל oligonucleotide,
- למשך 20-30 נוקלאוטידים oligonucleotides הארוך, להכין 10% ג'ל denaturing גדול (160 x 250 x מ"מ 1):
* מערבב היטב 80 מ"ל של 10% תמהיל PAGE, TEMED 80 μl וpersulfate אמוניום μl 800 לג'ל ולשפוך,
* מפולמר פעם, להסיר את המסרק ולשטוף את הבארות עם DDH 2 O ביסודיות,
* הרכיב את הג'לי על גבס ג'ל כולל צלחת קירור ולאחר מכן למלא את המאגרים העליונים ותחתונים עם ריצת חיץ (1X TBE),
* מראש להפעיל את הג'ל ב700-750 V כדי לחמם את הג'ל עד 55 מעלות צלזיוס,
* תפסיק לרוץ ולשטוף בארות thoroughly עם ריצת חיץ. - מחמם את oligonucleotides עד 90 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות,
- מערבולת ולסובב את הדגימות ומייד לפני טעינת ג'ל,
- הפעל את הג'ל ב~ 700 V ולעצור אותו הפעם אחת oligonucleotide הגר באמצע הדרך. (שים לב שעל 10% ג'ל polyacrylamide הכחול bromophenol שיתוף נודד עם oligonucleotides ~ 20 בסיסים ארוכים וקסילן cyanol FF עם ~ 60 בסיסים ארוכים),
- עצור את הג'ל, לפרק אותו מתיבת ג'ל ולהסיר את המפרידים,
- על משטח שטוח, הסר צלחת זכוכית אחת ולכסות את הג'ל בניילון נצמד,
- הפעל את הג'ל בסביבה, להסיר את צלחת זכוכית האחרת ולכסות אותו בניילון נצמד,
- סמן את הרצועות באמצעות אור UV וצלחת ניאון מאחורי הג'ל לראות את צל ה-DNA,
- לחתוך את הרצועה בסכין גילוח לחתיכות קטנות ולהעביר אותם לתוך צינור מ"ל סטרילי 15,
- הוסף 9 מ"ל של חיץ elution וelute לילה על 37 מעלות צלזיוס עם תסיסה,
- בזהירות להעביר את הפתרוןלצינור צנטריפוגה autoclaved באמצעות קצה פיפטה ג'ל טעינה כדי למנוע חתיכות acrylamide מעבירים ולהוסיף 1 מ"ל של נתרן יצטט M 3 ב-pH 7 (1:10 דילול) בתוספת 25 מ"ל של אתנול 100% מצונן (2.5 כרכים),
- דגירה ב -20 ° C לפחות 3 שעות,
- ספין למטה ולהעביר את supernatant לצינור נפרד,
- ייבש את הכדור במהירות-VAC בחום בינוני,
- Resuspend גלול ב 400 μl של autoclaved DDH 2 O ולהעביר לצינור טרי,
- הוסיפו 40 μl יצטט M 3 נתרן בשעת 7 pH ו1 מ"ל של אתנול 100%; מערבב היטב (מערבולת) ודגירה 30 דקות בטמפרטורת חדר ואחרי 30 דקות ב -20 ° C,
- ספין במשך 15 דקות ב18,000 גרמו וזורק supernatant,
- שטוף את הכדור עם 100 μl של אתנול קר 70% להסיר מלח השיורי מהגלולה והספין ל6 דקות ב18,000 גרמו. השלך אתנול ולייבש את הגלולה במהירות-VAC,
- Resuspend הגלולה בסך של 100 μl של autoclaved DDH
- כדי לחשל את דופלקסים DNA hemimethylated, לערבב ריכוזי equimolar של גדילים המשלימים ולחמם את התערובות עד 95 מעלות צלזיוס באמבט מים למשך 5 דקות ולאחר מכן לתת להם להתקרר לטמפרטורת חדר באיטיות בתוך אמבט המים.
3. חלבון ה-DNA גיבוש וניתוח מורכב
- לערבב כמויות שווות של המטוהרים SeqAΔ (41-59)-A25 (81 מיקרומטר) ודנ"א hemimethylated (81 מיקרומטר),
- דגירה בטמפרטורת חדר למשך 15 דקות ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס עד שיהיו מוכנים להשתמש בו,
- מסך לתנאי התגבשות באמצעות מסכי מסחר דליל מטריצה,
- ברגע שמוביל התגבשות ראשוני זוהה, לייעל את התנאים לגדל גבישים באיכות עקיפה,
- Cryoprotect גבישי תוצאת SeqA-DNA או על ידי הגדלת הכמות של 400 הווה PEG בפתרון ההתגבשות לריכוז סופי של 25% (v / v) או הוספת גליצרול 20% (v / v) לפתרון ההתגבשות,
- סקופ גבישים בודדים עם לולאת ניילון, ותקפיא אותם בחנקן נוזלי,
- בדוק את גבול ההשתברות של כל גביש ב 100 ק
4. נציג תוצאות
כדי להשיג את המבנה הגבישי של SeqAΔ (41-59)-A25R הקשור ל-DNA hemimethylated, אנו רציפות מותאמת שלושה פרמטרים על ה-DNA: (i) הפרדה בין רצפי GATC hemimethylated (ii) אורך של הדופלקס וכן (iii) היעדרות / הנוכחות מסוכך 5 '.
