Summary
Décrit ici est un
Abstract
Elegans Caenorhabdits a été largement utilisé dans l'étude de la résistance au stress, ce qui est facilité par la transparence des stades adultes et d'embryons ainsi que par la disponibilité de mutants génétiques et des souches transgéniques exprimant une myriade de 1-4 des protéines de fusion. En outre, les processus dynamiques comme la division cellulaire peut être consulté en utilisant des protéines marquées par fluorescence reporter. L'étude de la mitose peut être facilitée par l'utilisation de time-lapse expériences dans divers systèmes, y compris les organismes intacts; ainsi le début C. embryon elegans est bien adapté pour cette étude. Présentée ici est une technique par laquelle l'imagerie in vivo de structures subcellulaires en réponse à anoxique (99,999% de N 2; <2 ppm 2 O) le stress est possible en utilisant un flux de gaz simple grâce à l'installation sur un microscope très puissant. Une chambre microincubation est utilisé en conjonction avec un débit d'azote gazeux à travers et un microscope confocal à disque rotatifà créer un environnement contrôlé dans lequel les animaux peuvent être imagé in vivo. Utilisant la GFP-tubuline marqués gamma et des histones, la dynamique et arrêt de la division cellulaire peut être surveillé avant, pendant et après l'exposition à un environnement privé d'oxygène. Les résultats de cette technique sont en haute résolution, des vidéos et des images détaillées des structures cellulaires au sein de blastomères d'embryons exposés à la privation d'oxygène.
Protocol
1. Préparation des échantillons
- Produire ou obtenir approprié transgénique C. elegans souche d'intérêt en utilisant des méthodes transgéniques ou de Caenorhabditis Genetics Stock Center (CGC) ou d'un collègue. Dans ce cas, nous utilisons souche TH32 (pie-1 :: tbg-1 :: GFP, tarte-1 :: GFP :: H2B) 5 à visualiser les chromosomes et les centrosomes comme marqueurs de la division cellulaire.
- Générer une population synchronisée en utilisant l'une des trois méthodes suivantes: 1) se désintègrent adultes gravides dans une solution d'hypochlorite et d'utiliser des embryons restants 6, 2) choisir adultes gravides ensemencées sur une plaque et laissez-les poser embryons pendant 1-2 heures, ou 3) prendre L4 larves d'une population mixte et de passer à une nouvelle plaque ensemencée.
- Cultivez les nématodes à 20 ° C à l'âge adulte gravide, ce qui prendra environ 96 heures à partir de l'éclosion, les larves de 72 heures à partir de L1 ou L4 24 h après la mue. Embryons (2-20 cellules) in utero contiennent de grandes blastomères et des noyaux qui sont optimales pour imagtion des changements sub-cellulaires et sub-nucléaire, respectivement. Cette méthodologie fournit un moyen pour générer une population de jeunes adultes qui contiennent un nombre abondant d'embryons précoces.
2. Préparation Faites glisser et anoxie Chambre Set Up
- Faites une chambre humide à tenir lames préparées en plaçant une serviette en papier humide à l'intérieur d'un grand plat de Pétri ou dans le bac recouvert d'un couvercle de taille suffisante.
- Préparer fondu 2% d'agarose dans désionisée H 2 O par chauffage dans de la verrerie mélange par micro-ondes ou bain d'eau.
- Placer 1-3 gouttes d'eau tiède agarose sur une lame de microscope en verre propre. Placer immédiatement une deuxième lame inversée verticalement au-dessus de la chute d'agarose (s), appuyez légèrement de sorte que le coussin résultant sera mince et sans bulles d'air.
- Laisser le temps de refroidir lentement et démonter les deux lames de microscope en laissant intact le tampon d'agarose sur une des diapositives. Il est important d'assurer le pad agarose est assez mince pour ne pas perturre avec la capacité de se concentrer au microscope après. Possibilité de visualiser l'échantillon dépend aussi de la distance optique spécifique de l'objectif utilisé, qui peut varier entre microscopes.
- Utilisez une lame de rasoir propre pour façonner tampon d'agarose dans un petit carré. Conserver dans la chambre humide préparée jusqu'au moment de servir.
