CRISPR / Cas sistemi mediata immunità adattativa in Batteri e Archaea. Molte proteine Cas si propongono di agire come agiscono sul endoribonucleases crRNA precursori di varia lunghezza. Qui si illustrano tre diversi approcci per la generazione pre-crRNA substrati per l'analisi biochimica di attività endonucleasi Cas.
L'interazione di virus e loro ospiti procariotici plasmato l'evoluzione della vita batterica e archaeal. Procarioti sviluppato diverse strategie per evitare gli attacchi virali che includono la modifica restrizione, l'infezione abortiva e CRISPR / Cas sistemi. Questi sistemi immunitarie che si trovano in molti batteri e la maggior parte sono costituiti da Archaea c lustered r egularly i nterspaced s hort p alindromic r EPEAT (CRISPR) sequenze e un certo numero di C RISPR come sociated (CAS) geni (Fig. 1) 1-3. Gli insiemi differenti di proteine Cas e le ripetizioni definire almeno tre principali tipi divergenti di CRISPR / Cas sistemi 4. Le proteine universali CAS1 e CAS2 sono proposti per essere coinvolti nella assunzione di DNA virale chegenererà un nuovo elemento distanziatore tra due ripetizioni al 5 'terminale di un cluster CRISPR estendentesi 5. L'intero cluster viene trascritto in un precursore-crRNA contenente tutte distanziale e sequenze ripetute e viene successivamente elaborato da un enzima del diverso Cas6 famiglia in piccole crRNAs 6-8. Questi crRNAs consistono nella sequenza spacer fiancheggiato da una 5 'terminale (8 nucleotidi) e 3' terminale tag derivata dalla sequenza di ripetizione 9. Una infezione ripetuta del virus può essere bloccato come il nuovo crRNA sarà diretto da un complesso proteico Cas (Cascade) al DNA virale e identificarlo come tale attraverso la complementarità base 10. Infine, per CRISPR / Cas sistemi di tipo 1, il CAS3 nucleasi distruggerà l'invasore rilevato DNA 11,12.
Questi processi definiscono CRISPR / Cas come un sistema immunitario adattativo di procarioti e aperto un affascinante campo di ricerca per lo studio delle proteine coinvolte Cas.La funzione di molte proteine Cas è ancora sfuggente e le cause per la diversità apparente dei CRISPR / Cas sistemi restano da illuminare. Attività potenziali della maggior parte delle proteine Cas sono stati previsti attraverso dettagliate analisi computazionali. Una frazione importante di proteine Cas sono mostrate o proposti per funzionare come endonucleasi 4.
Qui, presentiamo metodi per generare crRNAs e precursori-cRNA per lo studio di endoribonucleases Cas. Saggi di endonucleasi diversi richiedono sequenze ripetute sia brevi che possono direttamente essere sintetizzati come oligonucleotidi di RNA o sequenze più crRNA e pre-crRNA che vengono generati tramite in vitro T7 RNA polimerasi ballottaggio trascrizione. Questa metodologia permette l'incorporazione di nucleotidi radioattivi per la generazione di substrati endonucleasi internamente etichettati e la creazione di crRNAs sintetici o mutante. Cas6 attività endonucleasica è utilizzato per maturare pre-crRNAs in crRNAs con 5'-hydroxyl e 2 ', 3'-ciclici termini fosfato.
I metodi presentati consentono la generazione di Cas substrati endonucleasi di forcelle di dimensioni diverse e con vari libertà nel design sequenza. L'approccio più straight-forward per la generazione di oligonucleotidi sintetici substrati di RNA è limitata a brevi disegni RNA causa dei costi crescenti e limitazioni tecniche nella creazione di più oligomeri RNA. Mentre riuscita sintesi di RNA è stato riportato per non modificati oligomeri RNA lunghezza di oltre 100 nucleotidi, la massima pratica ed economica per sintesi su RNA giace sotto 40 nucleotidi. Tuttavia, ogni data sequenza può essere sintetizzato e l'introduzione mirata di nucleotidi modificati (ad es desossiribonucleotidi) può essere utilizzata per analizzare siti di taglio in dettaglio. Più pre-cRNA deve essere generato tramite trascrizione in vitro.
