Summary
Beskrivs här är ett
Abstract
Caenorhabdits elegans har använts i stor utsträckning i studier av stresstålighet, vilket underlättas av öppenheten i den vuxna och embryo stadier samt av tillgången av genetiska mutanter och transgena stammar som uttrycker en myriad av fusionsproteiner 1-4. Dessutom kan dynamiska processer såsom celldelning visas med fluorescensmärkta reporter proteiner. Studien av mitos kan underlättas genom användning av time-lapse experiment i olika system inklusive intakta organismer, alltså den tidiga C. elegans embryo väl lämpad för denna studie. Presenteras här är en teknik med vilken in vivo avbildning av sub-cellulära strukturer som svar på anoxiska (99,999% N 2, <2 ppm O 2) stress är möjligt med en enkel gasflöde genom installationen på en kraftfull mikroskop. En microincubation kammare används i kombination med kvävgas flöde genom och en roterande skiva konfokalmikroskopatt skapa en kontrollerad miljö där djur kan avbildas in vivo. Använda GFP-märkta gamma tubulin och histon, kan den dynamik och gripandet av celldelning övervakas före, under och efter exponering för en syre-berövade miljö. Resultaten av denna teknik är högupplösta, detaljerade videor och bilder av cellulära strukturer inom blastomerer av embryon utsätts för syrebrist.
Protocol
1. Provberedning
- Producera eller få lämplig transgen C. elegans stam av intresse med transgena metoder eller från Caenorhabditis Genetics Stock Center (CGC) eller kollega. I det här fallet använder vi stam TH32 (paj-1 :: TBG-1 :: GFP, paj-1 :: GFP :: H2B) 5 för att visualisera kromosomer och centrosomes som markörer för celldelning.
- Skapa en synkroniserad population genom att använda någon av tre metoder: 1) upplösas gravida vuxna hypokloritlösning och använder resterande embryon 6, 2) plocka gravida vuxna på en seedade tallrik och låt dem lägga embryon för 1-2 timmar, eller 3) ta L4 larver från en blandad befolkning och flytta till en ny seedade platta.
- Odla nematoder vid 20 ° C till gravid ung vuxen ålder, vilket kommer att ta cirka 96 timmar från kläckning, 72 timmar från L1 larver eller 24 timmar efter L4 Molt. Embryon (2-20 celler) i livmodern innehåller stora blastomerer och kärnor som är optimala för imagning sub-cellulära och sub-nukleära förändringar, respektive. Denna metod tillhandahåller ett sätt att generera en population av unga vuxna som innehåller ett rikligt antal tidiga embryon.
2. Preparatet och anoxi avdelningen Konfigurera
- Gör en fuktig kammare för att hålla förberedda bilder genom att placera en fuktig pappershandduk inuti en stor petriskål eller bin täckt med ett lock av tillräcklig storlek.
- Bered smält 2% agaros i avjoniserat H 2 O genom upphettning i blandning glasföremål genom mikrovågsugn eller vattenbad.
- Placera 1-3 droppar varm agaros på ett rent objektglas. Placera omedelbart en andra bild inverterat vinkelrätt ovanpå agaros droppe (ar), tryck lätt så att den resulterande dynan är tunn och fri från luftbubblor.
- Tillåt tid svalna och sakta ta isär de två objektglas lämnar agaros pad intakt på en av bilderna. Det är viktigt att se till agaros dynan är tunn nog att inte interfere med förmågan att fokusera mikroskopet senare. Förmåga att visualisera provet är också beroende på den specifika optiska avståndet från målet vid användning, vilket kan variera mellan mikroskop.
- Använd en ren rakblad att forma agaros pad till ett litet torg. Förvara i den förberedda fuktig kammare tills den ska användas.
- Försiktigt, med samma rena rakblad, ta udden av agaros pad och överföra den från bilden på en rund 25 mm micro täckglas, undvika ansamling av luftbubblor nedanför kudden. Den runda täckglas valt att använda passar in i microincubator.
- Lägg en droppe bedövningsmedel (0,5% tricaine, 0,05% tetramisol i M9 buffert) på agaros pad för användning som ett bedövningsmedel. Plocka 5-10 maskar och placera in droppe bedövningsmedel. Låt 1-3 min för maskar att upphöra rörelse.
- Motivet för att observera embryon inom vuxen livmodern, i stället för dissekerade embryon, är att minimera risken för embryot desiccaning och förflyttning på grund av flödet av kvävgas över embryot.