- Soigneusement, en utilisant la même lame de rasoir propre, prendre le bord du pad agarose et le transférer de la faire glisser sur un rond de 25 mm lamelle micro, en évitant l'accumulation de bulles d'air sous le clavier. La lamelle ronde choisi d'utiliser s'insère correctement dans le microincubator.
- On ajoute une goutte d'anesthésique (0,5% tricaïne, tétramisole 0,05% en tampon M9) sur le bloc d'agarose destiné à être utilisé comme anesthésique. Choisissez les vers 5-10 et lieu dans la goutte d'anesthésique. Laisser 1-3 min pour les vers à cesser le mouvement.
- La justification de l'observation des embryons dans l'utérus adulte, au lieu d'embryons disséqués, est de minimiser le potentiel de l'embryon desiccation et le mouvement dû à l'écoulement du gaz d'azote dans l'embryon.
- Immédiatement ajouter une goutte d'huile halocarbone au-dessus des vers de terre pour empêcher les vers de déshydratation de gaz s'écoule à travers la chambre. Comme l'huile est visqueuse halocarbures, on peut utiliser un embout de pipette ou de la pointe d'un ver prendre pour recueillir l'huile et déposer sur les vers de terre.
- Une fois la lamelle circulaire contenant les vers est prêt, les deux moitiés de la fermeture Leiden perfusion microincubator sont séparées, et la lamelle est ensuite soigneusement placé à la verticale sur l'anneau inférieur. Les deux côtés de la chambre sont ensuite fermées hermétiquement ensemble.
- La chambre est ensuite reliée au réservoir d'azote gazeux par l'intermédiaire de tubes en matière plastique souple et placé à l'endroit approprié sur la platine du microscope (figure 1C). À ce moment le tube et microincubator doit être soigneusement contrôlée pour les fuites en assurant une fixation sûre de la tuyauterie et des bouchons d'orifice le long du côté de la chambre. On peut ALsi légèrement étaler une petite quantité d'eau savonneuse sur le tube de chercher des bulles, qui formeront si une fuite est présente.
3. Microscopie en anoxie
- Localiser les animaux à faible grossissement, puis déplacez le grossissement supérieur approprié (64x pour cette application) pour les tissus d'image ou cellules d'intérêt tels que blastomères embryonnaires ou des ovocytes chez les adultes. Activer le laser 488 nm pour afficher signal de la GFP et de localiser la protéine de fusion GFP dans la cellule (s) d'intérêt.
- Pour visualiser l'arrestation au stade précis de l'arrêt du cycle cellulaire (par exemple prophase tardive) d'identifier un blastomère à un stade antérieur de la division cellulaire (par exemple interphase prophase tardive ou précoce). Marqueurs cellulaires tels que la position centriole, l'initiation de la condensation des chromosomes, la localisation chromosomique et la présence ou l'absence de l'enveloppe nucléaire aidera à identifier les étapes du cycle cellulaire (figure 2A).
- La chambre est ensuite perfusé avec de l'azote gazeux (99,999%N 2; <2 ppm O 2). Dans ce cas, nous utilisons une pression de 6 psi, mais la pression peut avoir besoin d'être ajustée et optimisée en fonction de la taille de chaque microincubator et le diamètre du tuyau en cours d'utilisation. Continuer à surveiller le blastomère (s) que l'azote remplit la chambre, le réglage du plan focal selon les besoins.
- À ce stade, imagerie time-lapse a commencé. L'imagerie est réalisée aussi longtemps que nécessaire pour capturer phénomène d'intérêt, dans ce cas prophase arrestation et l'amarrage des chromosomes à la membrane nucléaire interne. Les images sont prises une fois toutes les 10 sec pour une durée de 30 min. Les fréquences de capture d'image et des paramètres tels que le gain et la puissance du laser doit être ajustée si nécessaire.
