CRISPR / Cas-Systeme vermitteln adaptive Immunität in Bakterien und Archaea. Viele Cas Proteine vorgeschlagen, als Endoribonukleasen die auf crRNA Vorläufer von unterschiedlicher Länge handeln. Hier erläutern wir drei verschiedene Ansätze vor, crRNA Substrate für die biochemische Analyse von Cas Endonucleaseaktivität generieren.
Das Zusammenspiel von Viren und deren prokaryotischen Wirten prägte die Entwicklung der Bakterien und Archaeen Leben. Prokaryoten entwickelt verschiedene Strategien, um Viren-Attacken, die Restriktions-Modifikations-, abortive Infektion und CRISPR / Cas-Systeme gehören zu entziehen. Diese adaptive Immunsystem in vielen Bakterien und am meisten Archaea gefunden bestehen aus c glänzendes r i egularly nterspaced s p hort alindromic r iederholen (CRISPR) Sequenzen und eine Anzahl von C RISPR als sociated (Cas) Gene (Abb. 1) 1-3. Verschiedene Sätze von Cas Proteine und Wiederholungen definieren mindestens drei große divergierenden Arten von CRISPR / Cas-Systeme 4. Die universellen Proteine und CAS1 CAS2 werden vorgeschlagen, um bei der Aufnahme der viralen DNA eingebunden werden, dasseine neue Abstandselement zwischen zwei Wiederholungen am 5'-Terminus eines erstreckenden CRISPR Cluster 5 erzeugen. Der gesamte Cluster wird in einem Vorläufer-crRNA die alle Abstandhalter und Repeat-Sequenzen transkribiert wird und anschließend durch ein Enzym der Familie vielfältigen Cas6 in kleinere crRNAs 6-8 verarbeitet. Diese bestehen aus der crRNAs Spacersequenz durch eine 5'-Terminal (8 Nucleotide) und einem 3'-terminalen-Tag aus der Repeatsequenz 9 abgeleitet flankiert. Eine wiederholte Infektion des Virus kann nun blockiert, da der neue crRNA wird von einem Proteinkomplex Cas (Cascade) an die virale DNA gerichtet werden und als solche zu kennzeichnen über Basenkomplementarität 10 unterzogen. Schließlich, für CRISPR / Cas-Typ-1-Systeme, wird die Nuklease CAS3 zerstören erkannt invader DNA 11,12.
Diese Prozesse zu definieren CRISPR / Cas als adaptive Immunsystem Prokaryoten und eröffnet einen faszinierenden Forschungsgebiet für das Studium der beteiligten Cas Proteine.Die Funktion vieler Cas Proteine ist noch schwer zu fassen und die Ursachen für die scheinbare Vielfalt der CRISPR / Cas Systeme bleiben beleuchtet werden. Mögliche Aktivitäten der meisten Cas Proteine wurden durch detaillierte rechnerische Analysen vorhergesagt. Ein großer Teil der Cas Proteine werden entweder angezeigt oder vorgeschlagen zu funktionieren, wie Restriktionsendonukleasen 4.
Hier präsentieren wir Methoden, um crRNAs und Vorläufer-cRNAs für das Studium der Cas Endoribonukleasen generieren. Endonuklease verschiedenen Assays erfordern entweder kurzen Wiederholungssequenzen, die direkt als RNA-Oligonukleotide oder länger crRNA und pre-crRNA Sequenzen, die über in vitro RNA-Polymerase T7 run-off-Transkription erzeugt werden, synthetisiert werden können. Diese Methodik erlaubt den Einbau von radioaktiven Nukleotiden zur Erzeugung von intern markiert Endonuklease Substrate und die Schaffung synthetischer oder Mutante crRNAs. Cas6 Endonucleaseaktivität wird verwendet, um pre-crRNAs in crRNAs mit 5'-hydr reifenOxyl und a 2 ', 3'-cyclisches Phosphat-Termini.
Die vorgestellten Verfahren ermöglichen die Erzeugung von Cas Endonuklease Substraten unterschiedlicher Größenbereiche und mit unterschiedlicher Sequenz in Freiheit Design. Die geradlinigen Ansatz zur Erzeugung von synthetischen RNA-Oligonukleotid Substrate auf kurze RNA Designs aufgrund steigenden Kosten und technischer Beschränkungen bei der Schaffung längere RNA-Oligomeren begrenzt. Während erfolgreiche RNA-Synthese wurde für unmodifizierte RNA-Oligomere von über 100 Nukleotiden Länge berichtet, liegt die praktische und wirtschaftliche Maximum für benutzerdefinierte RNA-Synthese unter 40 Nukleotiden. Jedoch kann jede gegebene Sequenz synthetisiert und die gezielte Einführung von modifizierten Nukleotiden (zB Desoxyribonukleotiden) kann verwendet werden, um Spaltstellen im Detail analysiert werden. Mehr pre-cRNAs sollte über in vitro Transkription erzeugt werden.