La ricottura di oligonucleotidi che contengono un promotore T7 RNA polimerasi permette la produzione di lunghezza intermedia pre-CRRNCome. La lunghezza massima di routine ed economicamente oligonucleotidi di DNA sintetizzato è appena sopra 150 nucleotidi e rappresenta il massimo di sintesi pre-crRNAs tramite questo metodo. L'assemblaggio di diverse coppie di DNA ricotti oligonucleotidiche che formano estremità appiccicose con l'altro può estendere questa lunghezza massima ma richiede crescenti sfide nella clonazione del costrutto. Il vantaggio principale di questo metodo è la capacità di generare pre-crRNA costrutti (e quindi Cas endonucleasi substrati) con qualsiasi sequenza desiderata. Questo consente di testare i disegni crRNA sintetici.
Infine, più pre-crRNAs possono essere ottenuti da PCR amplificati di elementi interi CRISPR genomiche o in frazioni. Modifica del modello in vitro trascrizione plasmide può essere introdotto tramite mutagenesi sito-diretta per la generazione di pre-crRNA varianti. Questi costrutti possono essere utilizzati per analizzare il pattern globale cleavage endonucleolitica all'interno di un interopre-crRNA.
Il lavoro pionieristico per la produzione di RNA non modificato tramite polimerasi T7 RNA trascrizione in vitro è stata basata su RNA di trasferimento 14 e bromo mosaic virus RNA 15. Il consenso promotore T7 RNA polimerasi è costituito da un dominio di riconoscimento (-17 attraverso -5) e un dominio di iniziazione (-4 attraverso +6) con inizio della trascrizione in una guanosina essenziale +1 16. A valle di posizioni 1 può essere variata che consente la trascrizione di qualsiasi sequenza desiderata RNA. I metodi presentati per generare in vitro deflusso modelli trascrizione consentire sintesi in vitro di completo pre-crRNAs che corrispondono CRISPR regioni genomiche o sintetici pre-crRNA varianti. Le trascrizioni sono generati con un 5'-trifosfato terminale presente a meno che la reazione di trascrizione è innescato con le GMP per ottenere 5 'monofosfato termini 14. Tali termini sono necessarie se le trascrizioni devono essere etichettaticon T4 polinucleotide chinasi e γ-[32 P]-ATP. Attività di scissione Cas6 e Cas6 enzimi simili genera crRNA contenenti 5'-idrossile e 2 ', 3'-ciclici termini fosfato. Questi RNA possono poi essere analizzate per il riconoscimento da parte del complesso Cascade.
The authors have nothing to disclose.
Gli autori desiderano ringraziare Jeanette Schermuly per la preparazione di ricombinante T7 RNA polimerasi e Ebelt Norman per l'assistenza nella preparazione di Figura 1. Questo lavoro è stato finanziato con fondi della Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG FOR1680) e del Max Planck Society.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Antarctic Phosphatase | NEB | M0289L | |
in vitro Transcription Grade Ultrapure Nucleotide Triphosphates | Jena Bioscience | NU-1010 – NU-1013 | |
Liquid chromatography, ktapurifier 100 | GE Healthcare | ||
DNA oligonucleotides | MWG Operon | ||
RNA oligonucleotides | MWG Operon | ||
Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 | |
PCR purification Kit | QIAGEN | 28104 | |
Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27106 | |
Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12163 | |
BamHI | NEB | R0136L | |
HindIII | NEB | R0104L | |
T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
T4 Polynucleotide Kinase | Ambion | AM2310 | |
T7 RNA Polymerase | own preparation | ||
Deoxynucleotide Solution Mix | NEB | N0447L | |
Mini-PROTEAN Tetra Electrophoresis System | Bio-Rad | 165-8001 | |
Storm 840 Scanner | GE Healthcare | 163723 | |
Storage Phosphorscreen | Molecular Dynamics | 63-0034-81 | |
Mono Q 5/50 GL | GE Healthcare | 17-5166-01 | |
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530L | use the GC buffer |
Toluidine Blue | Sigma | T3260 | |
pUC19 | NEB | N3041S | |
γ-[32P]-ATP, α-[32P]-ATP | Hartmann Analytic | SRP-401, SRP-307 |