CRISPR / कैस सिस्टम Endonucleases लिए सब्सट्रेट जनरेशन

Summary

CRISPR / कैस बैक्टीरिया और archaea में प्रणालियों मध्यस्थता प्रतिरक्षा अनुकूली. कई कैस प्रोटीन करने के लिए लंबाई बदलती के crRNA व्यापारियों पर अभिनय endoribonucleases के रूप में कार्य करने का प्रस्ताव कर रहे हैं. यहाँ हम तीन अलग अलग दृष्टिकोण का वर्णन करने के लिए कैस endonuclease गतिविधि के जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए पूर्व crRNA substrates उत्पन्न.

Abstract

The interaction of viruses and their prokaryotic hosts shaped the evolution of bacterial and archaeal life. Prokaryotes developed several strategies to evade viral attacks that include restriction modification, abortive infection and CRISPR/Cas systems. These adaptive immune systems found in many Bacteria and most Archaea consist of clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR) sequences and a number of CRISPR associated (Cas) genes (Fig. 1) ^1-3. Different sets of Cas proteins and repeats define at least three major divergent types of CRISPR/Cas systems ⁴. The universal proteins Cas1 and Cas2 are proposed to be involved in the uptake of viral DNA that will generate a new spacer element between two repeats at the 5′ terminus of an extending CRISPR cluster ⁵. The entire cluster is transcribed into a precursor-crRNA containing all spacer and repeat sequences and is subsequently processed by an enzyme of the diverse Cas6 family into smaller crRNAs ^6-8. These crRNAs consist of the spacer sequence flanked by a 5′ terminal (8 nucleotides) and a 3′ terminal tag derived from the repeat sequence ⁹. A repeated infection of the virus can now be blocked as the new crRNA will be directed by a Cas protein complex (Cascade) to the viral DNA and identify it as such via base complementarity¹⁰. Finally, for CRISPR/Cas type 1 systems, the nuclease Cas3 will destroy the detected invader DNA ^11,12 .

These processes define CRISPR/Cas as an adaptive immune system of prokaryotes and opened a fascinating research field for the study of the involved Cas proteins. The function of many Cas proteins is still elusive and the causes for the apparent diversity of the CRISPR/Cas systems remain to be illuminated. Potential activities of most Cas proteins were predicted via detailed computational analyses. A major fraction of Cas proteins are either shown or proposed to function as endonucleases ⁴.

Here, we present methods to generate crRNAs and precursor-cRNAs for the study of Cas endoribonucleases. Different endonuclease assays require either short repeat sequences that can directly be synthesized as RNA oligonucleotides or longer crRNA and pre-crRNA sequences that are generated via in vitro T7 RNA polymerase run-off transcription. This methodology allows the incorporation of radioactive nucleotides for the generation of internally labeled endonuclease substrates and the creation of synthetic or mutant crRNAs. Cas6 endonuclease activity is utilized to mature pre-crRNAs into crRNAs with 5′-hydroxyl and a 2′,3′-cyclic phosphate termini.

