CRISPR / Cas systemen bemiddelen adaptieve immuniteit in Bacteria en Archaea. Veel Cas eiwitten worden voorgesteld om op te treden als endoribonucleases handelen crRNA voorlopers van verschillende lengte. Hier illustreren we drie verschillende benaderingen voor uw crRNA substraten voor de biochemische analyse van Cas endonuclease activiteit te genereren.
De interactie van virussen en hun prokaryote gastheren stempel op de evolutie van bacterien en archaea leven. Prokaryoten ontwikkelde verschillende strategieën om virale aanvallen die beperking wijziging, mislukte infectie en CRISPR / Cas systemen omvatten ontwijken. Deze adaptieve immuunsysteem in veel bacteriën en de meeste Archaea uit lustered c r i egularly nterspaced s hort p alindromic r epeat (CRISPR) sequenties en een aantal C RISPR als associeerd (Cas) genen (Fig. 1) 1-3. Verschillende sets van Cas eiwitten en herhalingen te definiëren ten minste drie grote uiteenlopende soorten CRISPR / Cas systemen 4. De universele eiwitten CAS1 en CAS2 voorgesteld betrokken te zijn bij de opname van viraal DNA datzal een nieuwe afstandhouder tussen twee herhalingen aan het 5'-uiteinde van een uitschuifbare CRISPR cluster 5. De gehele cluster wordt omgezet in een precursor-crRNA met alle spacer en repeat sequenties en vervolgens verwerkt door een enzym van de diverse Cas6 familie in kleinere crRNAs 6-8. Deze crRNAs bestaan uit de spacer sequentie geflankeerd door een 5'-terminale (8 nucleotiden) en een 3'-terminale tag afgeleid van de herhalingssequentie 9. Een herhaalde infectie van het virus kan nu geblokkeerd als de nieuwe crRNA wordt geleid door een eiwitcomplex Cas (Cascade) om het virale DNA en als zodanig identificeren via base complementariteit 10. Tot slot, voor CRISPR / Cas type 1-systemen, zal de nuclease CAS3 vernietigen van de gedetecteerde indringer DNA 11,12.
Deze processen bepalen CRISPR / Cas als adaptieve immuunsysteem van prokaryoten en opende een fascinerende onderzoeksgebied voor de studie van de betrokken Cas eiwitten.De functie van veel Cas eiwitten is nog steeds ongrijpbaar en de oorzaken voor de schijnbare diversiteit van de CRISPR / Cas-systemen nog moeten worden verlicht. Mogelijke activiteiten van de meeste Cas eiwitten werden voorspeld via gedetailleerde computationele analyses. Een belangrijke fractie van Cas eiwitten zijn ofwel getoond of voorgesteld om te functioneren als endonucleasen 4.
Hier geven we methoden crRNAs en precursor-cRNAs voor de studie van Cas endoribonucleases genereren. Verschillende endonuclease tests moeten zowel korte herhalingssequenties die direct kunnen worden gesynthetiseerd als RNA oligonucleotiden of meer crRNA en pre-crRNA sequenties die worden gegenereerd via in vitro T7 RNA polymerase run-off transcriptie. Deze methode maakt de opname van radioactieve nucleotiden voor het genereren van intern gemerkte endonuclease substraten en het creëren van synthetische of mutant crRNAs. Cas6 endonuclease activiteit wordt gebruikt voor uw crRNAs groeien tot crRNAs met 5'-hydroxyl en een 2 ', 3'-cyclische fosfaat termini.
De gepresenteerde methode kan de generatie van Cas endonuclease substraten van verschillende grootte varieert en met verschillende vrijheid in de juiste volgorde design. De rechttoe rechtaan aanpak voor het genereren van synthetische RNA oligonucleotide substraten beperkt tot korte RNA ontwerpen door toenemende kosten en technische beperkingen maken meer RNA oligomeren. Hoewel succesvol RNA synthese is gerapporteerd voor ongewijzigde RNA oligomeren van meer dan 100 nucleotiden lang, de praktische en economische maximum voor aangepaste RNA synthese ligt dan 40 nucleotiden. Maar elk gegeven sequentie worden gesynthetiseerd en gericht introductie van gemodificeerde nucleotiden (bv. deoxyribonucleotiden) kan worden gebruikt om knipplaatsen in detail te analyseren. Langere pre-cRNAs worden gegenereerd via in vitro transcriptie.