- Omedelbart lägga en droppe halogenkolväte olja ovanpå maskarna att förhindra maskar från uttorkning som gas strömmar genom kammaren. Eftersom halogenkolvätet oljan är trögflytande kan man använda en pipett spets eller spetsen på en mask plocka samla olja och falla på maskar.
- När den cirkulära täckglas innehållande maskarna är klar, stängt de två halvorna av Leiden perfusionen microincubator separeras, och täckglas är sedan försiktigt placeras upprätt på den nedre ringen. De två sidorna av kammaren stängs sedan tätt ihop.
- Kammaren är sedan ansluten till kvävgas tanken via böjlig plastslang och placeras i en lämplig plats på mikroskopets objektbord (figur 1C). Vid denna tid slangen och microincubator bör kontrolleras noggrant för eventuella läckor genom att säker fastsättning av slangen och hamnen pluggar längs sidan av kammaren. Man kan alså lätt sprida en liten mängd tvål vatten över slangen att leta efter bubblor, som kommer att bilda om en läcka finns närvarande.
3. Mikroskopi i Anoxia
- Leta djur på lägre förstoring, då flyttar till lämplig högre förstoring (64x för denna applikation) för att bilden vävnad eller celler av intresse, såsom embryonala blastomerer eller oocyter hos vuxna. Slå på 488 nm laser för att visa GFP-signal och lokalisera protein GFP fusion i cellen (er) av intresse.
- För att visualisera gripandet vid specifika stadium av cellcykelstopp (t.ex. sena profas) identifiera en blastomer i ett tidigare skede av celldelning (t.ex. sena interfas eller tidigt profas). Cellulära markörer såsom centriole ställning, initiering av kromosom kondens, kromosom lokalisering och närvaro eller frånvaro av kärnhöljet hjälper dig att identifiera steg cellcykeln (figur 2A).
- Kammaren sedan perfunderas med kvävgas (99,999%N 2; <2 ppm O 2). I detta fall använder vi ett tryck av 6 psi, men trycket kan behöva justeras och optimeras beroende på storleken av varje microincubator och diameter av rör som används. Fortsätta att övervaka blastomer (er) som kvävet fyller kammaren, justera fokalplanet behov.
- Vid denna punkt har tidsförlopp avbildning börjat. Imaging sker så länge som behövs för att fånga fenomenet av intresse, i detta fall profas arrestering och dockning av kromosomer till det inre nukleära membranet. Bilderna tas en gång var 10 sek längre än 30 minuter. Frekvenser av fotografering och inställningar som förstärkning och lasereffekt bör justeras vid behov.
- Den tid under vilken embryona svarar på den anoxiska miljön kan variera beroende på cellcykelns scenen vid anoxi exponering. Vanligtvis syrebrist-inducerad profas gripande sker inom 20-30 minuter att börja flöde kvävgas. Vi har observerat syrebrist-inducerad cell yrkes cykel gripanderring i <20 min. Bilder kan erhållas under denna tid, eller specifika bilder kan isoleras senare från en time-lapse-serien. En ytterligare möjlighet är att använda video mikroskopi för att visualisera sub-cellulära strukturer i embryon.
- Att dokumentera återhämtning från arresterade syrebrist-inducerad tillstånd gasen avstängd och kammaren får återvända till normoxi genom diffusion under inspelning av en time-lapse-serien. Återupptagande av cellcykelprogression och avdockning av kromosomer inträffar vanligen inom 5-20 minuter att vända kvävgas av.
- Notera att i separata experiment en anoxi indikator, resazurin, placerades i genomflödet mikrokammaren, bestämdes det att kammaren blir anoxiska i genomsnitt ca 19 min efter kvävgasflöde har startat.
- Bilder och videoklipp bearbetas med Imaris, Bild J eller Photoshop och importeras till QuickTime för visning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
C. elegans embryon utsätts för svår syrebrist (anoxi) kan överleva genom att arrestera biologiska processer, inklusive utveckling och celldelning 7. Den syrebrist-inducerad gripandet av celldelning kan övervakas på en sub-cellulär nivå, med hjälp av en microincubation kammare i samband med kvävgas strömma igenom och en snurrande skiva konfokalmikroskop för att skapa en kontrollerad miljö där djur kan avbildas in vivo (Figur 1). Cellulära strukturer av intresse kan övervakas i embryot utsätts för olika gas miljöer, i detta fall använde vi GFP-märkta gamma tubulin och histon H2B att övervaka kromosom struktur i ett embryo utsätts för syrebrist.
