CRISPR / كاس أنظمة المناعة التكيفية التوسط في البكتيريا والعتيقة. ويقترح العديد من البروتينات لتكون بمثابة كاس endoribonucleases تعمل على السلائف crRNA ذات أطوال متباينة. نحن هنا توضيح ثلاثة أساليب مختلفة لتوليد ما قبل crRNA ركائز لتحليل كيميائي حيوي من النشاط نوكلياز داخلية كاس.
تفاعل الفيروسات والمضيفين على شكل بروكاريوتيك تطور الحياة الجرثومية وarchaeal. بدائيات النوى وضعت عدة استراتيجيات لتجنب الهجمات الفيروسية التي تشمل تقييد التعديل، والعدوى فاشلة ونظم CRISPR / كاس. هذه النظم على التكيف المناعي وجدت في العديد من أنواع البكتيريا ومعظم الأركيا تتكون من ج ص مصقول egularly ط ق هورت nterspaced ص ص alindromic EPEAT (CRISPR) تسلسل وعدد من الجينات كما RISPR C (CAS) sociated (الشكل 1) 1-3. مجموعات مختلفة من البروتينات استراتيجية المساعدة القطرية ويكرر تحديد ما لا يقل عن ثلاثة أنواع متباينة من CRISPR الرئيسية / كاس نظم 4. ويقترح البروتينات العالمية Cas1 وCas2 أن تشارك في امتصاص DNA فيروسيسيتم إنشاء عنصر جديد التبادل بين اثنين في محطة يكرر 5 'من كتلة CRISPR تمتد 5. وكتب الكتلة بأكملها إلى crRNA-السلائف يحتوي على جميع متواليات التبادل وتكرار وتتم معالجتها لاحقا من قبل انزيم من عائلة متنوعة Cas6 إلى أصغر crRNAs 6-8. هذه crRNAs تتكون من تسلسل التبادل يحيط بها 'محطة (8 النيوكليوتيدات) و3' لمدة 5 العلامة النهائية المستمدة من تكرار تسلسل 9. ويمكن الآن للعدوى المتكررة من الفيروس يكون قد تم حظره كما سيتم توجيه crRNA جديدة من مجمع البروتين CAS (تتالي) إلى الحمض النووي الفيروسي والتعرف عليه على هذا النحو من خلال التكامل الأساس 10. وأخيرا، لCRISPR / كاس أنظمة من النوع 1، فإن Cas3 نوكلياز تدمير الغازي الكشف عن الحمض النووي 11،12.
هذه العمليات تحديد CRISPR / كاس نظام المناعة والتكيف بدائيات النوى وفتح مجال البحوث رائعة لدراسة البروتينات كاس المعنية.وظيفة البروتينات كاس العديد من لا يزال بعيد المنال، والأسباب واضحة للتنوع أنظمة CRISPR / كاس يزال يتعين مضيئة. وتوقع الأنشطة المحتملة من البروتينات معظم التحليلات الحسابية عن طريق كاس تفصيلا. وتظهر إما جزءا كبيرا من البروتينات أو المقترحة لكاس تعمل كما endonucleases 4.
هنا، نقدم طرق لتوليد crRNAs والسلائف cRNAs من أجل دراسة endoribonucleases كاس. المقايسات نوكلياز داخلية مختلفة تتطلب تكرار متواليات قصيرة إما مباشرة يمكن أن توليفها كما أليغنوكليوتيد] RNA أو تسلسل أطول crRNA وقبل crRNA-التي يتم إنشاؤها عن طريق البلمرة في المختبر RNA T7 جولة الاعادة النسخ. هذه المنهجية يسمح إدماج من النيوكليوتيدات المشعة لتوليد ركائز نوكلياز داخلية المسمى داخليا وإنشاء crRNAs تركيبية أو متحولة. ويستخدم Cas6 النشاط نوكلياز داخلية لتنضج قبل crRNAs في crRNAs مع 5'-HYDRoxyl و '2، تيرميني الفوسفات 3'-دوري.
الأساليب قدم تمكين الجيل من ركائز نوكلياز داخلية كاس يتراوح حجم مختلفة وبدرجات حرية في تصميم التسلسل. ويقتصر النهج الأكثر مباشرة إلى الأمام لتوليد الاصطناعية ركائز قليل النوكليوتيد RNA RNA لتصاميم قصيرة بسبب زيادة التكاليف والقيود التقنية في خلق أطول oligomers RNA. في حين تم الإبلاغ عن نجاح RNA RNA تجميعي للoligomers معدلة أكثر من طول النيوكليوتيدات 100، الحد الأقصى عمليا واقتصاديا لتخليق RNA مخصص تقع أقل من 40 النيوكليوتيدات. ومع ذلك، يمكن توليفها أي تسلسل معين، ويمكن استخدامها في مقدمة المستهدفة من النيوكليوتيدات تعديل (على سبيل المثال ريبوزية) لتحليل المواقع الانقسام بالتفصيل. يجب أن يكون إنشاء أطول قبل cRNAs عبر النسخ في المختبر.
