박테리아와 Archaea의 CRISPR / 카스 시스템 중재 적응 면역. 많은 카스 단백질은 길이를 변화의 crRNA의 전구체에 작용 endoribonucleases 역할을 제안하고 있습니다. 여기 카스의 endonuclease 활동의 생화학 분석을위한 사전 crRNA 기판을 생성하는 세 가지 방법을 설명합니다.
바이러스와 prokaryotic 호스트의 상호 작용이 박테리아와 archaeal 삶의 진화를 형성. Prokaryotes이 제한 수정, 불임 감염과 CRISPR / 카스 시스템이 포함되어 바이러스 공격을 피하기 위해 여러 전략을 개발했습니다. C는 내가 S hort P alindromic 연구 epeat (CRISPR) 시퀀스 및 sociated (카스) 유전자와 같은 C RISPR의 수 (그림 1) 1-3을 nterspaced egularly r을 lustered의 많은 박테리아 대부분의 Archaea에서 발견 된 이러한 적응 면역 시스템으로 구성되어 있습니다. 카스 단백질과 반복의 다른 세트 CRISPR / 카스 시스템 (4)의 적어도 세 가지 주요 발산 유형을 정의합니다. 보편적 인 단백질 Cas1 및 Cas2은 바이러스 DNA의 이해에 참여하는 제안됩니다연장 CRISPR 클러스터 (5)의 5 '말단에서 두 반복 사이에 새로운 스페이서 요소를 생성합니다. 전체 클러스터는 모든 공백 및 반복 시퀀스를 포함하는 전구체 – crRNA로 베꼈되어 이후 작은 crRNAs 6-8로 다양한 Cas6 가족의 효소에 의해 처리됩니다. 이 crRNAs은 5 '터미널 (8 세포핵)과 3'반복 순서 9에서 파생 터미널 태그가 옆에있는 스페이서 순서로 구성되어 있습니다. 새로운 crRNA이 바이러스 DNA에 카스 단백질 단지 (캐스케이드) 감독의 기본 complementarity 10을 통해 사용자로 식별 될 것 같은 바이러스의 반복 감염은 이제 차단 될 수 있습니다. 마지막으로, CRISPR / 카스에 1을 입력 한 시스템을위한, nuclease Cas3이 검출 된 침입자 DNA 11,12을 파괴합니다.
이러한 프로세스는 prokaryotes의 적응 면역 시스템으로 CRISPR / 카스를 정의하고 관련자 카스 단백질 연구에 대한 흥미로운 연구 분야를 열었습니다.많은 카스 단백질의 기능은 여전히 어려운이며, CRISPR / 카스 시스템의 명백한 다양성의 원인은 조명 할 수 남아 있습니다. 대부분의 카스 단백질의 잠재적 인 활동은 자세한 계산 분석을 통해 예측했다. 카스 단백질의 단수가 하나 표시하거나 4 endonucleases으로 작동하도록 제안하고 있습니다.
여기, 우리는 카스의 endoribonucleases의 연구 crRNAs 및 전구체-cRNAs를 생성하는 방법을 제시한다. 다른 endonuclease의 assays 직접 RNA의 oligonucleotides 또는 실행 – 오프 스크립트 체외 T7 RNA 중합 효소의의를 통해 생성되는 이상 crRNA 및 사전 crRNA 시퀀스로 합성 할 수 있습니다 중 짧은 반복 시퀀스가 필요합니다. 이 방법론은 내부적으로 표시된 endonuclease 기판 및 합성 또는 돌연변이 crRNAs의 창조의 세대를위한 방사성 세포핵의 결합이 가능합니다. Cas6 endonuclease 활동이 5'-hydr와 crRNAs에 사전 crRNAs를 성숙하기 위해 사용된다oxyl과 2 ', 3'-순환 인산염 테르 미니 (Termini).
제시 방법은 서로 다른 크기의 범위 카스 endonuclease 기판의 생성을 활성화하고 시퀀스 디자인의 자유를 변화와 함께. 합성 RNA의 oligonucleotide 기판의 생성을위한 가장 스트레이트 포워드 접근 방식은 더 이상 RNA의 oligomers을 만드는 증가 비용과 기술적 한계로 인해 짧은 RNA 디자인으로 제한됩니다. 성공적인 RNA 합성은 100 세포핵 길이의 수정되지 않은 RNA의 oligomers에 대해보고 된 반면, 사용자 정의 RNA 합성을위한 실용적이고 경제적 인 최대 아래 40 세포핵에 자리 잡고 있습니다. 그러나, 주어진 시퀀스는 합성 할 수 있으며 수정 세포핵 (예 : deoxyribonucleotides)의 대상으로 소개 자세히 절단 사이트를 분석하기 위해 이용 될 수 있습니다. 긴 사전 cRNAs는 체외 스크립트에 통해 생성해야합니다.