- Le temps pendant lequel les embryons répondre à l'environnement anoxique peut varier selon le stade du cycle cellulaire lors de l'exposition anoxie. Typiquement arrestation prophase anoxie induite se produit dans les 20-30 min de commencer flux d'azote gazeux. Nous avons observé une anoxie induite occu arrêt du cycle cellulairerring à <20 min. Les images peuvent être obtenus au cours de cette période, ou des images spécifiques peuvent être isolés par la suite d'une série time-lapse. Une autre option est d'utiliser la vidéo-microscopie de visualiser des structures subcellulaires dans les embryons.
- Pour documenter la récupération de l'état d'anoxie induite par arrêté, le gaz est éteint et que la chambre est autorisé à retourner à la normoxie par diffusion lors de l'enregistrement d'une série time-lapse. Reprise de la progression du cycle cellulaire et le désarrimage des chromosomes se produit généralement dans les 5-20 min de transformer l'azote gazeux hors tension.
- Notez que dans des expériences séparées un indicateur anoxie, résazurine, a été placé dans la microchambre accréditives, il a été déterminé que la chambre devient anoxique, en moyenne, d'environ 19 minutes après l'écoulement du gaz d'azote a commencé.
- Images et vidéos sont traitées à l'aide Imaris, Image J ou Photoshop et importés dans QuickTime pour l'affichage.
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Representative Results
C. elegans embryons exposés à la privation d'oxygène sévère (anoxie) sont capables de survivre en arrêtant les processus biologiques, y compris le développement et 7 de la division cellulaire. L'arrestation anoxie induite par la division cellulaire peut être contrôlé, à un niveau sub-cellulaire, en utilisant une chambre microincubation en conjonction avec flux d'azote gazeux à travers un microscope et confocale à disque rotatif pour créer un environnement contrôlé dans lequel les animaux peuvent être visualisés in vivo (Figure 1). Les structures cellulaires d'intérêt peuvent être surveillés dans l'embryon exposés à des environnements différents gaz, dans ce cas, nous avons utilisé GFP-tubuline marqués gamma et histone H2B de contrôler la structure des chromosomes dans un embryon exposé à l'anoxie.
Dans l'embryon exposés à l'anoxie, les chromosomes de blastomères prophase va se condenser et de s'aligner sur la périphérie intérieure nucléaire, un phénomène appelé «chromosome d'accueil" (Figure 2, Film 1).Après ré-oxygénation progression du cycle cellulaire et les chromosomes reprendra de blastomères prophase se déplace de la périphérie du noyau à la progression plaque équatoriale indiquant à la métaphase (Film 2). Cette technique peut également servir à visualiser arrestation à d'autres étapes de la division cellulaire ou des chromosomes bivalents d'ovocytes dans hermaphrodites exposés à l'anoxie 8.
Figure 1. Exemple de microscope et la configuration chambre utilisée pour l'analyse in vivo. Zeiss inversé microscope confocal à Leiden fermé et fixé perfusion Microincubator réservoir d'azote gazeux (A); platine du microscope et microincubator (B), et vue agrandie de microincubator (C).
Figure 2. HAllmark d'anoxie induite par la prophase arrêté blastomère. Indiqués sont des images représentatives d'un blastomère prophase au début du imagerie time-lapse (A) blastomère d'un embryon exposé à la normoxie (B) ou un blastomère d'un embryon après 30 min d'anoxie (C). La prophase anoxie induite par arrêté blastomères chromosomes affiche amarrés près de la périphérie intérieure nucléaire et NEBD est arrêté. Barre d'échelle = 5 um.
Film 1. Time-lapse analyse d'un blastomère au passage de normoxie à l'anoxie. Notez chromosomes alignement à la périphérie du noyau. Les images ont été capturées 28 min après l'écoulement du gaz à travers commencé. Cliquez ici pour voir le film .
Movie 2. Time-lapse analyse d'un blastomère récupération d'anoxie. Avec le retour de l'oxygène à la reprise du système du cycle cellulaire. Les images ont été capturées à 10 min après l'écoulement du gaz à travers c étaitassouplies. Cliquez ici pour voir le film .
