Summary
Beskrevet her er en
Abstract
Caenorhabdits elegans er blevet udbredt i studiet af stress modstand, som lettes ved gennemskueligheden af voksne og embryo faser samt af tilgængeligheden af genetiske mutanter og transgene stammer, der udtrykker et utal af fusionsproteiner 1-4. Desuden kan dynamiske processer såsom celledeling ses med fluorescensmærkede reportermolekyler proteiner. Studiet af mitose kan lettes ved brug af time-lapse eksperimenter i forskellige systemer, herunder intakte organismer, og dermed den tidlige C. elegans embryo er velegnet til denne undersøgelse. Præsenteres her er en teknik, som in vivo-afbildning af sub-cellulære strukturer som reaktion på anoxiske (99,999% N2, <2 ppm O2) stress er muligt ved hjælp af en simpel gasstrøm gennem opsætning på en kraftig mikroskop. En microincubation kammer anvendes sammen med nitrogengas strømme gennem og en roterende skive konfokalt mikroskopat skabe et kontrolleret miljø, hvor dyrene kan blive afbildet in vivo. Brug af GFP-mærkede gamma tubulin og histon, kan den dynamik og anholdelse af celledeling monitoreres før, under og efter udsættelse for en ilt-frataget miljø. Resultaterne af denne teknik har en høj opløsning, detaljerede videoer og billeder af cellulære strukturer i blastomeres af embryoner udsat for ilt afsavn.
Protocol
1. Prøvefremstilling
- Producere eller indhente passende transgene C. elegans stamme af interesse ved hjælp af transgene metoder eller fra Caenorhabditis Genetics Stock Center (CGC) eller kollega. I dette tilfælde bruger vi stamme TH32 (pie-1 :: TBG-1 :: GFP, pie-1 :: GFP :: H2B) 5 til visualisere kromosomer og centrosomes som markører for celledeling.
- Generer en synkroniseret befolkning ved hjælp af en af tre metoder: 1) smuldre drægtige voksne i hypochloritopløsning og bruge de resterende embryoner 6, 2) vælge drægtige voksne på en podet plade og lad dem lægge æg i 1-2 timer, eller 3) pick L4 larver fra en blandet population og flytte til en ny seedet plade.
- Dyrk nematoder ved 20 ° C til gravide unge voksenliv, som vil tage cirka 96 timer fra klækning, 72 timer fra L1 larver eller 24 timer efter L4 molt. Embryoer (2-20 celle) i utero indeholder store blastomeres og kerner, der er optimale for imagING sub-cellulære og sub-nukleare ændringer, hhv. Denne metode tilvejebringer et middel til at generere en population af unge voksne, der indeholder en rigelig antal tidlige embryoner.
2. Slide Forberedelse og Anoxia Chamber Set Up
- Gør et fugtigt kammer til at holde tilberedte objektglas ved at placere en fugtig papirserviet i en stor petriskål eller beholder dækket med et låg af tilstrækkelig størrelse.
- Fremstille smeltet 2% agarose i deioniseret H2O ved opvarmning af blandingen i glas via mikrobølge eller vandbad.
- Placer 1-3 dråber varmt agarose på et rent objektglas. Umiddelbart placere en anden slæde inverteret vinkelret på toppen af agarose dråbe (s) trykkes lidt, således at den resulterende puden bliver tynd og fri for luftbobler.
- Tillad tid til afkøling, og langsomt tage hinanden de to mikroskopobjektglas forlader agarose pad intakt på en af dias. Det er vigtigt at sikre, agarose pude er tynd nok til ikke interfere med evnen til at fokusere mikroskopet senere. Evne til at visualisere prøve er også afhængig af den specifikke optiske afstand af målet i brug, som kan variere mellem mikroskoper.
- Brug en ren barberblad til at forme agarose pad ind i en lille firkant. Opbevares i den forberedte fugtighedskammer indtil den er klar til brug.