מבחני משמרת אלקטרו ניידות עולים כי SeqAΔ (41-59)-A25R מעדיף נקשר חוזרת GATC מופרד 9-10 זוגות בסיסים (איור 1). לכן, אנחנו בהתחלה הוקרנו דופלקסים 23-24 זוגות בסיסים (סל"ש) ארוך המכילים שני רצפי GATC hemimethylated מופרד או 9 או 10 סיביים לשנייה. שלושה דופלקסים הניבו גבישים יפים בצורה (איור 2). אללמרות שאיש מגבישי diffracted לרזולוציה גבוהה, 23 bps הארוך דופלקס עם שני אתרי GATC המופרדים ב9 סל"ש מתפזר טוב יותר משאר צילומי רנטגן, המציין כי הפרדת GATC של 9 סל"ש הועדפה להתגבשות. לכן, סדר את המרווח בין GATC עד 9 סל"ש לכל המסכים שלאחר מכן.
באופן כללי, התגבשות DNA היא העדיף לאורכים מתאימים למדויקים סיבובי סליל דופלקס כי מולקולות דנ"א מרובות יכולות לערום את הראש אל זנב בצורת B-DNA מתמשך בתוך 9 גביש. לכן, אנו קצרנו את האורך הכולל של עד 21 דופלקסים סל"ש (שני סיבובים כלומר סליל). בעוד דופלקס 21 סל"ש עם קצוות קהים לא הניב גבישים עקיפים איכותיים (מידע לא מוצג), דופלקס 21 סיבי לשנייה עם סככת 5 'נוקלאוטיד יחידה בכל קצה לא תניב גבישים שמתפזרים כדי 5 A במקור הבית שלנו. השיפור בגבול ההשתברות הציע שקצה לקצה דופלקס עמותה אכן הייתה מעדיפהאריזת ing גביש.
מאז SeqA אינטראקציה עם רצפי GATC כי הם על אותו הפרצוף של ה-DNA, פן ההפוכות של הדופלקס הדנ"א צריכות להיות חשופות לממס. כדי לשפר עוד יותר את הגבישים של המתחם, אז אנחנו שונים הרצף של הדופלקס לכלול dinucleotide CG בין שני אתרי GATC לקדם אינטראקציות גרוב-עמוד שדרה עם מולקולות DNA סמוכות בגביש באמצעות הפנייה השנייה של דופלקס, שיטה שנעשה שימוש כדי לשפר את התגבשות DNA ב10 העבר. עם זאת, גבול ההשתברות של הגבישים גדלו עם דופלקס CG המכיל היה זהה לאלה שגדלו עם דופלקס דנ"א דומה שלא הכיל dinucleotide CG (איור 3). תוצאה זו מצביעה על כך שאינטראקציות גרוב-עמוד שדרה לא היו חשובות במקרה זה. אנחנו מכן מותאמים האורך של מסוכך על ידי השוואה בין הגבישים גדלו עם דופלקס דנ"א שהיו שני נוקליאוטידים נוספים בכל5 הסוף '. שינוי זה השפיע באופן דרסטי על מורפולוגיה גביש, כמו גם, גבול השתברות המציין כי נוקליאוטידים נוספים שינו את המגעים המולקולריים וארגון משופר גביש (איור 3) באופן דרמטי.
המבנה הגבישי של SeqAΔ (41-59)-A25R חייב דופלקס זו האחרונה דנ"א אשר כי הפנייה ללא דופלקס דנ"א אינה עוסקת בקשר של גביש, כצפוי מההשפעה המוגבלת של החדרת CG-dinucleotide. למרות הגודל היחסי של חלבונים ו-DNA, רוב האינטראקציות בין בני זוג סימטריה מתווכות על ידי אינטראקציות בין חלבונים וחלבון ה-DNA (איור 4). מעניין לציין שבמקרה הספציפי הזה, ההשפעה המועילה של סככת dinucleotide 5 'היא לא עקב ההיווצרות של DNA פסאודו רציף. במקום זאת, סופו 5 'מפרויקטי הגדיל המפוגלים הרחק מצירי DNA ומקיים אינטראקציה עם מולקולת SeqA הפרוקסימלי של המתחם, המסביר מדוע נוקלאוטידים 2 w פה נדרש להקפיד לשנות את גביש אריזה 8,11.