Protocol

1. लंबे समय से पूर्व crRNA substrates पीसीआर के माध्यम से पीढ़ी डिजाइन पीसीआर प्राइमरों एक CRISPR क्लस्टर के स्पेसर क्षेत्रों को लक्षित है. T7 आरएनए पोलीमरेज़ जोड़ें (T7RNAP) प्रमोटर आगे और क्लोनिंग के लिए प्राइमर प्रतिबंध साइटों अनुक्रम (5 'taatacgactcactata 3') दोनों प्राइमरों (जैसे BamHI और हिंदुस्तान III pUC19 के लिए, छवि 2A) के लिए एक वेक्टर में पीसीआर उत्पाद . नोट: T7RNAP प्रतिलेखन की उचित दीक्षा के लिए एक guanidine अवशेषों की आवश्यकता है. जीनोमिक डीएनए पीसीआर द्वारा अपने हित के पूर्व crRNA अनुक्रम बढ़ाना. Agarose जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा अलग पीसीआर उत्पादों और जेल वांछित बैंड निकालने के. प्रतिबंध एंजाइमों के साथ पीसीआर उत्पाद डाइजेस्ट चिपचिपा समाप्त होता है (जैसे BamHI और HindIII, छवि 2A) बनाने. एक पीसीआर शुद्धि किट के साथ अपने उत्पाद को पीसीआर शुद्ध द्वारा उत्पादों दरार को खत्म करने के लिए. एक ligation प्रतिक्रिया है कि टी -4 डीएनए ligase होता है, टी -4 डीएनए ligase बफर और सेटcleaved पीसीआर उत्पाद और इसी चिपचिपा के साथ समाप्त होता है dephosphorylated रैखिक PUC वेक्टर के एक 3:1 दाढ़ अनुपात. 16 ° रातोंरात सी मिश्रण सेते हैं. रूपांतरण सक्षम Escherichia कोलाई DH5α कोशिकाओं में मानक प्रोटोकॉल द्वारा ligation मिश्रण और नीला सफेद स्क्रीनिंग का उपयोग करने के लिए सफल ligation की पहचान. Plasmids सफेद कालोनियों एक प्लाज्मिड तैयारी किट का उपयोग कर से अलग. प्लाज्मिड अनुक्रमण द्वारा सकारात्मक क्लोनों को पहचानें. वैकल्पिक रूप से, कॉलोनी पीसीआर स्क्रीनिंग के लिए उपयोग किया जा सकता है. 2. मध्यवर्ती पूर्व crRNA substrates के डीएनए oligonucleotides की annealing के माध्यम से पीढ़ी आगे डिजाइन और वांछित CRISPR अनुक्रम / दोहराने स्पेसर साथ oligonucleotides रिवर्स. oligonucleotides एक T7 RNAP के रूप में के रूप में अच्छी तरह से प्रमोटर टर्मिनल प्रतिबंध साइटों (जैसे BamHI और pUC19 के लिए हिंद III) के अनुक्रम होते हैं. Oligonucleotides बर्खास्त annealing के बाद कि चिपचिपा समाप्त होता है फार्म को सुनिश्चित करने के लिए (चित्र देखें 2B. </sटुनिशिया>). 5'-phosphorylate एक अलग 20μl T4 polynucleotide kinase के 5 μl (PNK), टी -4 PNK 10x बफर, 2 μl एटीपी (10 मिमी) के 2 μl युक्त प्रतिक्रिया 1 प्रत्येक oligonucleotide के nmol. 37 में 1 घंटे के लिए प्रत्येक नमूना सेते डिग्री सेल्सियस दो phosphorylated oligonucleotides संकरण. गठबंधन phosphorylated आगे oligo (2.2 से.) मिश्रण, phosphorylated रिवर्स oligo (2.2 से.) मिश्रण, एक 10 μl प्रतिक्रिया में टी -4 डीएनए ligase 10x बफर के 1 μl 1 μl की 1μl. 5 मिनट के लिए 95 पर नमूने सेते ° सी एक हीटिंग ब्लॉक या उबलते पानी में, गर्मी स्रोत बारी और मिश्रण कमरे के तापमान (~ 2-3 घंटे) के लिए शांत करते हैं. नोट: इस महत्वपूर्ण चरण में, प्रत्येक एकल oligonucleotide के भीतर संरचनाओं के गठन की तुलना में धीमी गति से ठंडा करने की प्रक्रिया दो के oligonucleotides annealing के पक्ष में है. कटी घमनी को बांधना संकरण मिश्रण के 4 μl, और पचा dephosphorylated PUC वेक्टर के 1μl (0.1 ग्राम /μl) टी -4 डीएनए ligase, टी -4 का डीएनए ligase 10x बफर और एक 20 μl ligation मिश्रण में 10 मिमी एटीपी के साथ. 16 ° रातोंरात सी नमूना सेते हैं. सक्षम Escherichia कोलाई DH5α कोशिकाओं में ligated plasmids और मानक प्रोटोकॉल द्वारा रूपांतरण