والصلب من أليغنوكليوتيد] التي تحتوي على الحمض النووي الريبي بوليميراز T7 المروج يسمح لإنتاج طول وسيطة قبل crRNكما. الحد الأقصى لطول بشكل روتيني واقتصاديا أليغنوكليوتيد] DNA هو مجرد تجميع فوق 150 النيوكليوتيدات ويمثل الحد الأقصى لcrRNAs الاصطناعية قبل عبر هذه الطريقة. يمكن للجمعية العديد من صلب قليل النوكليوتيد أزواج DNA التي تشكل نهايات لزجة مع بعضها البعض تمديد هذه المدة القصوى لكن يتطلب التحديات المتزايدة في الاستنساخ للبناء. والميزة الرئيسية لهذه الطريقة هو القدرة على توليد ما قبل crRNA بنيات (وبالتالي كاس نوكلياز داخلية ركائز) مع أي تسلسل المطلوب. وهذا يسمح للاختبار تصاميم crRNA الاصطناعية.
وأخيرا، يمكن الحصول على أكبر ما قبل crRNAs من amplificates PCR من كامل العناصر الجينية CRISPR أو جزيئاتها. ويمكن إدخال تعديلات على قالب النسخ في المختبر عن طريق الطفرات البلازميد في الموقع موجهة للجيل السابق للcrRNA المتغيرات. ويمكن استخدام هذه التركيبات لتحليل نمط العالمية انشقاق داخل endonucleolytic كاملقبل crRNA.
واستند عمل رائدة لإنتاج RNA بوليميراز RNA معدلة عبر T7 في النسخ المختبر على نقل الرناوات 14 و RNA فيروس فسيفساء بروم 15. بوليميراز RNA توافق T7 المروج يتكون من مجال الاعتراف (-17 من خلال -5) والشروع مجال (-4 من خلال +6) مع بدء النسخ في لغوانوزين الأساسية +1 16. يمكن أن تختلف المواقف من المصب +1 الذي يسمح للنسخ من ما يقرب من أي تسلسل الحمض النووي الريبي المطلوب. الأساليب قدمت لتوليد المختبر في قوالب النسخ جولة الاعادة تسمح لفي تركيب المختبر من قبل كاملة crRNAs التي تطابق المناطق CRISPR الجيني أو الاصطناعية المتغيرات قبل crRNA. يتم إنشاء النسخ الحالية مع ثلاثي الفوسفات 5'-محطة ما لم يتم معبي رد فعل النسخ مع GMP للحصول على الأدينوزين 5 'تيرميني 14. ويلزم مصطلحات من هذا القبيل إذا النصوص أن يكون المسمىمع كيناز عديد النوكليوتيد T4-γ و[32 P].-ATP النشاط الانقسام من Cas6 والإنزيمات مثل Cas6 يولد crRNA التي تحتوي على 5'-الهيدروكسيل و '2، تيرميني الفوسفات 3'-دوري. ويمكن بعد هذه الرناوات يتم تحليلها لاعتراف المجمع تتالي.
The authors have nothing to disclose.
فإن الكتاب أود أن أشكر جانيت Schermuly لإعداد المؤتلف بوليميراز RNA T7 ونورمان Ebelt للمساعدة في إعداد الشكل 1. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل أموال من جمعية الألمانية للبحوث (DFG FOR1680) وماكس بلانك.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Antarctic Phosphatase | NEB | M0289L | |
in vitro Transcription Grade Ultrapure Nucleotide Triphosphates | Jena Bioscience | NU-1010 – NU-1013 | |
Liquid chromatography, ktapurifier 100 | GE Healthcare | ||
DNA oligonucleotides | MWG Operon | ||
RNA oligonucleotides | MWG Operon | ||
Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 | |
PCR purification Kit | QIAGEN | 28104 | |
Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27106 | |
Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12163 | |
BamHI | NEB | R0136L | |
HindIII | NEB | R0104L | |
T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
T4 Polynucleotide Kinase | Ambion | AM2310 | |
T7 RNA Polymerase | own preparation | ||
Deoxynucleotide Solution Mix | NEB | N0447L | |
Mini-PROTEAN Tetra Electrophoresis System | Bio-Rad | 165-8001 | |
Storm 840 Scanner | GE Healthcare | 163723 | |
Storage Phosphorscreen | Molecular Dynamics | 63-0034-81 | |
Mono Q 5/50 GL | GE Healthcare | 17-5166-01 | |
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530L | use the GC buffer |
Toluidine Blue | Sigma | T3260 | |
pUC19 | NEB | N3041S | |
γ-[32P]-ATP, α-[32P]-ATP | Hartmann Analytic | SRP-401, SRP-307 |