איור 1. עקידת SeqAΔ (41-59)-A25R ל-DNA hemimethylated. () תרשים סכמטי של תחומי SeqA שoligomerization וDNA החלבון לתווך מחייב. (ב) assay electrophoretic ניידות המשמרת של SeqAΔ (41-59)-A25R עם DNAs המכיל שני רצפי GATC hemimethylated מופרדים על ידי מספר גדל והולך של זוגות בסיסים ( X). הנתיב השמאלי ביותר (שכותרת ריקה) מכיל תערובת של equimolar DNAs עם 5, 7, 12, 21, 25 ו 34 זוגות בסיסים בין שני רצפי GATC בהעדר SeqAΔ (41-59)-A25R. (C) תרשים המתאר את השלושה המשתנים מותאמים על DNA דופלקסים להשיג גבישים באיכות עקיפה.
upload/4266/4266fig2.jpg "fo: תוכן רוחב =" 6in "fo: src =" / files/ftp_upload/4266/4266fig2highres.jpg "/>
איור 2. השפעה של שינוי מרחק. הסיכום בין GATC של oligonucleotides משמש וגבישים שהושגו עם 23-24 דופלקסים ארוכים BP המכילים שני אתרי GATC hemimethylated המופרד ב9 או 10 זוגות בסיסים. כל התמונות של גבישים נלקחו באותו הגדלה וסרגל קנה המידה מציין 100 מיקרומטר. מגבלת הרזולוציה של כל SeqAΔ (41-59)-A25R-DNA גביש מתבסס על תמונות שנאספו על עקיפת Rigaku RU-300 מערכת גנרטור רנטגן. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 3. השפעה של שינוי DNA מסתיימת. סיכום של tהוא oligonucleotides שימוש, וגבישים שהושגו עם 21 bps דופלקסים ארוכים המכילים שני אתרי GATC hemimethylated המופרד ב9 זוגות בסיסים וכוללים 0, 1 או 2 מסוכך נוקלאוטיד 5 'קצה. כל התמונות של גבישים נלקחו באותו הגדלה וסרגל קנה המידה מציין 100 מיקרומטר. מגבלת הרזולוציה של כל SeqAΔ (41-59)-A25R-DNA הגביש מתבסס על תמונות שנאספו בעקיפת beamlines X12C וX29 (NSLS, BNL). לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
איור 4. האריזה של SeqAΔ קריסטל (41-59)-A25R חייב DNA עם סככת dinucleotide: נצפה מ() למעלה ובצד (B). היחידה אסימטרית מכילה 2 SeqAΔ (41-59)-A25R-DNA מתחמים שבו החלבון מוצג באפור תוך הדנ"א מוצג בכתום. Symmetר"י הקשור SeqAΔ (41-59)-A25R-DNA מולקולות מוצגות בלבן והצהוב לחלבון ה-DNA. נתון זה הוכן באמצעות 12 PyMOL. נתון זה קשור לסרט 1. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
סרט 1. לחץ כאן לצפייה בסרט.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
אחד האתגרים הגדולים ביותר בקריסטלוגרפיה macromolecular רנטגן הוא קבלת גבישים באיכות עקיפה. במקרה של חלבון או חלבון-DNA תסביכים, אתגר זה מתעצם בשל משתנים הנוספים שצריך להיות מותאמים. הוא האמין נרחב כי אורכו של ה-DNA ואת הנוכחות של מסוכך דביק כדי לשפר את הקשר בין מולקולות דנ"א השכנות בעוד פסאודו דופלקס את הפרמטרים העיקריים כדי לייעל. עם זאת, יש לנו הראינו שהאופי והאורך מסוכך אלה יכולים להיות השפעה נוספת על אריזת הגביש של קומפלקס החלבון ה-DNA. למרות שפרוטוקול זה היה מתוכנן כדי להתגבש מורכב SeqA-DNA, אופטימיזציה של אורך ה-DNA, רצף ומסתיים מספק מסגרת כללית לעיצוב רציונל של oligonucleotides להתגבשותו של כל קומפלקס של דנ"א וחלבון.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות לצוות PXRR בNSLS (ברוקהייבן המעבדה הלאומית) לקבלת סיוע במהלך איסוף נתונים ומוניקה Pillon לעזרה בטיהור ה-DNA. עבודה זו נתמכה על ידי המכון הקנדי לחקר בריאות (MOP 67189).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TRIS | Bioshop | TRS003.5 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | E478-500 | |
| Dithiotheitrol (DTT) | Bio Basic Inc. | DB0058 | |
| NaCl | Bioshop | SOD002.10 | |
| Glycerol | Caledon | 5350-1 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016-500G | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Bioshop | SDS001.500 | |
| Urea | Bioshop | URE001.5 | |
| 40% 29:1 Bis/acrylamide | Bio Basic Inc. | A0007-500ml | Store at 4 °C |
| Boric acid | EMD | BX0865-1 | |
| Xylene cyanol FF | Bio-Rad | 161-0423 | |
| Bromophenol Blue | Bioshop | BR0222 | |
| Dual Adjustable Vertical Gel System | C.B.C. Scientific Company Inc. | DASG-250 | |
