Gelijktijdig Intracellulaire opnemen van een lumbale motoneuron en de kracht die door de motor in de volwassen muis<em> In vivo</em

Summary

Deze nieuwe methode maakt het gelijktijdig intracellulaire opname van een volwassen muis motoneuron en de meting van de kracht die door de spiervezels. De gecombineerde onderzoek van de elektrische en mechanische eigenschappen van motoreenheden in normale en genetisch gemodificeerde dieren is een doorbraak voor de studie van het neuromusculaire systeem.

Abstract

De spinale motoneuron al lang goed model voor het bestuderen neurale functie omdat het een neuron van het centrale zenuwstelsel met de voordelen van (1) met omlijnd targets (spiervezels) en dus met een zeer bekende functie (spier contractie beheersen); (2) is de convergente doelwit van vele spinale en dalend netwerken, vandaar de naam "uiteindelijke gewone weg", en (3) met een grote soma die het mogelijk maakt om te penetreren met scherpe elektroden intracellulaire . Bovendien, als in vivo, is het mogelijk tegelijkertijd de elektrische activiteit van de motoneuronen en de kracht die door de spier targets. Uitvoeren intracellulaire opnamen van motorneuronen in vivo daarom het experimentator in de unieke positie te kunnen bestuderen, tegelijkertijd, alle compartimenten van de "aandrijving" (de naam van de motoneuron, het axon ende spiervezels het innerveert ^1): de ingangen afbreuk te doen aan de motoneuron, de elektrofysiologische eigenschappen van het motoneuron, en de impact van deze eigenschappen op de fysiologische functie van de motoneuronen, dwz de kracht die door de motor. Deze benadering is uitdagend omdat de bereiding niet kan verlamd en daarmee de mechanische stabiliteit voor de intracellulaire opname verminderd. Zo heeft dit soort experimenten alleen bereikt bij katten en ratten. Anderzijds kan de studie van spinale motorische systemen maken een enorme sprong of het mogelijk was om dergelijke experimenten in normale en genetisch gemodificeerde muizen.

Om technische redenen is de studie van de spinale netwerken in muizen meestal is beperkt tot neonatale in vitro preparaten die de motoneuronen en het ruggenmerg netwerken zijn onvolwassen, zijn de motoneuronen gescheiden van hun doelen, en toen studeerde in plakjes, de motoneurons gescheiden van het grootste deel van hun ingangen. Tot voor kort had maar een paar groepen in geslaagd om intracellulaire opnames van motoneuronen te voeren in vivo ^2-4, met inbegrip van ons team die publiceerde een nieuw preparaat die ons toeliet om zeer stabiele opnamen van motoneuronen te verkrijgen in vivo bij volwassen muizen ^5,6. Echter, deze opnamen verkregen in verlamde dieren, dus zonder de mogelijkheid om de kracht output van deze motoneuronen nemen. Hier geven we een uitbreiding van deze oorspronkelijke preparaat waarin we konden gelijktijdige opnamen van de elektrofysiologische eigenschappen van de motoneuronen en de kracht die door de aandrijving te verkrijgen. Dit is een belangrijk resultaat, omdat het ons in staat stelt om de verschillende types van motoneuronen te identificeren op basis van hun kracht profiel, en daardoor onthullen hun functie. In combinatie met genetische modellen te storen spinale segmentale circuits ^7-9, of reproducting menselijke disease ^10,11, verwachten we dat deze techniek een essentieel instrument voor de studie van spinale motorische systeem.

Protocol

1. Stap een Preanesthetisch medicatie: 10-15 min vóór de inductie van de anesthesie, injecteren atropine (0,20 mg / kg) en methylprenidsolone (0,05 mg) subcutaan te kwijlen en oedeem respectievelijk voorkomen. 2. Stap twee Inductie van anesthesie: injecteren pentobarbitalnatrium (70 mg / kg) of een mengsel van ketamine / xylazine (100 mg / kg en 10 mg / kg) intra-peritoneaal. Laat de muis gaan onder tot er geen teen knijpen reflex kan w…

Representative Results

Figuur 1 toont hoe het identificeren van een motoneuron de Triceps surae groep na penetratie. Bij lage intensiteit van de stimulatie kan slechts een monosynaptic EPSP worden waargenomen (Figuur 1A). Bij hogere intensiteit kan de EPSP zijn groot genoeg om een "orthodromic" spike (Figuur 1B) activeren. Nog hogere stimulatie-intensiteit, een alles-of-niets antidromic spike weergegeven met een kortere vertraging dan monosynaptic EPSP (Figuur 1C). …

Discussion

De bereiding hier beschreven is het eerste dat toelaat in de volwassen muis, gelijktijdig intracellulaire opname van een lumbale motoneuron en de meting van de kracht die door de spiervezels geïnnerveerd door de axon.

Door de kleine grootte van het dier, kan de chirurgische vaardigheden voor dit preparaat tegen te verwerven. Echter, zodra de vaardigheden meester is, kan de hele operatie worden uitgevoerd in drie uur en de dieren overleven tot 7 uur na de afloop van de chirurgische procedure…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Atropine sulfate	Aguettant
Methylprenidsolone	Pfizer	Solu-Medrol
Sodium pentobarbitone	Sanofi-Aventis	Pentobarbital
Ketamine
Xylazine
Glucose
Plasma expander	Roger Bellon	Plasmagel
Blunt scissors	FST	14079-10
Blunt fine scissors	FST	15025-10
Vannas Spring Scissors	FST	15002-08
Fine forceps serrated	FST	11370-32
Fine forceps serrated	FST	11370-31
Cunningham Spinal Adaptor	Stoelting Co.
Kwik-Cast sealant	WPI	#KWIK-CAST
Ventilator	CWE Inc	SAR-830/AP
Capnograph	CWE Inc	μcapstar
Heating blanket	Harvard Apparatus	507221F
Intracellular amplifier	Axon Instruments	Axoclamp 2B
Pipette puller	Sutter Instruments	P-97
KCl	Sigma-Aldrich	P9333-500G