Summary

Samtidig Intracellulär inspelning av en Lumbar Motoneuron och styrkans Producerad av dess motor enhet i vuxen mus<em> In vivo</em

Published: December 05, 2012
doi:

Summary

Denna nya metod gör det möjligt att samtidig intracellulära inspelning av en enda vuxen mus motoneuron och mätning av den kraft som produceras av dess muskelfibrer. Den kombinerade undersökningen av de elektriska och mekaniska egenskaperna hos motorenheter i normala och genetiskt modifierade djur är ett genombrott för studiet av det neuromuskulära systemet.

Abstract

Spinal motoneuron har länge varit en bra modell för att studera neural funktion eftersom det är en neuron i det centrala nervsystemet med de unika egenskaperna hos (1) med lätthet identifierbara mål (muskelfibrerna) och därför har en mycket välkänd funktion (för att kontrollera muskelkontraktion), (2) är den konvergerande målet för många spinal och fallande nätverk, därav namnet "slutlig gemensam väg", och (3) med en stor soma som gör det möjligt att penetrera dem med skarpa intracellulära elektroder . Dessutom, när studerats in vivo, är det möjligt att spela samtidigt den elektriska aktiviteten hos motoneuroner och den kraft som utvecklats av deras muskler mål. Utföra intracellulära inspelningar av motoneuroner in vivo därför sätta experimentalist i den unika positionen att kunna studera på samma gång, alla fack i "motorenheten" (namnet på den motoneuron, dess axon ochmuskelfibrerna det innerverar 1): input inkräkta på motoneuron de elektrofysiologiska egenskaper motoneuron, och effekterna av dessa egenskaper på den fysiologiska funktionen av motoneuroner, dvs den kraft som produceras av dess motorenhet. Emellertid är denna metod mycket utmanande eftersom preparatet inte kan vara förlamade och därmed den mekaniska stabiliteten för den intracellulära inspelningen reduceras. Sålunda har denna typ av experiment endast gjorts i katter och råttor. Emellertid kan studiet av spinal motorsystem göra en formidabel språng om det var möjligt att utföra liknande experiment i normala och genetiskt modifierade möss.

Av tekniska skäl har studier av spinal nätverk i möss mestadels begränsad till neonatal in vitro preparat där motoneuroner och spinal nätverk är omogen, är motoneuroner separerade från sina mål, och när studeras i skivor, MOtoneurons separeras från de flesta av sina insatsvaror. Tills nyligen hade endast ett fåtal grupper lyckats utföra intracellulära inspelningar av motoneuroner in vivo 2-4, inklusive vår grupp som publicerade ett nytt preparat som tillät oss att få mycket stabila inspelningar av motoneuroner in vivo i vuxna möss 5,6. Men dessa inspelningar som erhållits i förlamade djur, dvs utan möjlighet att spela in kraften ut dessa motoneuroner. Här presenterar vi en förlängning av denna ursprungliga beredningen som vi kunde få samtidiga inspelningar av elektrofysiologiska egenskaper motoneuroner och kraften som utvecklats av deras motorenhet. Detta är ett viktigt resultat, eftersom det tillåter oss att identifiera olika typer av motoneuroner baserat på deras styrka profil och därmed avslöjar deras funktion. Tillsammans med genetiska modeller störande spinal segmentell kretsar 7-9, eller reproducting humant disease 10,11, förväntar vi denna teknik för att vara ett viktigt verktyg för att studera spinal motorsystem.

Protocol

1. Steg ett Pre-anestesi medicin: 10-15 min före induktion av anestesi, injicera atropin (0,20 mg / kg) och methylprenidsolone (0,05 mg) subkutant för att förhindra salivering och ödem, respektive. 2. Steg två Induktion av anestesi: injicera pentobarbitalnatrium (70 mg / kg) eller en blandning av ketamin / xylazin (100 mg / kg och 10 mg / kg, respektive) intraperitonealt. Låt musen går under tills ingen tå nypa reflex kan erhålla…

Representative Results

Figur 1 visar hur man identifierar en motoneuron från Triceps surae gruppen efter penetration. Vid låg stimulering intensitet, kan bara en monosynaptiska EPSP observeras (Figur 1A). Vid högre intensitet, kan EPSP vara tillräckligt stor för att utlösa en "orthodromic" spik (Figur 1B). Vid ännu högre stimulans intensitet, visas en allt-eller-inget antidromic spik, med en kortare fördröjning än monosynaptiska EPSP (Figur 1C). Om tillr?…

Discussion

Framställningen som beskrivs här är det första som möjliggör, i vuxen mus, samtidig intracellulär inspelning av en lumbal motoneuron och mätning av den kraft som produceras av muskelfibrerna innerverade av dess axon.