T7 RNA 중합 효소의 프로모터를 포함 oligonucleotides의 어닐링은 중간 길이 미리 crRN의 생산을 허용있습니다. 정기적으로 그리고 경제적으로 합성 DNA의 oligonucleotides의 최대 길이는 불과 150 세포핵 위에 있으며,이 방법으로 합성 사전 crRNAs의 최대를 나타냅니다. 서로 끈적 끝을 형성 여러 annealed의 DNA oligonucleotide 쌍의 조립이 최대 길이를 연장하지만 구조의 복제에 증가 도전을 필요로 할 수 있습니다. 이 방법의 가장 큰 장점은 원하는 순서로 사전 crRNA 구조 (그리고 그에 카스 endonuclease 기판)를 생성 할 수있는 기능입니다. 이 합성 crRNA 디자인의 테스트를 할 수 있습니다.
마지막으로, 큰 사전 crRNAs는 그 전체 게놈의 CRISPR 요소 또는 분수의 PCR의 amplificates에서 얻을 수 있습니다. 플라스미드 체외 전사 템플릿에 대한 변경은 사전 crRNA 변종의 생성을위한 사이트 이동 mutagenesis를 통해 소개 할 수 있습니다. 이러한 구조는 전체 내에 글로벌 endonucleolytic 절단 패턴을 분석하는 데 사용할 수 있습니다사전 crRNA.
체외 스크립트에서 T7 RNA 중합 효소의를 통해 수정되지 않은 RNA의 생산을위한 선구자 작업은 전송 RNAs 14 brome 모자이크 바이러스 RNA 15 일 기준으로했습니다. 합의 T7 RNA 중합 효소의 프로모터는 인식 도메인 (-5 통해 -17)과 필수 구아노 신 일 16 전사 개시와 개시 도메인 (6를 통해 -4)로 구성되어 있습니다. 하나의 순위 하류는 거의 모든 원하는 RNA 시퀀스의 해독을 허용하는 가변 될 수 있습니다. 체외 실행 – 오프 전사 템플릿에서 생성 제시 방법은 게놈 CRISPR 지역 또는 합성 사전 crRNA 변종과 일치하는 완전한 사전 crRNAs의 체외 합성에 대한 수 있습니다. 전사 반응은 5 '모노 포스페이트 테르 미니 (Termini) 14 얻기 위해 GMP와 중이오하지 않는 한 성적 증명서는 5'-터미널 삼인산 존재와 생성됩니다. 성적표가 표시 될 경우 이러한 테르 미니 (Termini)가 필요합니다T4 폴리 뉴클레오타이드 키나제와 γ-[32 P]-ATP.로 Cas6 및 Cas6 같은 효소의 절단 활동은 5'-수산기와 2 ', 3'-순환 인산염 테르 미니 (Termini)를 포함 crRNA를 생성합니다. 이러한 RNAs는 다음 캐스케이드 복잡한에 의해 인식 분석 할 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
저자는 재조합 T7 RNA 중합 효소의와 그림 1을 준비에 도움 노르만 Ebelt의 준비를 위해 Schermuly 지넷 감사드립니다. 이 작품은 독일 Forschungsgemeinschaft (DFG FOR1680)과 최대 플랑크 협회에서 기금의 지원을받는되었다.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Antarctic Phosphatase | NEB | M0289L | |
in vitro Transcription Grade Ultrapure Nucleotide Triphosphates | Jena Bioscience | NU-1010 – NU-1013 | |
Liquid chromatography, ktapurifier 100 | GE Healthcare | ||
DNA oligonucleotides | MWG Operon | ||
RNA oligonucleotides | MWG Operon | ||
Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 | |
PCR purification Kit | QIAGEN | 28104 | |
Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27106 | |
Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12163 | |
BamHI | NEB | R0136L | |
HindIII | NEB | R0104L | |
T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
T4 Polynucleotide Kinase | Ambion | AM2310 | |
T7 RNA Polymerase | own preparation | ||
Deoxynucleotide Solution Mix | NEB | N0447L | |
Mini-PROTEAN Tetra Electrophoresis System | Bio-Rad | 165-8001 | |
Storm 840 Scanner | GE Healthcare | 163723 | |
Storage Phosphorscreen | Molecular Dynamics | 63-0034-81 | |
Mono Q 5/50 GL | GE Healthcare | 17-5166-01 | |
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530L | use the GC buffer |
Toluidine Blue | Sigma | T3260 | |
pUC19 | NEB | N3041S | |
γ-[32P]-ATP, α-[32P]-ATP | Hartmann Analytic | SRP-401, SRP-307 |