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Discussion
La privation d'oxygène et de Suspended Animation
Bien que l'exposition à la privation d'oxygène graves peuvent être mortels pour certains organismes, certains organismes sont capables de survivre à l'exposition à l'anoxie. Dans le cas de C. elegans, la survie de l'exposition anoxie dépend du stade de développement et de réponse à l'anoxie est entrée dans un état d'animation suspendue réversible dans lequel un certain nombre de processus biologiques observables sont arrêtés. Processus de la division cellulaire, le développement, le mouvement, alimentaires et de reproduction cesser jusqu'à ce que l'oxygène est réintroduit dans l'environnement 7,9. Progression du cycle cellulaire, des embryons exposés à l'anoxie, réversible arrestations à l'interphase, prophase tardive ou de métaphase. L'utilisation de cellules techniques biologiques tels que immunomarquage dans des échantillons fixes et dans des essais in vivo de protéines de fusion GFP, ce qui permet l'imagerie de certaines structures subcellulaires dans un environnement privé d'oxygène, ont joué un rôle déterminant dans l'identification et la caractérisation descaractéristiques spécifiques de l'anoxie induite animation suspendue en C. elegans 8,10,11.
Les embryons et les ovocytes présentent des caractéristiques marquées d'anoxie induite animation suspendue qui sont facilement visibles en utilisant la microscopie à fluorescence en combinaison avec des protéines marquées par fluorescence ou des anticorps dirigés contre des protéines spécifiques pour analyser les embryons fixes. Blastomères interphase, des embryons exposés à l'anoxie, sont caractérisés par condensation partielle de la chromatine et arrêt de la progression du cycle cellulaire avec une chromatine aligner à la périphérie du noyau 9. Bien répartition de l'enveloppe nucléaire (NEBD) signifie un engagement définitif à la mitose dans l'anoxie, l'arrestation prophase est caractérisée par l'arrestation de NEBD, et l'alignement des chromosomes condensés entièrement à la périphérie nucléaire 10,12. Arrêt en métaphase, d'autre part, est caractérisée par l'arrestation des chromosomes à la plaque métaphasique et la dépolymérisation partielle des microtubules, entre autres,choses. Anoxie provoquée par un arrêt du cycle cellulaire à toutes les étapes est réversible et sur réoxygénation, reprend la progression du cycle cellulaire. Dans les expositions anoxie de 24 heures ou moins, les animaux témoins et expérimentaux sont indiscernables lors de la récupération 7. En utilisant les méthodes décrites ici l'animal est capable de survivre à l'exposition anoxie.
Analyse en Imagerie et considérations
La méthode présentée ici utilise le TH32 (unc-119 (ed3) ruIs32 III; ddIs6) souche de C. elegans. Cette souche exprime deux protéines marquées par fluorescence qui facilitent la visualisation des centrosomes et des chromosomes. Centrosomes sont marqués par ddIs6 [pie-1-1 :: TBG :: GFP + unc-119 (+)], qui code pour la GFP-tubuline marqué gamma, et se localise sur centrosomes au long du cycle cellulaire. La position des centrosomes est indicatif de la phase du cycle cellulaire et est utile pour décider du moment expériences anoxie. Les chromosomes sont marqués par ruIs32 [unc-119 (+)-1 pie :: GFP :: H2B], qui code pour une protéine histone GFP marquée et est entraîné par un promoteur spécifique de la lignée germinale 5. Ainsi, le mouvement et la localisation des chromosomes au sein de blastomères ou des ovocytes peut être suivie. Dans un embryon en développement, avant l'anoxie provoquée par un arrêt du cycle cellulaire, un blastomère, et donc le noyau, peut se déplacer sur le plan focal d'où la nécessité d'adapter le plan focal pendant l'imagerie. Il est possible de suivre plus d'un blastomère ou noyau, mais mise au point manuelle sur l'objet cellulaire d'intérêt peut être nécessaire de faire pour optimiser la visualisation des multiples composantes cellulaires d'intérêt. Cela pourrait limiter la capacité d'automatiser le processus à moins d'être en utilisant un logiciel pour suivre une région spécifique et de le suivre. Nous n'avons pas essayé d'automatiser le processus.