Inom embryot utsätts för syrebrist, kommer kromosomer profas blastomerer kondensera och anpassa den inre nukleära periferin, ett fenomen kallat "kromosom dockning" (Figur 2, film 1).Vid förnyad syresättning cellcykelprogression återupptas och kromosomer profas blastomerer kommer att flytta från den nukleära periferin till ekvatorn plattan indikerar progression till metafas (film 2). Denna teknik kan också använts för att visualisera gripande på andra stadier av celldelning eller bivalenta kromosomer oocyter i hermafroditer utsatta för syrebrist 8.
Figur 1. Exempel på mikroskop och kammaren inställning används för in vivo analys. Zeiss inverterade konfokalt mikroskop med Leiden Stängt Perfusion Microincubator och bifogade kvävgas tank (A), mikroskop skede och microincubator (B) och förstorad vy av microincubator (C).
Figur 2. HAllmark av anoxi-inducerad profas greps blastomer. Visas är representativa bilder av en profas blastomer i början av time-lapse avbildning (A) blastomer av ett embryo utsätts för normoxi (B) eller en blastomer av ett embryo efter 30 min av anoxi exponeringen (C). Den syrebrist-inducerad profas greps blastomer visar kromosomer dockad nära den inre nukleära periferin och NEBD arresteras. Skala bar = 5 nm.
Film 1. Time-lapse analys av blastomer i övergången från normoxi till syrebrist. Observera kromosomer inriktande på den nukleära periferin. Bilder fångades 28 min efter gasflöde genom började. Klicka här för att se filmen .
Film 2. Time-lapse analys av ett blastomer återhämta sig från syrebrist. Som syre återgår till cykeln miljön cell återupptas. Bilder fångades 10 min efter gasflöde genom var clättat. Klicka här för att se filmen .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Syrebrist och skendöd
Även exponering för svår syrebrist kan vara dödlig för vissa organismer, vissa organismer kan överleva exponering för anoxi. I fallet av C. elegans, beroende överlevnad anoxi exponering på utvecklingsstadiet och svar på syrebrist är inträde i en reversibel tillstånd av skendöd i vilken ett antal observerbara biologiska processer arresteras. Celldelning, utveckling, rörelse, kost och reproduktiva processer upphöra tills syre återinförs i miljön 7,9. Cellcykelprogression av anoxi-exponerade embryon, reversibelt arresteringar på interfas, sen profas eller metafas. Användningen av cellbiologiska tekniker såsom immunfärgning i fasta prover och in vivo GFP fusionsprotein analyser, vilket möjliggör avbildning av specifika sub-cellulära strukturer i berövas syre miljö, har varit avgörande för att identifiera och karakteriseraspecifika kännetecken för syrebrist-inducerad skendöd i C. elegans 8,10,11.
Både embryon och oocyter uppvisar märkta egenskaper syrebrist-inducerad skendöd som lätt synliga med fluorescerande mikroskopi i kombination med fluorescensmärkta proteiner eller antikroppar mot specifika proteiner för att analysera fasta embryon. Interfasen blastomerer, av embryon utsatta för syrebrist, kännetecknas av partiell kondensation av kromatin och gripandet av cellcykelprogression med några kromatin anpassa till den nukleära periferin 9. Medan kärnhöljet uppdelning (NEBD) innebär en slutlig engagemang för mitos i anoxi är profas gripande kännetecknas av gripandet av NEBD, och anpassning av helt kondenserade kromosomer vid den nukleära periferin 10,12. Metafas gripande, å andra sidan, kännetecknas av gripandet av kromosomerna vid metafas plattan och partiell depolymerisation av mikrotubuli, bland annatsaker. Anoxi-inducerad cellcykelstopp i alla skeden är reversibel och efter ny syresättning, cell-cykel progression återupptas. I anoxi exponeringar 24 timmar eller mindre, kontroll och experimentella djur är oskiljbara vid återhämtning 7. Med användning av metoderna som beskrivs här djuret kan överleva anoxi exponering.
Bildanalys och Överväganden
Den metod som presenteras här använder TH32 (UNC-119 (ED3) ruIs32 III, ddIs6) stam av C. elegans. Denna stam uttrycker två fluorescensmärkta proteiner som underlättar visualisering av centrosomes och kromosomer. Centrosomes markeras med ddIs6 [paj-1 :: TBG-1 :: GFP + unc-119 (+)], som kodar GFP-märkt gamma-tubulin, och lokaliseras till centrosomes hela cellcykeln. Placeringen av centrosomes indikerar skede av cellcykeln och är till hjälp för timing anoxi experiment. Kromosomer är markerade med ruIs32 [unc-119 (+) paj-1 :: GFP :: H2B], som kodar en GFP märkt histon protein och drivs av en bakterie-linje specifik promotor 5. Således kan rörelse och lokalisering av kromosomer i blastomerer eller oocyter följas. Inom ett växande embryo, före anoxi-inducerad cellcykelstopp, en blastomer och därmed kärnan, kan flytta ut från fokalplanet gör det nödvändigt att justera fokalplanet medan avbildning. Det är möjligt att följa mer än en blastomer eller kärna, men manuell fokus på den cellulära föremål för intresse kan behöva göras för att optimera visning av de många cellulära komponenter av intresse. Detta kan begränsa möjligheten att automatisera processen om man använder programvara för att spåra en viss region och följa den. Vi har inte försökt att automatisera processen.
