Samtidig Intracellulär inspelning av en Lumbar Motoneuron och styrkans Producerad av dess motor enhet i vuxen mus<em> In vivo</em

Summary

Denna nya metod gör det möjligt att samtidig intracellulära inspelning av en enda vuxen mus motoneuron och mätning av den kraft som produceras av dess muskelfibrer. Den kombinerade undersökningen av de elektriska och mekaniska egenskaperna hos motorenheter i normala och genetiskt modifierade djur är ett genombrott för studiet av det neuromuskulära systemet.

Abstract

Spinal motoneuron har länge varit en bra modell för att studera neural funktion eftersom det är en neuron i det centrala nervsystemet med de unika egenskaperna hos (1) med lätthet identifierbara mål (muskelfibrerna) och därför har en mycket välkänd funktion (för att kontrollera muskelkontraktion), (2) är den konvergerande målet för många spinal och fallande nätverk, därav namnet "slutlig gemensam väg", och (3) med en stor soma som gör det möjligt att penetrera dem med skarpa intracellulära elektroder . Dessutom, när studerats in vivo, är det möjligt att spela samtidigt den elektriska aktiviteten hos motoneuroner och den kraft som utvecklats av deras muskler mål. Utföra intracellulära inspelningar av motoneuroner in vivo därför sätta experimentalist i den unika positionen att kunna studera på samma gång, alla fack i "motorenheten" (namnet på den motoneuron, dess axon ochmuskelfibrerna det innerverar ^1): input inkräkta på motoneuron de elektrofysiologiska egenskaper motoneuron, och effekterna av dessa egenskaper på den fysiologiska funktionen av motoneuroner, dvs den kraft som produceras av dess motorenhet. Emellertid är denna metod mycket utmanande eftersom preparatet inte kan vara förlamade och därmed den mekaniska stabiliteten för den intracellulära inspelningen reduceras. Sålunda har denna typ av experiment endast gjorts i katter och råttor. Emellertid kan studiet av spinal motorsystem göra en formidabel språng om det var möjligt att utföra liknande experiment i normala och genetiskt modifierade möss.

Av tekniska skäl har studier av spinal nätverk i möss mestadels begränsad till neonatal in vitro preparat där motoneuroner och spinal nätverk är omogen, är motoneuroner separerade från sina mål, och när studeras i skivor, MOtoneurons separeras från de flesta av sina insatsvaror. Tills nyligen hade endast ett fåtal grupper lyckats utföra intracellulära inspelningar av motoneuroner in vivo ^2-4, inklusive vår grupp som publicerade ett nytt preparat som tillät oss att få mycket stabila inspelningar av motoneuroner in vivo i vuxna möss ^5,6. Men dessa inspelningar som erhållits i förlamade djur, dvs utan möjlighet att spela in kraften ut dessa motoneuroner. Här presenterar vi en förlängning av denna ursprungliga beredningen som vi kunde få samtidiga inspelningar av elektrofysiologiska egenskaper motoneuroner och kraften som utvecklats av deras motorenhet. Detta är ett viktigt resultat, eftersom det tillåter oss att identifiera olika typer av motoneuroner baserat på deras styrka profil och därmed avslöjar deras funktion. Tillsammans med genetiska modeller störande spinal segmentell kretsar ^7-9, eller reproducting humant disease ^10,11, förväntar vi denna teknik för att vara ett viktigt verktyg för att studera spinal motorsystem.

Protocol

1. Steg ett Pre-anestesi medicin: 10-15 min före induktion av anestesi, injicera atropin (0,20 mg / kg) och methylprenidsolone (0,05 mg) subkutant för att förhindra salivering och ödem, respektive. 2. Steg två Induktion av anestesi: injicera pentobarbitalnatrium (70 mg / kg) eller en blandning av ketamin / xylazin (100 mg / kg och 10 mg / kg, respektive) intraperitonealt. Låt musen går under tills ingen tå nypa reflex kan erhålla…

Representative Results

Figur 1 visar hur man identifierar en motoneuron från Triceps surae gruppen efter penetration. Vid låg stimulering intensitet, kan bara en monosynaptiska EPSP observeras (Figur 1A). Vid högre intensitet, kan EPSP vara tillräckligt stor för att utlösa en "orthodromic" spik (Figur 1B). Vid ännu högre stimulans intensitet, visas en allt-eller-inget antidromic spik, med en kortare fördröjning än monosynaptiska EPSP (Figur 1C). Om tillr?…

Discussion

Framställningen som beskrivs här är det första som möjliggör, i vuxen mus, samtidig intracellulär inspelning av en lumbal motoneuron och mätning av den kraft som produceras av muskelfibrerna innerverade av dess axon.

På grund av den lilla storleken på djuret, kan de kirurgiska färdigheter som krävs för detta preparat vara utmanande att förvärva. Men när dessa färdigheter behärskas, kan hela operationen utföras i tre timmar, och djuren kan överleva i upp till 7 fler timmar…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Atropine sulfate	Aguettant
Methylprenidsolone	Pfizer	Solu-Medrol
Sodium pentobarbitone	Sanofi-Aventis	Pentobarbital
Ketamine
Xylazine
Glucose
Plasma expander	Roger Bellon	Plasmagel
Blunt scissors	FST	14079-10
Blunt fine scissors	FST	15025-10
Vannas Spring Scissors	FST	15002-08
Fine forceps serrated	FST	11370-32
Fine forceps serrated	FST	11370-31
Cunningham Spinal Adaptor	Stoelting Co.
Kwik-Cast sealant	WPI	#KWIK-CAST
Ventilator	CWE Inc	SAR-830/AP
Capnograph	CWE Inc	μcapstar
Heating blanket	Harvard Apparatus	507221F
Intracellular amplifier	Axon Instruments	Axoclamp 2B
Pipette puller	Sutter Instruments	P-97
KCl	Sigma-Aldrich	P9333-500G