På grund av den lilla storleken på djuret, kan de kirurgiska färdigheter som krävs för detta preparat vara utmanande att förvärva. Men när dessa färdigheter behärskas, kan hela operationen utföras i tre timmar, och djuren kan överleva i upp till 7 fler timmar…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Detta arbete blev möjligt tack vare ekonomiskt stöd från Fondation pour la Recherche Medicale (FRM), Milton Safenowitz Postdoktorsstipendium för ALS forskning (ALS Association), NIH NINDS Bidrag NS05462 och NS034382 och ANR Grant HyperMND.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
Atropine sulfate Aguettant
Methylprenidsolone Pfizer Solu-Medrol
Sodium pentobarbitone Sanofi-Aventis Pentobarbital
Ketamine
Xylazine
Glucose
Plasma expander Roger Bellon Plasmagel
Blunt scissors FST 14079-10
Blunt fine scissors FST 15025-10
Vannas Spring Scissors FST 15002-08
Fine forceps serrated FST 11370-32
Fine forceps serrated FST 11370-31
Cunningham Spinal Adaptor Stoelting Co.
Kwik-Cast sealant WPI #KWIK-CAST
Ventilator CWE Inc SAR-830/AP
Capnograph CWE Inc μcapstar
Heating blanket Harvard Apparatus 507221F
Intracellular amplifier Axon Instruments Axoclamp 2B
Pipette puller Sutter Instruments P-97
KCl Sigma-Aldrich P9333-500G

References

  1. Liddel, E. G. T., Sherrington, C. S. Recruitment and some other factors of reflex inhibition. Proc. R. Soc. London. B, 488-518 (1925).
  2. Huizar, P., Kuno, M., Miyata, Y. Electrophysiological properties of spinal motoneurones of normal and dystrophic mice. The Journal of physiology. 248, 231-246 (1975).
  3. Alstermark, B., Ogawa, J. In vivo recordings of bulbospinal excitation in adult mouse forelimb motoneurons. Journal of neurophysiology. 92, 1958-1962 (2004).
  4. Meehan, C. F., Sukiasyan, N., Zhang, M., Nielsen, J. B., Hultborn, H. Intrinsic properties of mouse lumbar motoneurons revealed by intracellular recording in vivo. Journal of neurophysiology. 103, 2599-2610 (2010).
  5. Manuel, M., et al. Fast kinetics, high-frequency oscillations, and subprimary firing range in adult mouse spinal motoneurons. J. Neurosci. 29, 11246-11256 (2009).
  6. Iglesias, C., et al. Mixed mode oscillations in mouse spinal motoneurons arise from a low excitability state. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 31, 5829-5840 (2011).
  7. Crone, S. A., Zhong, G., Harris-Warrick, R., Sharma, K. In mice lacking V2a interneurons, gait depends on speed of locomotion. J. Neurosci. 29, 7098-7109 (2009).
  8. Talpalar, A. E., et al. Identification of minimal neuronal networks involved in flexor-extensor alternation in the mammalian spinal cord. Neuron. 71, 1071-1084 (2011).
  9. Rabe, N., Gezelius, H., Vallstedt, A., Memic, F., Kullander, K. Netrin-1-dependent spinal interneuron subtypes are required for the formation of left-right alternating locomotor circuitry. J. Neurosci. 29, 15642-15649 (2009).
  10. Gurney, M. E., et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science. 264, 1772-1775 (1994).
  11. Cifuentes-Diaz, C., et al. Neurofilament accumulation at the motor endplate and lack of axonal sprouting in a spinal muscular atrophy mouse. Hum. Mol. Genet. 11, 1439-1447 (2002).
  12. Simpson, D. P. Prolonged (12 hours) intravenous anesthesia in the rat. Laboratory animal science. 47, 519-523 (1997).
  13. Burke, R. E. Motor Unit Types – Functional Specializations in Motor Control. Trends Neurosci. 3, 255-258 (1980).
  14. Kerkut, G. A., Bagust, J. The isolated mammalian spinal cord. Prog. Neurobiol. 46, 1-48 (1995).
  15. Carp, J. S., et al. An in vitro protocol for recording from spinal motoneurons of adult rats. Journal of Neurophysiology. 100, 474-481 (2008).
  16. Mitra, P., Brownstone, R. M. An In Vitro Spinal Cord Slice Preparation for Recording from Lumbar Motoneurons of the Adult Mouse. Journal of Neurophysiology. , (2011).
  17. Husch, A., Cramer, N., Harris-Warrick, R. M. Long duration perforated patch recordings from spinal interneurons of adult mice. Journal of Neurophysiology. , (2011).
  18. Manuel, M., Zytnicki, D. Alpha, beta and gamma motoneurons: functional diversity in the motor system’s final pathway. J. Integr. Neurosci. 10, 243-276 (2011).
  19. Nakanishi, S. T., Whelan, P. J. A decerebrate adult mouse model for examining the sensorimotor control of locomotion. Journal of Neurophysiology. 107, 500-515 (2012).
  20. Meehan, C. F., Grondahl, L., Nielsen, J. B., Hultborn, H. Fictive locomotion in the adult decerebrate and spinal mouse in vivo. The Journal of Physiology. 590, 289-300 (2012).

Play Video

Cite This Article
Manuel, M., Heckman, C. Simultaneous Intracellular Recording of a Lumbar Motoneuron and the Force Produced by its Motor Unit in the Adult Mouse In vivo. J. Vis. Exp. (70), e4312, doi:10.3791/4312 (2012).

View Video