नीले सफेद स्क्रीनिंग का उपयोग. Plasmids अलग और पाचन (इच्छित आकार के आवेषण के लिए स्क्रीन) और बाद में प्लाज्मिड अनुक्रमण के द्वारा सकारात्मक क्लोनों की पहचान. 3. कम कॅस आरएनए substrates के कस्टम आरएनए oligonucleotide संश्लेषण के माध्यम से पीढ़ी डिजाइन कम कॅस आरएनए (जैसे एकल दोहराने दृश्यों, चित्र 2C) substrates और कस्टम आरएनए oligonucleotide संश्लेषण सुविधाओं का उपयोग. नोट: एक शाही सेना oligonucleotide के एक निर्दिष्ट स्थिति (छवि 2C) में एक deoxyribonucleotide के शामिल किए जाने के आरएनए दरार की साइट तुच्छ इस्तेमाल किया जा सकता है. 4 में इन विट्रो टी7 आरएनए पोलीमरेज़ प्रतिलेखन Plasmids अपने डिजाइन (1.9 या 2.7 से.) का निर्माण एक maxiprep प्लाज्मिड शुद्धि किट का उपयोग कर के साथ अलग. प्रतिबंध एंजाइम कि क्लोन टुकड़ा (जैसे HindIII) के बहाव cleaves साथ प्लाज्मिड linearize. पूर्ण पाचन सुनिश्चित करें. नोट: यदि आरएनए प्रतिलिपि के भिन्न परिभाषित 'टर्मिनस 3 वांछित है, डिजाइन का निर्माण "रन से" HindIII अनुक्रम के प्रतिलेखन के लिए नदी के ऊपर एक अतिरिक्त विशिष्ट प्रतिबंध साइट शामिल करना चाहिए. क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण (1:1) और इथेनॉल घन: phenol द्वारा linearized प्लाज्मिड शुद्ध. DEPC इलाज बाँझ पानी में गोली resuspending न्यूक्लिक एसिड पुनर्प्राप्त. सेट अप इन विट्रो T7 RNAP में एक बंद प्रतिलेखन मिश्रण है जिसमें 40 मिमी HEPES / KOH (8 पीएच), 22 मिमी 2 MgCl, 5 मिमी dithiothreitol, 1 मिमी spermidine, प्रत्येक न्यूक्लीओसाइड triphosphate (एटीपी, CTP, GTP, UTP के 4 मिमी चलाने ), 40-100 ग्राम / पचा मिलीलीटरप्लाज्मिड और DEPC इलाज पानी में 0.1 मिलीग्राम / एमएल T7 RNAP. 37 में 3 घंटे के लिए सेते डिग्री सेल्सियस 8 एम यूरिया denaturing 12% polyacrylamide जेल (छवि 3 ए) पर प्राप्त शाही सेना टेप का विश्लेषण. शाही सेना टेप मोनो क्यू आयनों विनिमय क्रोमैटोग्राफी 13 के माध्यम से शुद्ध किया जा सकता है और आरएनए DEPC इलाज बाँझ पानी में और गोली के resuspension fractions का इथेनॉल घन द्वारा बरामद. भविष्य में इस्तेमाल के लिए, -80 में शाही सेना की दुकान ° सी. 5. Cas6 endonuclease परख एक सेट इन विट्रो T7 RNAP में 20 μl प्रतिलेखन मिश्रण चलाने (4.4 देखें) है कि 2 मिमी एटीपी के एक कम मात्रा में होता है और साथ पूरित 2.5 μl α [32 पी] एटीपी (10 एमसीआई / एमएल, 5000 Ci mmol /). Denaturing 8 एम यूरिया 12% polyacrylamide जेल से जेल निष्कर्षण के माध्यम से प्रतिक्रिया उत्पादों शुद्ध. Autoradiography द्वारा बैंड कल्पना. उत्पादन और वांछित रीकॉम्बीनैंट कॅस प्रोटीन को शुद्ध. इस उदाहरण में सी,एक as6 क्लोस्ट्रीडियम thermocellum से गर्मी और वर्षा नी NTA क्रोमैटोग्राफी के माध्यम से शुद्ध किया गया था. एक endonuclease परख (क्लोस्ट्रीडियम Cas6 thermocellum के लिए प्रतिक्रिया जैसे सेट, प्रतिक्रिया मिश्रण 20 मिमी HEPES (PH8 KOH), 250 मिमी KCl, 2 मिमी 2 MgCl, 1 मिमी डीटीटी, 12,000 सीपीएम आरएनए सब्सट्रेट और 1 सुक्ष्ममापी एंजाइम शामिल किया गया था और में incubated 37 ° C 30 मिनट के लिए). एक 8 एम यूरिया 12% polyacrylamide जेल पर प्रतिक्रिया मिश्रण (+ 10 μl आरएनए लोड हो रहा है 95 Formamide% से युक्त बफर) के 5 μl लोड. वैद्युतकणसंचलन बाद autoradiography द्वारा दरार उत्पादों कल्पना. 