Das Glühen von Oligonucleotiden, die ein T7-RNA-Polymerase-Promotor enthalten können zur Herstellung von Pre-Zwischenlänge CRRNAs. Die maximale Länge der routinemäßig und wirtschaftlich synthetisierte DNA-Oligonukleotiden ist nur oberhalb von 150 Nukleotiden und stellt die maximale synthetischer pre-crRNAs mit dieser Methode. Die Anordnung von mehreren DNA geglühten Oligonukleotidpaare, die klebrigen Enden miteinander bilden erstrecken kann diese maximale Länge erfordert aber immer größeren Schwierigkeiten, die Klonierung des Konstrukts. Der Hauptvorteil dieses Verfahrens ist die Möglichkeit vor, eine crRNA Konstrukte (und daher Cas Endonuklease Substrate) mit einer beliebigen gewünschten Sequenz zu erzeugen. Dies ermöglicht das Testen von synthetischen crRNA Designs.
Schließlich können größere Vor-crRNAs aus PCR-Amplifikate der gesamten genomischen CRISPR Elemente oder Fraktionen davon erhalten werden. Änderungen an den in vitro Transkriptions-Vorlage Plasmid kann über ortsspezifische Mutagenese zur Erzeugung von Vor-crRNA Varianten eingeführt werden. Diese Konstrukte können verwendet werden, um die globale endonukleolytische Spaltung Muster innerhalb eines gesamten analysierenPre-crRNA.
Die Pionierarbeit für die Herstellung von unmodifizierten RNA mittels T7-RNA-Polymerase in vitro-Transkription wurde am Transfer-RNAs 14 und Trespenmosaik-Virus-RNA 15 basiert. Die Konsensus-T7-RNA-Polymerase-Promotor aus einem Erkennungs-Domäne (-17 bis -5) und einer Initiationsstelle Domäne (-4 bis 6) mit Transkriptionsinitiationsregion in einer entscheidenden Guanosin +1 16. Positionen stromabwärts 1 kann variiert werden, die die Transkription von fast jeder gewünschten RNA-Sequenz ist. Die vorgestellten Verfahren zur Erzeugung von in-vitro-run-off-Transkription Vorlagen ermöglichen zur in vitro Synthese von vollständigen Vor-crRNAs die genomische Regionen CRISPR oder synthetische Varianten vor crRNA übereinstimmen. Die Transkripte sind mit einem 5'-Triphosphat-terminalen vorliegenden erzeugt, wenn der Transkriptionsreaktion mit GMP grundiert wird auf 5 'Termini Monophosphat 14 zu erhalten. Solche Termini sind erforderlich, wenn die Transkripte beschriftet werdenmit T4 Polynukleotidkinase und γ-[32 P]-ATP. Spaltungsaktivität Cas6 und Cas6-ähnliche Enzyme erzeugt crRNA, die 5'-Hydroxy-und a 2 ', 3'-cyclisches Phosphat-Enden enthalten. Diese RNAs können dann für die Anerkennung durch die Cascade komplexen analysiert werden.
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren bedanken sich bei Jeanette Schermuly danken für die Herstellung von rekombinantem T7-RNA-Polymerase und Norman Ebelt für die Unterstützung bei der Vorbereitung Abbildung 1. Diese Arbeit wurde vom Fonds der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG FOR1680) und dem Max-Planck-Gesellschaft finanziert.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Antarctic Phosphatase | NEB | M0289L | |
in vitro Transcription Grade Ultrapure Nucleotide Triphosphates | Jena Bioscience | NU-1010 – NU-1013 | |
Liquid chromatography, ktapurifier 100 | GE Healthcare | ||
DNA oligonucleotides | MWG Operon | ||
RNA oligonucleotides | MWG Operon | ||
Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 | |
PCR purification Kit | QIAGEN | 28104 | |
Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27106 | |
Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12163 | |
BamHI | NEB | R0136L | |
HindIII | NEB | R0104L | |
T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
T4 Polynucleotide Kinase | Ambion | AM2310 | |
T7 RNA Polymerase | own preparation | ||
Deoxynucleotide Solution Mix | NEB | N0447L | |
Mini-PROTEAN Tetra Electrophoresis System | Bio-Rad | 165-8001 | |
Storm 840 Scanner | GE Healthcare | 163723 | |
Storage Phosphorscreen | Molecular Dynamics | 63-0034-81 | |
Mono Q 5/50 GL | GE Healthcare | 17-5166-01 | |
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530L | use the GC buffer |
Toluidine Blue | Sigma | T3260 | |
pUC19 | NEB | N3041S | |
γ-[32P]-ATP, α-[32P]-ATP | Hartmann Analytic | SRP-401, SRP-307 |