- Omhyggeligt under anvendelse af samme rent barberblad, at kanten af agarose pad og overføre den fra slæden på en rund 25 mm mikro dækglas, undgå ophobning af luftbobler nedenunder puden. Den runde dækglas valgt at bruge passer korrekt i microincubator.
- En dråbe anæstetikum (0,5% tricaine, 0,05% tetramisol i M9-puffer) på agarose puden til anvendelse som et bedøvelsesmiddel. Pick 5-10 orme og anbringes i dråben af bedøvelsesmiddel. Tillad 1-3 min for orme at indstille bevægelsen.
- Begrundelsen for at observere embryoner kan voksne uterus, i stedet for dissekerede embryoner er at minimere risikoen for embryo desiccaning og bevægelse på grund af den strøm af nitrogengas tværs af embryoet.
- Øjeblikkeligt en dråbe halogencarbon olie på toppen af ormene for at forhindre orme af dehydrering som gassen strømmer gennem kammeret. Da halogencarbon olie er tyktflydende kan man bruge en pipettespids eller spidsen af en orm vælge at indsamle olie og falde ned på orme.
- Når først det cirkulære dækglas indeholdende ormene er klar, de to halvdele af Leiden lukkede perfusion microincubator adskilles, og dækglas er derefter forsigtigt anbragt opretstående på bundringen. De to sider af kammeret lukkes derefter tæt sammen.
- Kammeret forbindes derefter til nitrogengas-tanken via fleksibel plastslange og anbringes i passende sted på objektbordet (figur 1C). På dette tidspunkt røret og microincubator skal omhyggeligt kontrolleres for lækager ved at sikre sikker fastgørelse af slangen og for havnen propper langs den side af kammeret. Man kan alså let spredes en lille mængde sæbe vand over røret til at lede efter bobler, som vil danne, hvis en lækage er til stede.
3. Mikroskopi i Anoxia
- Find dyr på lavere forstørrelse, derefter gå til den relevante større forstørrelse (64x for denne ansøgning) til billede væv eller celler af interesse såsom embryonale blastomeres eller oocyter hos voksne. Tænd 488 nm laser for at se GFP signal og finde GFP-fusionsproteinet i cellen (erne) af interesse.
- For at visualisere anholdelsen på specifikt stadium i cellecyklusstop (f.eks sent prophase) identificere en blastomer på et tidligere stadie af celledeling (f.eks sent interfase eller tidlig prophase). Cellulære markører såsom centriole stilling, initiering af kromosom kondensation, kromosom placering og nærvær eller fravær af kernekappen medvirke til at konstatere cellecyklus fase (figur 2A).
- Kammeret er derefter perfunderet med nitrogengas (99,999%N2, <2 ppm O2). I dette tilfælde anvender vi et tryk på 6 psi, men tryk kan være nødvendigt at justere og optimeres afhængig af størrelse af hver microincubator og diameteren af røret er i brug. Fortsat overvåge blastomer (er) som nitrogen fylder kammeret, tilpasning af brændplanet efter behov.
- På dette tidspunkt har time-lapse imaging begyndt. Billeddannelse udføres så længe som nødvendigt for at fange fænomen af interesse, i dette tilfælde profase arrest og sammenkobling af kromosomer til den indre kernemembranen. Billederne tages én gang hver 10 sek længere end 30 min. Hyppigheden af image capture og indstillinger såsom gevinst og lasereffekt bør justeres efter behov.
- Den tid, hvor embryonerne reagerer på anoxisk miljø kan variere afhængigt af cellecyklus scene, anoxi eksponering. Typisk anoxia-induceret profase ophører inden for 20-30 min at begynde nitrogengasstrøm. Vi har observeret anoxia-induceret cellecyklusstandsning erhvervspsykolorring i <20 min. Billeder kan opnås i løbet af denne tidsramme, eller specifikke billeder kan isoleres senere fra en time-lapse-serie. En yderligere mulighed er at bruge video mikroskopi til at visualisere sub-cellulære strukturer i embryoner.