6. प्रतिनिधि परिणाम आरएनए substrates के कैस endonuclease गतिविधि के विश्लेषण के लिए एक उदाहरण चित्रा 3A में दिखाया गया है. विट्रो प्रतिलेखन प्रतिक्रिया में एक विश्लेषणात्मक 100 μl के 5 μl की एक अशेष भाजक भरी हुई थी. कृपया ध्यान दें कि आरएनए उत्पादन की क्षमता अलग constructs के बीच होती है. कुछ कारकों टीटोपी एक प्रतिलेखन दीक्षा के लिए आवश्यक जी, (ii) प्रतिलेखन दौरान शाही सेना संरचना गठन की संभावना है और (iii) पीढ़ी के लिए प्रतिबंध साइट के चुनाव के बाद प्राप्त शाही सेना की राशि (i) प्रारंभिक अनुक्रम को प्रभावित करने के लिए मनाया गया दरार रन से स्थिति की. आरएनए endonuclease गतिविधि की जांच के दोनों उच्च शुद्ध रीकॉम्बीनैंट कैस (3B छवि) प्रोटीन और उचित नकारात्मक नियंत्रण की आवश्यकता है. आदर्श रूप में, इस नकारात्मक नियंत्रण नमूना जांच कॅस endonuclease प्रतिक्रिया से जितना संभव हो कम अलग है. यह शाही सेना की प्रतिक्रिया और कैस अभिव्यक्ति (और समान शोधन प्रक्रिया का पालन करने के लिए) के बिना सेल lysate बफर के साथ ऊष्मायन द्वारा प्राप्त किया जा सकता है. एक आदर्श नकारात्मक नियंत्रण प्रस्तावित दरार साइट पर एक deoxyribonucleotide के अलावा है. चित्रा 3C में, 5 'टर्मिनल लेबल दोहराने अनुक्रम में दरार क्लोस्ट्रीडियम thermocellum Cas6 के लिए दिखाया गया है. नीचे समान शर्तों, इस दोहराने सब्सट्रेट अब और नहीं है जब एक deoxyribonucleotide -9 स्थिति में शुरू की है. इस पद्धति का भी दरार साइट के बारे में जानकारी प्रदान करता है. अंत में, एक लंबे आंतरिक लेबल पूर्व crRNA Cas6 द्वारा cleaved है और दो दरार टुकड़े मनाया जाता है. चित्रा 1 / CRISPR कॅस गतिविधि योजनाबद्ध सिंहावलोकन. सिंहावलोकन CRISPR क्लस्टर (अनुकूलन), प्रतिलेखन और CRISPR सरणी के प्रसंस्करण एक Cas6 endonuclease द्वारा छोटे crRNAs में, Cascade जटिल में crRNAs की तेज और एक के हस्तक्षेप में एक वायरल डीएनए अनुक्रम (protospacer) की प्रविष्टि के बाद वायरल complementarity crRNA और protospacer के बीच के आधार पर हमले दोहराया. आसन्न Protospacer (PAM) रूपांकनों निशान वायरल protospacer दृश्यों. 2 igure "src =" files/ftp_upload/4277/4277fig2.jpg / "/> चित्रा 2 कैस प्रोटीन के लिए शाही सेना substrates के सृजन. योजना पैदा (ए) लंबे समय के substrates पूर्व crRNA, (बी) मध्यवर्ती पूर्व crRNA substrates और (सी) कम पूर्व crRNA उत्पादन के लिए कैस आरएनए substrates के लिए कार्यप्रवाह दिखाता है. उदाहरण दृश्यों क्लोस्ट्रीडियम thermocellum CRISPR सरणी के लिए प्रस्तुत कर रहे हैं. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें . चित्रा 3 Cas6 endonuclease परख. ए) Toluidine नीले रंग की एक कस्टम डिजाइन आरएनए oligonucleotide (250 pmol) के दाग polyacrylamide जेल और दो ​​में इन विट्रो शाही सेना टेप (एक ठेठ 100 μl प्रतिक्रिया के 5 μl). बी) एसडीएस पृष्ठ क्लोस्ट्रीडियम thermocellum से एक Cas6 (80 pmol) गर्मी के बाद तैयारी की जेल50 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटा और नी NTA क्रोमैटोग्राफी के लिए वर्षा. सी.) 5 'टर्मिनल लेबल दोहराने दृश्यों और इन विट्रो टेप में पूर्व crRNA लिए endonucleolytic Cas6 गतिविधि की जांच. -9 स्थिति dNTP की शुरूआत एक छोटी कॅस आरएनए (एस, चित्र 2C) सब्सट्रेट के लिए Cas6 दरार abolishes. लंबे समय से पूर्व crRNA substrates (एल, छवि 2A) से crRNA परिपक्वता के लिए एक 'टर्मिनल 5 8 NT के टैग भी उत्पन्न होता है. बैंड denaturing 8 एम यूरिया 12% polyacrylamide जेल पर अलग हो गए थे और autoradiography द्वारा visualized.