Pour optimiser le protocole de son test spécifique, on peut considérer les différents aspects de la microscopie et les antécédents génétiques d'intérêts 13 (NPP-16 (ok1839)) en utilisant la même technique (par exemple, en même temps anoxie) comme témoins et ont constaté que le phénotype (dans ce cas d'arrêt anormal de blastomères prophase) peuvent être capturées dans les 30 min d'exposition à l'anoxie 10. Les embryons peuvent survivre plus de trois jours d'anoxie en utilisant d'autres méthodes, nous n'avons pas identifié des mutations qui entraînent une résistance à l'anoxie (survie prolongée au-delà de 3 jours de l'exposition) dans l'embryon.
Pour nos besoins, nous sommes l'image d'un processus hautement dynamique cellulaire, et utilisent un microscope confocal à disque rotatif pour l'acquisition rapide des images. Selon les besoins particuliers d'une expérience, il sera nécessaire de déterminer si un autre type de technique de microscopie peut-être plusppropriate.
Lors du choix ou de développer une souche transgénique de cette méthode, il est important de tenir compte de la sensibilité du microscope qui sera utilisé ainsi que la tendance photoblanchiment du fluorophore particulier. L'utilisation de l'imagerie laps de temps dans cette méthodologie peut conduire à photo significative de blanchiment dans des souches qui ne sont pas fortement expriment une protéine fluorescente.
Il ya plusieurs défis techniques et les limites à prendre en considération lors de la collecte des images in vivo en utilisant cette méthode. En raison de la taille de la chambre, et le caractère potentiellement temps des expériences, il peut être difficile d'analyser un grand nombre d'échantillons dans un court laps de temps. Expériences exigeant échantillons de grande taille peut souvent être associée à d'autres méthodes d'anoxie pour générer des ensembles de données volumineux, et l'imagerie in vivo peut être utilisé pour documenter, vérifier ou examiner de plus près un phénotype d'intérêt. Additionnellement, si l'expérience nécessite un examen à des moments spécifiques au cours d'une exposition à long terme, des problèmes avec la dessiccation échantillon peuvent survenir. En dépit d'être recouvert d'huile halocarbures, les animaux peuvent commencer à se dessécher en raison du flux continu de gaz, donc la limitation du temps expérimental pourrait atténuer ce problème. En outre, on peut envisager d'utiliser des gaz hydraté ou une chambre de contrôle de l'humidité qui permet de réduire les problèmes de dessiccation.
Un avantage de cette technique est que les expériences hypoxie sont également possibles. Ainsi, pour d'autres études sur la privation d'oxygène, on peut simplement utiliser un réservoir de gaz avec une concentration d'oxygène spécifiée (par exemple 1% O 2 en balance avec N 2) d'examiner les réponses à l'hypoxie plutôt que d'un environnement complètement anoxique. En outre, une autre modification simple et flexible est l'utilisation d'autres gaz, y compris O 2 niveaux au-dessus de 21%, H 2 S ou CO, mais la sécurité de l'utilisation de ces mélanges de gaz est une majoconsidération r et précautions supplémentaires doivent être prises 14.
Importance de la technique
Alors que nous avons décrit cette méthode pour exposer C. elegans à l'anoxie et de visualiser les caractéristiques de l'anoxie induite animation suspendue dans un embryon en utilisant très spécifiques sub-cellulaires marqueurs, ces résultats ne sont que représentatives d'un seul essai dans une grande variété de possibilités expérimentales en utilisant le système de chambre que nous décrivons ici. La privation d'oxygène a été démontré qu'elle affecte un certain nombre de processus cellulaires dans un large éventail d'organismes, et en exploitant cette technique, les effets spécifiques de l'anoxie, l'hypoxie, et une variété d'autres environnements peuvent être visualisées et capturé in vivo. Par exemple, en appuyant sur C. elegans ce système pourrait être utilisé pour analyser d'autres phénotypes induits par la privation d'oxygène, comme l'autorise l'utilisation de l'anesthésie tricaïne / tetramizole (c.-à-pharyngée de pompage et reproductive processus).