- At dokumentere genrejsning efter anoxia-induceret anholdt tilstand, er gassen slukket og kammeret får lov til at vende tilbage til normoxi ved diffusion mens du optager en time-lapse-serie. Genoptagelse af cellecyklusprogression og frikobling af kromosomer forekommer typisk inden for 5-20 minutter for at dreje nitrogengas off.
- Bemærk, at i separate forsøg en anoxi indikator, resazurin, blev placeret i gennemløbet mikrokammer, der viste, at kammeret bliver anoxisk i gennemsnit omtrent 19 min efter nitrogengasstrøm er startet.
- Billeder og videoer behandles ved hjælp Imaris, Image J eller Photoshop og importeret til QuickTime til visning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
C. elegans embryoner udsat for svær iltmangel (iltmangel) er i stand til at overleve ved at arrestere biologiske processer, herunder udvikling og celledeling 7. Den anoxia-induceret arrest af celledeling kan overvåges ved en subcellulære niveau, ved anvendelse af en microincubation kammer sammen med nitrogengas strømme gennem og en roterende skive konfokalt mikroskop for at skabe et kontrolleret miljø, hvor dyrene kan blive afbildet in vivo (fig. 1). Cellulære strukturer af interesse kan overvåges i embryoet udsat for forskellige gas miljøer, i dette tilfælde brugte vi GFP-mærket gamma tubulin og histon H2B at overvåge kromosomopbygning i et foster udsat for iltmangel.
Inden for embryon udsættes for anoxi, vil kromosomerne i profase blastomeres kondensere og flugte med den indre nukleare periferi, et fænomen kaldet "kromosom docking" (fig. 2, Movie 1).Ved re-oxygenering cellecyklusprogression genoptages og kromosomerne i profase blastomeres vil bevæge sig fra den nukleare periferi til den ækvatoriale plade indikerer progression til metafase (film 2). Denne teknik kan også anvendes til at visualisere arrest på andre stadier i celledeling eller bivalente kromosomer af oocytter i hermafroditter udsat for anoxi 8.
Fig. 1. Eksempel på mikroskop og kammerets setup anvendes til in vivo analyse. Zeiss inverteret konfokalt mikroskop med Leiden Lukket Perfusion Microincubator og knyttet nitrogengas beholder (A), objektbordet og microincubator (B), og forstørret billede af microincubator (C).
Figur 2. Hallmark af anoxia-induceret profase standset blastomer. Vist er repræsentative billeder af en prophase blastomer ved starten af time-lapse imaging (A) blastomer af et foster eksponeret for normoxi (B) eller en blastomer af et embryo efter 30 minutters anoksi eksponering (C). Den anoxia-induceret prophase anholdt blastomer viser kromosomer kuperet nær den indre nukleare periferi og NEBD er anholdt. Scale bar = 5 um.
Movie 1. Time-lapse analyse af en blastomer i overgangen fra normoxi for iltmangel. Bemærk kromosomer Sfæriske til den nukleare periferi. Billeder blev taget til fange 28 min efter gasstrømmen gennem begyndte. Klik her for at se film .
Movie 2. Time-lapse analyse af en blastomer komme fra iltmangel. Da ilt tilbage til miljøet cellecyklus genoptages. Billeder blev taget til fange 10 min efter gas strømmer gennem var clempet. Klik her for at se film .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ilt afsavn og suspenderet animation
Skønt udsættelse for svær iltmangel kan være dødelig for visse organismer, nogle organismer er i stand til at overleve eksponering for iltmangel. I tilfælde af C. elegans, overlevelse af anoxi eksponering afhænger udviklingsstadiet og respons på iltmangel er trådt ind i en reversibel tilstand af suspenderet animation i hvilken en række observerbare biologiske processer bliver arresteret. Celledeling, udvikling, bevægelse, spise og reproduktive processer ophøre indtil ilt genindføres i miljøet 7,9. Cellecyklusprogression, af anoxi-eksponerede fostre, reversibelt anholdelser på interfase, sent prophase eller metafase. Anvendelsen af cellebiologiske teknikker såsom immunfarvning i faste prøver og in vivo GFP-fusionsproteinet assays, hvilket giver billeddannelse af specifikke sub-cellulære strukturer i et ilt berøvet miljø, har været medvirkende til at identificere og karakteriserespecifikke kendetegn for anoxia-induceret suspenderet animation i C. elegans 8,10,11.