För att optimera protokollet för en specifika analys kan man överväga olika aspekter av mikroskopi och genetiska bakgrund av intresse 13 (NPP-16 (ok1839)) med samma teknik (t.ex. samma anoxi exponeringstid) som kontroller och fann att fenotypen (i detta fall onormal gripandet av profas blastomerer) kan fångas inom 30 min av exponering för anoxi 10. Embryon kan överleva under tre dagar av syrebrist med andra metoder, vi har inte identifierat mutationer som leder till ett motstånd mot anoxi exponering (överlevnad förlängs förbi 3 dagars exponering) i embryot.
För våra syften, vi avbildning en mycket dynamisk cellulär process och använder en snurrande skiva konfokalmikroskop för snabb bildtagning. Beroende på de särskilda behov av ett experiment, måste det fastställas om en annan typ av mikroskopi teknik kan vara mer enppropriate.
Vid val eller utveckling av en transgen stam för denna metod, är det viktigt att beakta känsligheten hos mikroskopet som ska användas liksom fotoblekning tendens särskilda fluoroforen. Användningen av tiden förfaller avbildning i denna metod kan leda till betydande fotoblekning i stammar som inte starkt uttrycker ett fluorescerande protein.
Det finns flera tekniska utmaningar och begränsningar som ska beaktas vid insamling bilder in vivo med denna metod. På grund av storleken av kammaren, och den potentiellt tidskrävande karaktären av experimenten, kan det vara svårt att analysera ett stort antal prov i en kort tid. Experiment som kräver stora provstorlekar kan ofta kopplas ihop med andra metoder för syrebrist exponering att generera stora datamängder, och in vivo avbildning kan användas för att dokumentera, kontrollera eller närmare undersöka en fenotyp av intresse. Additionally Om försöket kräver granskning vid specifika tidpunkter under en långvarig exponering kan problem med prov uttorkning uppstå. Trots att täckas med halogenkolväte olja får djuren börja uttorka grund kontinuerligt gasflöde, därför begränsa den experimentella tiden kunde lindra problemet. Dessutom kan man överväga att använda hydratiserad gas eller en kammare som tillåter fuktreglering att lindra torkningsbehandlingar frågor.
En fördel med denna teknik är att hypoxi experiment är också möjliga. Således, för ytterligare studier syrebrist kan helt enkelt använda en bensintank med en viss syrekoncentration (t.ex. 1% O 2 balanseras med N 2) att undersöka svar på hypoxi snarare än en helt syrefria miljö. Dessutom är en annan enkel och flexibel modifiering användningen av andra gaser, inklusive O 2 nivåer över 21%, H 2 S eller CO, men det är säkerheten för att använda dessa gasblandningar en major övervägande och ytterligare försiktighetsåtgärder skall vidtas 14.
Betydelse av Teknik
Medan vi har skisserat här metoden att exponera C. elegans till anoxi och visualisera kännetecken anoxi-inducerat skendöd inom ett embryo med mycket specifika subcellulära markörer, dessa representativa resultat är bara en enda analys på ett stort antal experimentella möjligheter använder kammarsystemet vi beskriver här. Syrebrist har visats påverka ett antal cellulära processer i ett brett spektrum av organismer, och genom att utnyttja denna teknik, kan specifika effekterna av anoxi, hypoxi, och en mängd andra miljöer visualiseras och fångas in vivo. Till exempel, med användning av C. Elegans detta system skulle kunna användas för att analysera andra fenotyper orsakade av syrebrist, som tillåts med användning av tricaine / tetramizole bedövningsmedel (dvs svalg pumpning och reproductive processer).
