CRISPR / Cas-systemer medierer adaptive immunitet i Bacteria og Archaea. Mange Cas proteiner foreslået at fungere som endoribonucleases virker på crRNA forstadier af varierende længde. Her viser vi tre forskellige tilgange til at generere pre-crRNA substrater for den biokemiske analyse af Cas endonuclease aktivitet.
Samspillet mellem vira og deres prokaryote værter formet udviklingen af bakteriel og archaeal liv. Prokaryoter udviklet flere strategier til at unddrage virus-angreb, der omfatter begrænsning modifikation, mislykkede infektion og CRISPR / Cas-systemer. Disse adaptive immunsystem findes i mange bakterier og de fleste Archaea består af c lustered r egularly i nterspaced s hort p alindromic r EPEAT (CRISPR) sekvenser og et antal C RISPR som associerede (Cas) generne (fig. 1) 1-3. Forskellige sæt af Cas-proteiner og gentager definere mindst tre store divergerende typer CRISPR / Cas-systemer 4. De universelle proteiner Cas1 og CAS2 foreslås at være involveret i udbredelsen af viral DNA, somvil generere en ny afstandselement mellem to gentagelser ved 5'-terminalen af en udragende CRISPR cluster 5. Hele klyngen transkriberes ind i en precursor-crRNA indeholdende alle spacer og gentagelsessekvenser og forarbejdes derefter af et enzym af forskellige Cas6 familien i mindre crRNAs 6-8. Disse crRNAs består af spacer-sekvens flankeret af en 5'-terminal (8 nucleotider) og en 3'-terminal tag afledt fra gentagelsessekvens 9. En gentagen infektion af viruset kan nu blokeret som ny crRNA vil blive instrueret af en Cas proteinkompleks (Cascade) til det virale DNA og identificere den som sådan via base komplementaritet 10. Endelig, for CRISPR / Cas type 1-systemer, vil nuclease Cas3 ødelægge den detekterede angriber DNA 11,12.
Disse processer definerer CRISPR / Cas som en adaptiv immunsystem prokaryoter og åbnede en fascinerende forskningsfelt for studiet af de involverede Cas proteiner.Funktionen af mange Cas-proteiner er stadig undvigende og årsagerne til den tilsyneladende mangfoldighed af CRISPR / Cas-systemer mangler at blive belyst. Potentielle aktiviteter af de fleste Cas proteiner blev forudsagt via detaljerede beregningsmæssige analyser. En større fraktion af Cas proteiner er enten vist eller foreslået at fungere som endonucleaser 4.
Her præsenteres metoder til at generere crRNAs og precursor-cRNAs til studiet af Cas endoribonucleases. Forskellige endonuclease assays kræver enten korte gentagne sekvenser, der kan umiddelbart syntetiseres som RNA-oligonukleotider eller længere crRNA og præ-crRNA sekvenser, der genereres via in vitro T7 RNA polymerase run-off transcription. Denne metode tillader inkorporering af radioaktive nukleotider til generering af internt mærkede endonuclease substrater og oprettelse af syntetiske eller mutant crRNAs. Cas6 endonuklease-aktivitet anvendes til modning før crRNAs i crRNAs med 5'-hydroxyl og en 2 ', 3'-cyklisk phosphat termini.
De præsenterede metoder gør det muligt generation af CAS endonuclease substrater af forskellige størrelsesområder og med varierende frihed i rækkefølge design. Den mest ligetil fremgangsmåde til generering af syntetiske RNA-oligonukleotid substrater er begrænset til korte RNA-motiver på grund af stigende omkostninger og tekniske begrænsninger i at skabe længere RNA-oligomerer. Mens vellykket RNA-syntese er blevet rapporteret for umodificerede RNA-oligomerer af mere end 100 nukleotider længde, praktisk og økonomisk maksimum for brugerdefinerede RNA-syntese ligger under 40 nucleotider. Imidlertid kan enhver given sekvens, syntetiseres og målrettet indførelse af modificerede nukleotider (f.eks deoxyribonukleotider) kan anvendes til at analysere spaltningssteder i detaljer. Længere pre-cRNAs skal genereres via in vitro transkription.