Både embryoer og oocyter vise markerede egenskaber anoxia-induceret suspenderet animation, som er let synlige ved hjælp af fluorescensmikroskopi i kombination med fluorescensmærkede proteiner eller antistoffer mod specifikke proteiner til at analysere faste embryoer. Interfase blastomeres, af embryoner udsat for iltmangel, er karakteriseret ved delvis kondensering af kromatin og anholdelse af cellecyklusprogression med nogle kromatin tilpasning på det nukleare periferien 9. Mens cellekernekappen nedbrydning (NEBD) angiver en endelig forpligtelse til mitose i iltmangel, er prophase anholdelse karakteriseret ved arrestationen af NEBD, og tilpasningen af fuldt kondenserede kromosomer på det nukleare periferi 10,12. Metafase arrest, på den anden side karakteriseret ved arrest i kromosomerne på metafase plade og delvis depolymerisering af mikrotubuli, bl.a.ting. Anoxia-induceret cellecyklusstop i alle faser er reversibel og efter reoxygenering, cellecyklusfremadskriden genoptages. I anoxia eksponeringer af 24 timer eller mindre, er kontrol-og forsøgsdyr skelnes ved inddrivelse 7. Ved anvendelse af fremgangsmåderne beskrevet her dyret kan overleve anoxi eksponering.
Imaging Analyse og overvejelser
Fremgangsmåden præsenteres her udnytter TH32 (unc-119 (ED3) ruIs32 III ddIs6) stamme af C. elegans. Denne stamme udtrykker to fluorescensmærkede proteiner, der fremmer visualisering af centrosomes og kromosomer. Centrosomes er markeret med ddIs6 [pie-1 :: TBG-1 :: GFP + unc-119 (+)], der koder for GFP-mærket gamma tubulin, og lokaliseres til centrosomes gennem hele cellecyklus. Positionen af centrosomes er indikativ for den fase af cellecyklen og er nyttige i timing anoksi eksperimenter. Kromosomer er markeret med ruIs32 [unc-119 (+) pie-1 :: GFP :: H2B], der koder for et GFP mærket histon-protein og drives af en kimlinje-promotor 5. Således kan bevægelsen og lokalisering af kromosomer i blastomerer eller oocyter følges. I et udviklende embryo, forud for anoxia-induceret cellecyklusstandsning, en blastomer, og dermed kernen kan bevæge sig ud af brændplanet gør det nødvendigt at justere brændplanet mens billeddannelse. Det er muligt at følge flere blastomer eller kernen, men manuel fokusering på den cellulære genstand af interesse kan være nødvendigt at gøres for at optimere visualisering af de multiple cellulære bestanddele af interesse. Dette kan begrænse muligheden for at automatisere processen, medmindre man bruger software til at spore en bestemt region og følge den. Vi har ikke forsøgt at automatisere processen.
For at optimere protokollen for ens specifik analyse kan man overveje forskellige aspekter af mikroskopi og genetisk baggrund af interesse 13 (NPP-16 (ok1839)) under anvendelse af den samme teknik (f.eks samme anoxi eksponeringstid) som kontroller og fandt, at fænotypen (i dette tilfælde unormale anholdelse af prophase blastomeres) kan optages inden for 30 min udsættelse for anoxia 10. Embryoer kan overleve i tre dage anoxi anvender andre metoder, vi har ikke identificeret mutationer, der resulterer i en modstand mod anoxi eksponering (overlevelse forlænges forbi 3 dage efter eksponering) i embryoet.
Til vores formål er vi imaging en meget dynamisk cellulær proces, og bruger et spinning disk konfokal mikroskop for hurtig billedoptagelse. Afhængigt af de særlige behov af et eksperiment, vil det være nødvendigt at fastslå, om en anden form for mikroskopi teknik kan være mere enppropriate.