Het hybridiseren van oligonucleotiden die een T7 RNA polymerase promoter maakt de productie van tussenliggende lengte pre-crRNAs. De maximale lengte van routinematig en economisch gesynthetiseerde DNA oligonucleotiden boven 150 nucleotiden en de maximale synthetische pre-crRNAs via deze methode. De samenvoeging van verscheidene DNA gehybridiseerde oligonucleotide paren die sticky ends met elkaar vormen kunnen verlengen maximumlengte maar vereist toenemende problemen bij het klonen van het construct. Het belangrijkste voordeel van deze methode is de mogelijkheid om pre-crRNA constructen (en dus Cas endonuclease substraten) te genereren met elke gewenste volgorde. Dit maakt het testen van synthetische crRNA ontwerpen.
Tenslotte kunnen grotere pre-crRNAs worden verkregen amplificaten PCR van genomisch gehele CRISPR elementen of delen daarvan. Wijzigingen in de in vitro transcriptie template plasmide kan worden ingebracht via plaatsgerichte mutagenese voor het genereren van pre-crRNA varianten. Deze constructen kunnen worden gebruikt om het algemene endonucleolytische splitsing patroon binnen een volledige analysepre-crRNA.
Het pionierswerk voor de productie van niet-gemodificeerd RNA via T7 RNA polymerase in vitro transcriptie was gebaseerd op overdracht RNAs 14 en brome mosaic virus RNA 15. De consensus T7 RNA polymerase promoter bestaat uit een herkenningsdomein (-17 tot -5) en een initiatie domein (-4 tot +6) met transcriptie initiatie in een essentieel guanosine +1 16. Posities stroomafwaarts van +1 worden gevarieerd waardoor voor de transcriptie van iedere gewenste RNA sequentie. De gepresenteerde methoden voor het genereren van in vitro run-off transcriptie templates in vitro synthese van volledige pre-crRNAs dat genomische regio CRISPR of synthetische pre-crRNA varianten passen. De transcripten gegenereerd met een 5'-trifosfaat terminal aanwezig tenzij de transcriptiereactie is gemaakt met GMP naar 5 'monofosfaat termini 14 verkrijgen. Dergelijke termini zijn vereist indien de transcripten worden geëtiketteerdmet T4 polynucleotide kinase en γ-[32P]-ATP. Klievingsactiviteit van Cas6 en Cas6-achtige enzymen genereert crRNA die 5'-hydroxyl en 2 ', 3'-cyclische fosfaat termini bevatten. Deze RNA's kunnen dan worden geanalyseerd voor herkenning door de Cascade complex.
The authors have nothing to disclose.
De auteurs willen graag Schermuly bedanken Jeanette voor de voorbereiding van recombinant T7 RNA-polymerase en Norman Ebelt voor hulp bij het opstellen van figuur 1. Dit werk werd gefinancierd door fondsen van de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG FOR1680) en het Max Planck Instituut.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Antarctic Phosphatase | NEB | M0289L | |
in vitro Transcription Grade Ultrapure Nucleotide Triphosphates | Jena Bioscience | NU-1010 – NU-1013 | |
Liquid chromatography, ktapurifier 100 | GE Healthcare | ||
DNA oligonucleotides | MWG Operon | ||
RNA oligonucleotides | MWG Operon | ||
Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 | |
PCR purification Kit | QIAGEN | 28104 | |
Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27106 | |
Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12163 | |
BamHI | NEB | R0136L | |
HindIII | NEB | R0104L | |
T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
T4 Polynucleotide Kinase | Ambion | AM2310 | |
T7 RNA Polymerase | own preparation | ||
Deoxynucleotide Solution Mix | NEB | N0447L | |
Mini-PROTEAN Tetra Electrophoresis System | Bio-Rad | 165-8001 | |
Storm 840 Scanner | GE Healthcare | 163723 | |
Storage Phosphorscreen | Molecular Dynamics | 63-0034-81 | |
Mono Q 5/50 GL | GE Healthcare | 17-5166-01 | |
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530L | use the GC buffer |
Toluidine Blue | Sigma | T3260 | |
pUC19 | NEB | N3041S | |
γ-[32P]-ATP, α-[32P]-ATP | Hartmann Analytic | SRP-401, SRP-307 |