Gravação Intracelular simultânea de um motoneurônio lombar e a força produzida pelo seu motor no Rato Adulto<em> Em vivo</em

Summary

Este método novo permite a gravação simultânea intracelular de um motoneurônio único adulto rato e a medição da força produzida por suas fibras musculares. A investigação combinado das propriedades eléctricas e mecânicas das unidades motoras em animais normais e geneticamente modificadas é um avanço para o estudo do sistema neuromuscular.

Abstract

O motoneurônio espinhal tem sido um sistema modelo bom para estudar a função neural, porque é um neurónio do sistema nervoso central, com as propriedades únicas de (1) tendo alvos prontamente identificáveis ​​(fibras musculares) e, portanto, tem uma função bem conhecido (para controlar a contracção muscular), (2) ser o alvo convergente de muitas redes e descendente da coluna vertebral, daí o nome de "via comum final", e (3), com uma soma grande que faz com que seja possível a penetração los com afiadas eletrodos intracelulares . Além disso, quando estudados in vivo, é possível gravar, simultaneamente, a actividade eléctrica dos motoneurónios e da força desenvolvida pelo músculo seus alvos. Realizando gravações intracelulares de motoneurónios in vivo, por conseguinte, colocar o experimentalista, na posição única de ser capaz de estudar, ao mesmo tempo, todos os compartimentos da "unidade motora" (o nome dado à motoneurónio, do seu axónio, eas fibras musculares que inerva ^1): Os insumos que incidem sobre o motoneurônio, as propriedades eletrofisiológicas do motoneurônio, eo impacto destas propriedades em função fisiológica dos neurônios motores, ou seja, a força produzida por seu motor. No entanto, esta abordagem é muito difícil, porque a preparação não pode ser paralisado e, assim, a estabilidade mecânica para a gravação intracelular é reduzida. Assim, este tipo de experiências só foi alcançado em gatos e em ratos. No entanto, o estudo dos sistemas motores espinais poderia fazer um salto formidável se que era possível realizar experiências semelhantes em ratinhos normais e geneticamente modificados.

Por razões técnicas, o estudo das redes espinhal em ratos, principalmente se limitado a neonatal em preparações in vitro, onde os neurônios motores e as redes espinhal são imaturos, os neurônios motores são separados de suas metas, e quando estudado em fatias, o MOtoneurons são separadas a maior parte das suas entradas. Até recentemente, apenas alguns grupos conseguiram realizar gravações intracelulares de motoneurônios in vivo ^2-4, incluindo a nossa equipe, que publicou uma nova preparação que nos permitiu obter gravações muito estáveis ​​de motoneurônios in vivo em camundongos adultos ^5,6. No entanto, estas gravações foram obtidos em animais paralisados, isto é, sem a possibilidade de gravar a saída força destes neurónios motores. Aqui apresentamos uma extensão da preparação original em que fomos capazes de obter gravações simultâneas das propriedades eletrofisiológicas das motoneurônios e da força desenvolvida por seu motor. Esta é uma conquista importante, pois nos permite identificar os diferentes tipos de neurônios motores com base no seu perfil de força, e revelando assim a sua função. Juntamente com modelos genéticos perturbar circuito segmentar vertebral ^7-9, ou reproduzindo doen humanaSE ^10,11, esperamos que esta técnica para ser uma ferramenta essencial para o estudo do sistema motor espinhal.

Protocol

1. Um passo Medicação pré-anestésica: 10-15 min antes da indução de anestesia, injetar atropina (0,20 mg / kg) e methylprenidsolone (0,05 mg) subcutaneamente para evitar salivação e edema, respectivamente. 2. Passo dois Indução da anestesia: injectar pentobarbital sódico (70 mg / kg) ou de uma mistura de cetamina / xilazina (100 mg / kg e 10 mg / kg, respectivamente), intraperitonealmente. Deixe o rato ir até sob nenhum reflex…

Representative Results

A Figura 1 mostra como identificar um motoneurônio do grupo tríceps sural após a penetração. Em intensidade de estimulação baixo, apenas uma EPSP monossináptico pode ser observado (Figura 1A). Com maior intensidade, o EPSP pode ser suficientemente grande para provocar uma "ortodrómica" pico (Figura 1B). Em intensidade de estimulação ainda maior, um tudo-ou-nada antidrômica espiga aparecer, com uma latência mais curta do que o EPSP monossináptico …

Discussion

A preparação descrita aqui é o primeiro que permite, no rato adulto, a gravação simultânea intracelular de um motoneurônio lombar e a medição da força produzida pelas fibras musculares inervadas por seu axónio.

Devido ao pequeno tamanho do animal, as técnicas cirúrgicas necessárias para esta preparação pode ser um desafio para adquirir. No entanto, uma vez que essas capacidades são dominados, a cirurgia inteira pode ser realizada em três horas, e os animais podem sobreviver…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Atropine sulfate	Aguettant
Methylprenidsolone	Pfizer	Solu-Medrol
Sodium pentobarbitone	Sanofi-Aventis	Pentobarbital
Ketamine
Xylazine
Glucose
Plasma expander	Roger Bellon	Plasmagel
Blunt scissors	FST	14079-10
Blunt fine scissors	FST	15025-10
Vannas Spring Scissors	FST	15002-08
Fine forceps serrated	FST	11370-32
Fine forceps serrated	FST	11370-31
Cunningham Spinal Adaptor	Stoelting Co.
Kwik-Cast sealant	WPI	#KWIK-CAST
Ventilator	CWE Inc	SAR-830/AP
Capnograph	CWE Inc	μcapstar
Heating blanket	Harvard Apparatus	507221F
Intracellular amplifier	Axon Instruments	Axoclamp 2B
Pipette puller	Sutter Instruments	P-97
KCl	Sigma-Aldrich	P9333-500G