Samtidig Intracellulær Innspillingen av en Lumbar Motoneuron og Force Produsert av sin Motor Unit i Adult Mouse<em> In vivo</em

Summary

Denne nye metoden åpner for samtidig intracellulære opptaket av en enkelt voksen mus motoneuron og måling av den kraft som produseres av sine muskelfibre. Kombinerte undersøkelse av de elektriske og mekaniske egenskaper av motoriske enheter i normal og genmodifiserte dyr er et gjennombrudd for studiet av nevromuskulære system.

Abstract

Spinal motoneuron har lenge vært en god modell system for å studere nervefunksjoner fordi det er et nevron av det sentrale nervesystemet med de unike egenskapene (1) som har lett identifiserbare mål (muskelfibrene) og derfor har en svært velkjent funksjon (for å kontrollere muskelkontraksjon), (2) å være den konvergent målet for mange rygg-og synkende nettverk, derav navnet "endelige felles vei", og (3) har et stort soma som gjør det mulig å trenge dem med skarpe intracellulære elektroder . Videre, når undersøkt in vivo, er det mulig å registrere samtidig den elektriske aktiviteten i motoneurons og kraften utviklet av deres muskel mål. Utføre intracellulære opptak av motoneurons in vivo derfor sette experimentalist i den unike posisjon av å kunne studere, på samme tid, alle avdelinger av "motorenhet" (navnet gitt til motoneuron, dens axon, ogmuskelfibrene det innervates ^1): innganger impinging på motoneuron de elektrofysiologiske egenskaper motoneuron, og virkningen av disse egenskapene på den fysiologiske funksjon av motoneurons, dvs. kraft produsert av sin motorenheten. Imidlertid er denne tilnærmingen svært utfordrende fordi fremstillingen kan ikke være lammet og dermed den mekaniske stabiliteten for den intracellulære opptaket er redusert. Dermed har denne typen eksperimenter kun oppnådd i katter og i rotter. Imidlertid kunne studere spinal motor systemer gjør en formidabel sprang hvis det var mulig å utføre lignende eksperimenter i normal og genmodifiserte mus.

Av tekniske årsaker har studien av spinal nettverk i mus stort sett blitt begrenset til neonatal in vitro preparater, der motoneurons og spinal nettverk er umoden, er motoneurons skilt fra sine mål, og når studert i skiver, den motoneurons er atskilt fra de fleste av sine innganger. Inntil nylig hadde bare noen få grupper klarte å utføre intracellulære opptak av motoneurons in vivo ^2-4, herunder vårt team som publiserte et nytt preparat som tillater oss å få svært stabile opptak av motoneurons in vivo hos voksne mus ^5,6. Imidlertid ble disse innspillingene oppnådd i lamme dyr, dvs. uten muligheten til å spille kraften produksjon av disse motoneurons. Her presenterer vi en forlengelse av denne originalpreparatet der vi var i stand til å skaffe samtidige opptak av elektrofysiologiske egenskapene til motoneurons og av kraften utviklet av deres motorenheten. Dette er et viktig resultat, som det tillater oss å identifisere de ulike typer motoneurons basert på deres styrke profil, og dermed avsløre deres funksjon. Sammen med genetiske modeller urovekkende spinal segmentell krets ^7-9, eller reproducting human diseaSE ^10,11, forventer vi denne teknikken til å være et viktig verktøy for å studere spinal motor system.

Protocol

1. Step One Pre-anestesi medisiner: 10-15 min før induksjon av anestesi, injiserer atropin (0,20 mg / kg) og methylprenidsolone (0,05 mg) subkutant unngå spytt og ødem, henholdsvis. 2. Trinn to Induksjon av anestesi: injisere pentobarbital natrium (70 mg / kg) eller en blanding av ketamin / xylazin (100 mg / kg og 10 mg / kg, henholdsvis) intra-peritoneally. La musen gå under før noen tå klype refleks kan skaffes. Hvis anestesi virk…

Representative Results

Figur 1 viser hvordan å identifisere en motoneuron fra Triceps surae gruppen etter penetrasjon. Ved lav stimulering intensitet, kan bare en monosynaptisk EPSP overholdes (Figur 1A). Ved høyere intensitet, kan EPSP være store nok til å utløse en "orthodromic" spike (figur 1B). På enda høyere stimulering intensitet, vises en alt-eller-ingenting antidromic pigg, med en kortere ventetid enn monosynaptisk EPSP (figur 1C). Hvis nok strøm inj…

Discussion

Fremstillingen er beskrevet her er den første som tillater, i den voksne mus, simultan intracellulær opptak av en lumbal motoneuron og måling av den kraft som produseres av muskelfibrene innervated av axon sin.

På grunn av den lille størrelsen på dyret, kan de kirurgiske ferdigheter som kreves for dette preparatet være utfordrende å tilegne seg. Imidlertid, når disse ferdigheter er mestret, kan hele operasjonen utføres i tre timer, og dyrene kan overleve i opptil 7 flere timer ette…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Atropine sulfate	Aguettant
Methylprenidsolone	Pfizer	Solu-Medrol
Sodium pentobarbitone	Sanofi-Aventis	Pentobarbital
Ketamine
Xylazine
Glucose
Plasma expander	Roger Bellon	Plasmagel
Blunt scissors	FST	14079-10
Blunt fine scissors	FST	15025-10
Vannas Spring Scissors	FST	15002-08
Fine forceps serrated	FST	11370-32
Fine forceps serrated	FST	11370-31
Cunningham Spinal Adaptor	Stoelting Co.
Kwik-Cast sealant	WPI	#KWIK-CAST
Ventilator	CWE Inc	SAR-830/AP
Capnograph	CWE Inc	μcapstar
Heating blanket	Harvard Apparatus	507221F
Intracellular amplifier	Axon Instruments	Axoclamp 2B
Pipette puller	Sutter Instruments	P-97
KCl	Sigma-Aldrich	P9333-500G