Tillämpningen av denna metod är inte begränsad till C. elegans. Denna gasflöde genom kammaren installationen tillhandahåller en enkel metod för att exponera celler och hela organismer för låga koncentrationer av syre samtidigt fånga cellförändringar och visualisera aktivitet av fluorescerande proteinfusioner. Till exempel, är denna metod lätt anpassas till jäst, cellodling eller små ryggradsdjur och ryggradslösa embryon vars storlekar inte är för stort för kammaren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi vill framföra vår uppskattning för de synpunkter och kommentarer från medlemmar i Padilla Lab. Nematoder stammar i detta arbete lämnades av Caenorhabditis Genetics Center, som finansieras av NIH National Center for Research Resources (NCRR). Vi erkänner och tackar Dr Lon Turnbull för tekniskt bistånd med konfokalmikroskopi. Detta arbete har fått stöd av ett stipendium från National Science Foundation (NSF-IOS, karriär) till PAP
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents/Equipment | Composition | ||
| Hypochlorite solution | 0.7 g KOH, 12 ml 5% NaOCl, bring to 50 ml with ddH20 | ||
| M9 buffer | 3 g KH2PO4, 11 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml (1 M) MgSO4 per 1 L ddH2O | ||
| Glass microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-343 | 3"x1"x1.0 mm |
| Round micro coverglass | Electron Microscopy Sciences | 72223-01 | 25 mm Diameter |
| Halocarbon oil 700 | Sigma | H8898-100ml | |
| Anesthetic | 0.5% tricaine, 0.05% tetramisole | ||
| Leiden Closed Perfusion Microincubator | Harvard Apparatus | 650041 | |
| UHP Nitrogen | Calgaz (Air Liquide) | >99.9990% N2 <2 ppm O2 | |
| Plastic tubing | VWR | 89068-468 | 0.062" ID x 0.125" OD |
| Spinning Disk Confocal Microscope | McBain Systems | Zeiss inverted optical microscope, epifluorescence illumination system, CSU-10 Yokogawa confocal scanner, Hamamatsu electron multiplier CCD camera. |
References
- Powell-Coffman, J. A. Hypoxia signaling and resistance in C. elegans. Trends Endocrinol. Metab. 21 (10), 435-440 (2010).
- Padilla, P. A., Ladage, M. L. Suspended animation, diapause and quiescence: Arresting the cell cycle in C. elegans. Cell Cycle. 11, (2012).
- Hu, P. J. Dauer. WormBook. , 1-19 (2007).
- Zhou, K. I., Pincus, Z., Slack, F. J. Longevity and stress in Caenorhabditis elegans. Aging (Albany NY). 3, 733-753 (2011).
- Schmidt, D. J., Rose, D. J., Saxton, W. M., Strome, S. Functional analysis of cytoplasmic dynein heavy chain in Caenorhabditis elegans with fast-acting temperature-sensitive mutations. Mol. Biol. Cell. 16, 1200-1212 (2005).
- Sulston, J., Hodgkin, J. The Nematode Caenorhabditis elegans. Wood, W. B. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 587-606 (1988).
- Padilla, P. A., Nystul, T. G., Zager, R. A., Johnson, A. C., Roth, M. B. Dephosphorylation of Cell Cycle-regulated Proteins Correlates with Anoxia-induced Suspended Animation in Caenorhabditis elegans. Mol. Biol Cell. 13, 1473-1483 (2002).
- Hajeri, V. A., Trejo, J., Padilla, P. A. Characterization of sub-nuclear changes in Caenorhabditis elegans embryos exposed to brief, intermediate and long-term anoxia to analyze anoxia-induced cell cycle arrest. BMC Cell Biol. 6, 1471-2121 (2005).
- Padilla, P. A., Goy, J. M., Hajeri, Anoxia. Padilla, P. A. , InTech. (2012).
- Hajeri, V. A., Little, B. A., Ladage, M. L., Padilla, P. A. NPP-16/Nup50 function and CDK-1 inactivation are associated with anoxia-induced prophase arrest in Caenorhabditis elegans. Mol. Biol. Cell. 21, 712-724 (2010).
- Nystul, T. G., Goldmark, J. P., Padilla, P. A., Roth, M. B. Suspended animation in C. elegans requires the spindle checkpoint. Science. 302, 1038-1041 (2003).
- Margalit, A., Vlcek, S., Gruenbaum, Y., Foisner, R. Breaking and making of the nuclear envelope. J. Cell Biochem. 95, 454-465 (2005).
- Maddox, A. S., Maddox, P. S. High-resolution imaging of cellular processes in Caenorhabditis elegans. Methods Cell Biol. 107, 1-34 (2012).
- Miller, D. L., Roth, M. B. C. elegans are protected from lethal hypoxia by an embryonic diapause. Curr. Biol. 19, 1233-1237 (2009).