Discussion

प्रस्तुत तरीकों कैस विभिन्न आकार पर्वतमाला के endonuclease substrates की पीढ़ी सक्षम और अनुक्रम के डिजाइन में स्वतंत्रता के साथ अलग. सिंथेटिक आरएनए oligonucleotide substrates की पीढ़ी के लिए सबसे सीधे आगे दृष्टिकोण शाही सेना कम अब आरएनए oligomers बनाने में बढ़ती लागत और तकनीकी सीमाओं के कारण डिजाइन करने के लिए सीमित है. जबकि सफल आरएनए संश्लेषण पर 100 nucleotides लंबाई के असंशोधित आरएनए oligomers के लिए सूचित किया गया है, कस्टम आरएनए संश्लेषण के लिए व्यावहारिक और किफायती अधिकतम 40 nucleotides के नीचे स्थित है. हालांकि, किसी भी अनुक्रम और संश्लेषित किया जा सकता है संशोधित nucleotides (जैसे deoxyribonucleotides) की शुरुआत करने के लिए लक्षित विस्तार में दरार साइटों का विश्लेषण करने के लिए उपयोग किया जा सकता है. विट्रो प्रतिलेखन में अब पूर्व CRNAs के माध्यम से उत्पन्न होना चाहिए.

oligonucleotides है कि एक T7 आरएनए पोलीमरेज़ प्रमोटर शामिल की annealing मध्यवर्ती लंबाई पूर्व crRN के उत्पादन के लिए अनुमति देता हैके रूप में. नियमित रूप से और आर्थिक रूप से संश्लेषित डीएनए oligonucleotides की अधिकतम लंबाई 150 nucleotides बस के ऊपर है और इस विधि के माध्यम से सिंथेटिक पूर्व crRNAs के अधिकतम का प्रतिनिधित्व करता है. कई annealed डीएनए oligonucleotide जोड़े कि चिपचिपा समाप्त होता है एक दूसरे के साथ फार्म की विधानसभा इस अधिकतम लंबाई बढ़ाने लेकिन निर्माण के क्लोनिंग में बढ़ती चुनौतियों आवश्यक कर सकते हैं. इस विधि का मुख्य लाभ के लिए किसी भी इच्छित क्रम के साथ पूर्व crRNA constructs (और इसलिए substrates कॅस endonuclease) उत्पन्न करने की क्षमता है. यह सिंथेटिक crRNA डिजाइनों के परीक्षण की अनुमति देता है.