| Index crystallization screen | Hampton Research | HR2-144 | Store at 4 °C |
| Wizard I crystallization screen | Emerald BioSystems | EBS-WIZ-1 | Store at 4 °C |
| Wizard II crystallization screen | Emerald BioSystems | EBS-WIZ-2 | Store at 4 °C |
| Classics crystallization screen | Qiagen | 130701 | Store at 4 °C |
| Intelliplate trays | Art Robbins Instruments | 102-0001-00 | |
Solutions Protein purification buffer: 100 mM TRIS pH 8, 2 mM EDTA, 2 mM DTT and 5% glycerol. Protein storage buffer: 20 mM TRIS pH 8, 150 mM NaCl, 5 mM DTT, 0.5 mM EDTA and 5% glycerol. Gel loading mix: Add 20 g of sucrose, 25 mg of bromophenol blue, 25 mg of xylene cyanol FF, 1 ml of 10% w/v SDS and 10 ml of 10X TBE to 70 ml of autoclaved ddH2O. Stir with mild heating until sucrose is dissolved and adjust the final volume to 100 ml with autoclaved ddH2O. Store at 4 °C. 2X loading buffer: Add 11 g of urea to 10 ml of gel loading mix. Stir on a hot plate until urea dissolves. Aliquot in 2 ml tubes and store at 4 °C. 10X PAGE mix: Mix 420.4 g of urea, 100 ml of 10X TBE (autoclaved), 250 ml of 40% 29:1 Bis/Acrylamide in ddH2O. Stir until totally dissolved and adjust volume to 1 liter. Store in dark bottles at 4 °C. 10X TBE: Dissolve 108 g of TRIS, 55 g of boric acid and 9.3 g of EDTA in 1 liter of ddH2O. Autoclave and store at room temperature. Elution buffer: Dilute 8 ml of 5 M NaCl, 2 ml of 1 M TRIS pH 7.5, 0.4 ml of 0.5 M EDTA pH 8 on 200 ml of ddH2O. Autoclave and store at room temperature. |
|||
References
- Campbell, J. L., Kleckner, N. E. coli oriC and the dnaA gene promoter are sequestered from dam methyltransferase following the passage of the chromosomal replication fork. Cell. 62, 967-979 (1990).
- Guarné, A. Crystal structure of a SeqA-N filament: implications for DNA replication and chromosome organization. Embo. J. 24, 1502-1511 (2005).
- Brendler, T., Austin, S. Binding of SeqA protein to DNA requires interaction between two or more complexes bound to separate hemimethylated GATC sequences. Embo. J. 18, 2304-2310 (1999).
- Jordan, S. R., Whitcombe, T. V., Berg, J. M., Pabo, C. O. Systematic variation in DNA length yields highly ordered repressor-operator cocrystals. Science. 230, 1383-1385 (1985).
- Tan, S., Hunziker, Y., Pellegrini, L., Richmond, T. J. Crystallization of the yeast MATalpha2/MCM1/DNA ternary complex: general methods and principles for protein/DNA cocrystallization. J. Mol. Biol. 297, 947-959 (2000).
- Rice, P. A., Yang, S., Mizuuchi, K., Nash, H. A. Crystal structure of an IHF-DNA complex: a protein-induced DNA U-turn. Cell. 87, 1295-1306 (1996).
- Yang, W., Steitz, T. A. Crystal structure of the site-specific recombinase gamma delta resolvase complexed with a 34 bp cleavage site. Cell. 82, 193-207 (1995).
- Chung, Y. S., Brendler, T., Austin, S., Guarne, A. Structural insights into the cooperative binding of SeqA to a tandem GATC repeat. Nucleic Acids Res. , (2009).
- Anderson, J., Ptashne, M., Harrison, S. C. Cocrystals of the DNA-binding domain of phage 434 repressor and a synthetic phage 434 operator. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 1307-1311 (1984).
- Timsit, Y., Moras, D. DNA self-fitting: the double helix directs the geometry of its supramolecular assembly. Embo J. 13, 2737-2746 (1994).
- Chung, Y. S., Guarne, A. Crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of SeqA bound to a pair of hemimethylated GATC sites. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 64, 567-571 (2008).
- DeLano, W. L. The PyMOL Molecular Graphic Systems. , DeLano Scientific. (2002).