Annealing af oligonukleotider, der indeholder en T7 RNA-polymerase-promotor muliggør fremstilling af intermediær længde pre-crRNSom. Den maksimale længde af rutinemæssigt og økonomisk syntetiserede DNA-oligonukleotider er lige over 150 nukleotider, og repræsenterer den maksimale syntetiske pre-crRNAs via denne metode. Samlingen af flere annealede DNA oligonukleotidpar, som danner klæbrige ender med hinanden kan udvide denne maksimal længde, men kræver stigende udfordringer i kloning af konstruktionen. Den væsentligste fordel ved denne metode er evnen til at frembringe forud crRNA konstruktioner (og derfor Cas endonuklease substrater) med hvilken som helst ønsket sekvens. Dette tillader afprøvning af syntetiske crRNA designs.
Endelig kan større pre-crRNAs opnås fra PCR amplifikaterne af hele genomiske CRISPR elementer eller fraktioner deraf. Ændringer af in vitro transcription template plasmid kan indføres via site-directed mutagenese til frembringelse af præ-crRNA varianter. Disse konstruktioner kan anvendes til at analysere den globale endonukleolytisk spaltning mønster i en helpre-crRNA.
The pionerarbejde til fremstilling af umodificeret RNA via T7-RNA-polymerase in vitro transcription var baseret på transfer RNA'er 14 og brome mosaikvirus RNA 15. Den konsensus T7 RNA-polymerasepromotor består af en anerkendelse domæne (-17 til -5) og en indledning domæne (-4 gennem 6) med transkriptionsinitiering ved et væsentligt guanosin en 16. Positioner nedstrøms for en kan varieres som muliggør transkription af næsten alle ønskede RNA-sekvens. De præsenterede fremgangsmåder til generering in vitro run-off transcription skabeloner muliggør in vitro-syntese af komplette præ-crRNAs der svarer genomiske CRISPR regioner eller syntetiske pre-crRNA varianter. Transkripterne genereres med en 5'-terminal triphosphat stede medmindre transkriptionsreaktion primes med GMP til opnåelse af 5'-monophosphat termini 14. Sådanne terminaler er påkrævet, hvis transkripterne skal mærkesmed T4-polynukleotidkinase og γ-[32P]-ATP. Spaltningsaktivitet af Cas6 og Cas6-lignende enzymer genererer crRNA, der indeholder 5'-hydroxyl-og en 2 ', 3'-cyklisk phosphat termini. Disse RNA'er kan derefter analyseres for genkendelse af Cascade komplekset.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke Jeanette Schermuly til fremstilling af rekombinant T7 RNA-polymerase og Norman Ebelt for bistand til forberedelsen Figur 1. Dette arbejde blev finansieret af midler fra Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG FOR1680) og Max Planck Society.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Antarctic Phosphatase | NEB | M0289L | |
in vitro Transcription Grade Ultrapure Nucleotide Triphosphates | Jena Bioscience | NU-1010 – NU-1013 | |
Liquid chromatography, ktapurifier 100 | GE Healthcare | ||
DNA oligonucleotides | MWG Operon | ||
RNA oligonucleotides | MWG Operon | ||
Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 | |
PCR purification Kit | QIAGEN | 28104 | |
Spin Miniprep Kit | QIAGEN | 27106 | |
Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12163 | |
BamHI | NEB | R0136L | |
HindIII | NEB | R0104L | |
T4 DNA Ligase | NEB | M0202S | |
T4 Polynucleotide Kinase | Ambion | AM2310 | |
T7 RNA Polymerase | own preparation | ||
Deoxynucleotide Solution Mix | NEB | N0447L | |
Mini-PROTEAN Tetra Electrophoresis System | Bio-Rad | 165-8001 | |
Storm 840 Scanner | GE Healthcare | 163723 | |
Storage Phosphorscreen | Molecular Dynamics | 63-0034-81 | |
Mono Q 5/50 GL | GE Healthcare | 17-5166-01 | |
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530L | use the GC buffer |
Toluidine Blue | Sigma | T3260 | |
pUC19 | NEB | N3041S | |
γ-[32P]-ATP, α-[32P]-ATP | Hartmann Analytic | SRP-401, SRP-307 |