अंत में, बड़े पूर्व crRNAs पूरे जीनोमिक CRISPR तत्वों या fractions क्या पीसीआर amplificates से प्राप्त किया जा सकता है. साइट निर्देशित mutagenesis के माध्यम से पूर्व crRNA वेरिएंट की पीढ़ी के लिए करने के लिए परिवर्तन इन विट्रो प्रतिलेखन प्लाज्मिड टेम्पलेट में पेश किया जा सकता है. इन constructs वैश्विक एक पूरे के भीतर endonucleolytic दरार पैटर्न का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैपूर्व crRNA

विट्रो प्रतिलेखन में T7 आरएनए पोलीमरेज़ माध्यम असंशोधित शाही सेना के उत्पादन के लिए अग्रणी काम हस्तांतरण ¹⁴ RNAs और Brome मोज़ेक वायरस आरएनए ¹⁵ के आधार पर किया गया था. आम सहमति T7 आरएनए पोलीमरेज़ प्रमोटर एक मान्यता डोमेन (-17 -5 के माध्यम से) और एक आवश्यक ग्वानोसिन एक ¹⁶ प्रतिलेखन दीक्षा के साथ एक दीक्षा डोमेन (6 के माध्यम से -4) के होते हैं. एक की पोजिशन अनुप्रवाह विविध जा सकता है जो लगभग किसी भी वांछित आरएनए अनुक्रम के प्रतिलेखन के लिए अनुमति देता है. इन विट्रो रन से प्रतिलेखन टेम्पलेट्स में पैदा करने के लिए प्रस्तुत तरीकों पूरा पूर्व crRNAs है कि जीनोमिक CRISPR क्षेत्रों या सिंथेटिक पूर्व crRNA वेरिएंट मैच के इन विट्रो संश्लेषण के लिए अनुमति देते हैं. टेप एक triphosphate 5'वर्तमान टर्मिनल के साथ उत्पन्न कर रहे हैं जब तक कि प्रतिलेखन प्रतिक्रिया जीएमपी के साथ primed है monophosphate 5 ^'14 टर्मिनी प्राप्त. ऐसे टर्मिनी अगर टेप करने के लिए लेबल किया जाना आवश्यक हैंT4 polynucleotide kinase और γ ^[32] पी एटीपी. के विखंडन गतिविधि Cas6 और Cas6 तरह एंजाइमों crRNA है कि 5'-हाइड्रॉक्सिल और एक 2 ', 3'चक्रीय फॉस्फेट टर्मिनी होते उत्पन्न. इन RNAs तो Cascade जटिल द्वारा मान्यता के लिए विश्लेषण किया जा सकता है.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Antarctic Phosphatase	NEB	M0289L
in vitro Transcription Grade Ultrapure Nucleotide Triphosphates	Jena Bioscience	NU-1010 – NU-1013
Liquid chromatography, ktapurifier 100	GE Healthcare
DNA oligonucleotides	MWG Operon
RNA oligonucleotides	MWG Operon
Gel Extraction Kit	QIAGEN	28704
PCR purification Kit	QIAGEN	28104
Spin Miniprep Kit	QIAGEN	27106
Plasmid Maxi Kit	QIAGEN	12163
BamHI	NEB	R0136L
HindIII	NEB	R0104L
T4 DNA Ligase	NEB	M0202S
T4 Polynucleotide Kinase	Ambion	AM2310
T7 RNA Polymerase	own preparation
Deoxynucleotide Solution Mix	NEB	N0447L
Mini-PROTEAN Tetra Electrophoresis System	Bio-Rad	165-8001
Storm 840 Scanner	GE Healthcare	163723
Storage Phosphorscreen	Molecular Dynamics	63-0034-81
Mono Q 5/50 GL	GE Healthcare	17-5166-01
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	NEB	M0530L	use the GC buffer
Toluidine Blue	Sigma	T3260
pUC19	NEB	N3041S
γ-[32P]-ATP, α-[32P]-ATP	Hartmann Analytic	SRP-401, SRP-307