Når der vælges eller udvikle en transgen stamme af denne fremgangsmåde, er det vigtigt at undersøge følsomheden af mikroskopet, der skal bruges, samt fotoblegning tendens særlige fluorofor. Anvendelsen af tidsforskydningen billeddannelse af denne metode kan føre til betydelig fotoblegning i stammer, som ikke kraftigt udtrykker et fluorescerende protein.
Der er flere tekniske udfordringer og begrænsninger, der skal overvejes, når de indsamler billeder in vivo ved hjælp af denne metode. På grund af størrelsen af kammeret, og den potentielt tidskrævende beskaffenhed af eksperimenterne kan det være vanskeligt at analysere et stort antal prøver i en kort tid. Eksperimenter kræver store stikprøvestørrelser kan ofte parret med andre metoder til anoxi eksponering til at generere store datasæt, og in vivo billeddannelse kan bruges til at dokumentere, kontrollere eller nærmere undersøge en fænotype af interesse. Additionally, hvis eksperimentet kræver undersøgelse på bestemte tidspunkter i løbet af en langsigtet eksponering, kan problemer med prøve udtørring opstå. Trods bliver dækket med halogencarbon olie, kan dyrene begynde at tørre ud på grund af kontinuerlig gasstrøm, og derfor at begrænse den eksperimentelle tid kunne afhjælpe dette problem. Desuden kan man overveje at anvende hydratiseret gas eller et kammer, der tillader fugtstyring at afhjælpe udtørring problemer.
En fordel ved denne teknik er, at hypoxi eksperimenter er også mulige. Således for yderligere ilt afsavn undersøgelser kan man blot bruge en gastank med en specificeret oxygenkoncentration (fx 1% O 2 balanceret med N 2) at undersøge reaktioner på hypoksi snarere end et fuldstændigt iltfattige miljø. Derudover blev en enkel og fleksibel modifikation er anvendelsen af andre gasser, herunder O 2 niveauer over 21%, H 2 S eller CO, men sikkerheden ved anvendelse af disse gassen blander er en major overvejelse og yderligere forholdsregler skal træffes 14.
Betydning af teknikken
Mens vi har skitseret denne metode til at afsløre C. elegans til anoxia og visualisere kendetegnende for anoxia-induceret skindød inden for et foster med meget specifikke sub-cellulære markører, disse repræsentative resultater er blot et enkelt assay i en lang række forskellige eksperimentelle muligheder med kammeret systemet er beskrevet her. Iltmangel har vist sig at påvirke en række cellulære processer i mange forskellige organismer, og ved at udnytte denne teknik kan specifikke effekter af anoksi, hypoksi, samt en række andre miljøer kan visualiseres og fanget in vivo. For eksempel ved anvendelse C. elegans dette system kan anvendes til analyse af andre fænotyper fremkaldt af iltmangel, som tillades ved anvendelsen af tricaine / tetramizole bedøvelsesmiddel (dvs. pharyngeal pumpning og reproductive processer).
Anvendelsen af denne metode er ikke begrænset til C. elegans. Denne gasstrøm gennem kammeret setup tilvejebringer en enkel fremgangsmåde til eksponering af celler og hele organismer for lave koncentrationer af oxygen, samtidig med at indfange cellulære ændringer og visualisere aktivitet af fluorescerende proteinfusioner. For eksempel er denne fremgangsmåde let tilpasses til gær, cellekultur eller mindre invertebrat eller vertebrate embryoer, hvis størrelser ikke er for store til kammeret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Vi vil gerne udtrykke vores påskønnelse for input og kommentarer fra medlemmer af Padilla Lab. Nematode stammer i dette arbejde blev leveret af Caenorhabditis Genetics Center, som er finansieret af NIH National Center for Forskning Ressourcer (NCRR). Vi anerkender og takker Dr. Lon Turnbull om teknisk bistand med konfokal mikroskopi. Dette arbejde er blevet støttet af en bevilling fra National Science Foundation (NSF-IOS, karriere) til PAP
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents/Equipment | Composition | ||
| Hypochlorite solution | 0.7 g KOH, 12 ml 5% NaOCl, bring to 50 ml with ddH20 | ||
| M9 buffer | 3 g KH2PO4, 11 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml (1 M) MgSO4 per 1 L ddH2O | ||
| Glass microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-343 | 3"x1"x1.0 mm |
| Round micro coverglass | Electron Microscopy Sciences | 72223-01 | 25 mm Diameter |
| Halocarbon oil 700 | Sigma | H8898-100ml | |
| Anesthetic | 0.5% tricaine, 0.05% tetramisole | ||
| Leiden Closed Perfusion Microincubator | Harvard Apparatus | 650041 | |
| UHP Nitrogen | Calgaz (Air Liquide) | >99.9990% N2 <2 ppm O2 | |
| Plastic tubing | VWR | 89068-468 | 0.062" ID x 0.125" OD |
| Spinning Disk Confocal Microscope | McBain Systems | Zeiss inverted optical microscope, epifluorescence illumination system, CSU-10 Yokogawa confocal scanner, Hamamatsu electron multiplier CCD camera. |
References
- Powell-Coffman, J. A. Hypoxia signaling and resistance in C. elegans. Trends Endocrinol. Metab. 21 (10), 435-440 (2010).
- Padilla, P. A., Ladage, M. L. Suspended animation, diapause and quiescence: Arresting the cell cycle in C. elegans. Cell Cycle. 11, (2012).
- Hu, P. J. Dauer. WormBook. , 1-19 (2007).
- Zhou, K. I., Pincus, Z., Slack, F. J. Longevity and stress in Caenorhabditis elegans. Aging (Albany NY). 3, 733-753 (2011).
- Schmidt, D. J., Rose, D. J., Saxton, W. M., Strome, S. Functional analysis of cytoplasmic dynein heavy chain in Caenorhabditis elegans with fast-acting temperature-sensitive mutations. Mol. Biol. Cell. 16, 1200-1212 (2005).
- Sulston, J., Hodgkin, J. The Nematode Caenorhabditis elegans. Wood, W. B. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 587-606 (1988).
- Padilla, P. A., Nystul, T. G., Zager, R. A., Johnson, A. C., Roth, M. B. Dephosphorylation of Cell Cycle-regulated Proteins Correlates with Anoxia-induced Suspended Animation in Caenorhabditis elegans. Mol. Biol Cell. 13, 1473-1483 (2002).
- Hajeri, V. A., Trejo, J., Padilla, P. A. Characterization of sub-nuclear changes in Caenorhabditis elegans embryos exposed to brief, intermediate and long-term anoxia to analyze anoxia-induced cell cycle arrest. BMC Cell Biol. 6, 1471-2121 (2005).
- Padilla, P. A., Goy, J. M., Hajeri, Anoxia. Padilla, P. A. , InTech. (2012).
- Hajeri, V. A., Little, B. A., Ladage, M. L., Padilla, P. A. NPP-16/Nup50 function and CDK-1 inactivation are associated with anoxia-induced prophase arrest in Caenorhabditis elegans. Mol. Biol. Cell. 21, 712-724 (2010).
- Nystul, T. G., Goldmark, J. P., Padilla, P. A., Roth, M. B. Suspended animation in C. elegans requires the spindle checkpoint. Science. 302, 1038-1041 (2003).
- Margalit, A., Vlcek, S., Gruenbaum, Y., Foisner, R. Breaking and making of the nuclear envelope. J. Cell Biochem. 95, 454-465 (2005).
- Maddox, A. S., Maddox, P. S. High-resolution imaging of cellular processes in Caenorhabditis elegans. Methods Cell Biol. 107, 1-34 (2012).
- Miller, D. L., Roth, M. B. C. elegans are protected from lethal hypoxia by an embryonic diapause. Curr. Biol. 19, 1233-1237 (2009).