L'application de cette méthode ne se limite pas à C. elegans. Ce flux de gaz à travers l'installation de chambre offre une méthode simple pour exposer des cellules et des organismes entiers à de faibles concentrations d'oxygène tout en capturant des changements cellulaires et de visualiser l'activité de fusions de protéines fluorescentes. Par exemple, cette méthode est facilement adaptable à la levure, culture cellulaire ou petit invertébré ou embryons de vertébrés dont les tailles ne sont pas trop grand pour la chambre.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Nous tenons à exprimer notre reconnaissance pour la contribution et les commentaires des membres du Laboratoire Padilla. Souches de nématodes dans ce travail ont été fournies par le Centre de Caenorhabditis Genetics, qui est financé par le NIH Centre National de Ressources de recherche (NCRR). Nous reconnaissons et remercions le Dr Lon-Turnbull pour l'assistance technique en microscopie confocale. Ce travail a été soutenu par une subvention de la National Science Foundation (NSF-IOS, carrière) au PAP
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents/Equipment | Composition | ||
| Hypochlorite solution | 0.7 g KOH, 12 ml 5% NaOCl, bring to 50 ml with ddH20 | ||
| M9 buffer | 3 g KH2PO4, 11 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml (1 M) MgSO4 per 1 L ddH2O | ||
| Glass microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-343 | 3"x1"x1.0 mm |
| Round micro coverglass | Electron Microscopy Sciences | 72223-01 | 25 mm Diameter |
| Halocarbon oil 700 | Sigma | H8898-100ml | |
| Anesthetic | 0.5% tricaine, 0.05% tetramisole | ||
| Leiden Closed Perfusion Microincubator | Harvard Apparatus | 650041 | |
| UHP Nitrogen | Calgaz (Air Liquide) | >99.9990% N2 <2 ppm O2 | |
| Plastic tubing | VWR | 89068-468 | 0.062" ID x 0.125" OD |
| Spinning Disk Confocal Microscope | McBain Systems | Zeiss inverted optical microscope, epifluorescence illumination system, CSU-10 Yokogawa confocal scanner, Hamamatsu electron multiplier CCD camera. |
References
- Powell-Coffman, J. A. Hypoxia signaling and resistance in C. elegans. Trends Endocrinol. Metab. 21 (10), 435-440 (2010).
- Padilla, P. A., Ladage, M. L. Suspended animation, diapause and quiescence: Arresting the cell cycle in C. elegans. Cell Cycle. 11, (2012).
- Hu, P. J. Dauer. WormBook. , 1-19 (2007).
- Zhou, K. I., Pincus, Z., Slack, F. J. Longevity and stress in Caenorhabditis elegans. Aging (Albany NY). 3, 733-753 (2011).
- Schmidt, D. J., Rose, D. J., Saxton, W. M., Strome, S. Functional analysis of cytoplasmic dynein heavy chain in Caenorhabditis elegans with fast-acting temperature-sensitive mutations. Mol. Biol. Cell. 16, 1200-1212 (2005).
- Sulston, J., Hodgkin, J. The Nematode Caenorhabditis elegans. Wood, W. B. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 587-606 (1988).
- Padilla, P. A., Nystul, T. G., Zager, R. A., Johnson, A. C., Roth, M. B. Dephosphorylation of Cell Cycle-regulated Proteins Correlates with Anoxia-induced Suspended Animation in Caenorhabditis elegans. Mol. Biol Cell. 13, 1473-1483 (2002).
- Hajeri, V. A., Trejo, J., Padilla, P. A. Characterization of sub-nuclear changes in Caenorhabditis elegans embryos exposed to brief, intermediate and long-term anoxia to analyze anoxia-induced cell cycle arrest. BMC Cell Biol. 6, 1471-2121 (2005).
- Padilla, P. A., Goy, J. M., Hajeri, Anoxia. Padilla, P. A. , InTech. (2012).
- Hajeri, V. A., Little, B. A., Ladage, M. L., Padilla, P. A. NPP-16/Nup50 function and CDK-1 inactivation are associated with anoxia-induced prophase arrest in Caenorhabditis elegans. Mol. Biol. Cell. 21, 712-724 (2010).
- Nystul, T. G., Goldmark, J. P., Padilla, P. A., Roth, M. B. Suspended animation in C. elegans requires the spindle checkpoint. Science. 302, 1038-1041 (2003).
- Margalit, A., Vlcek, S., Gruenbaum, Y., Foisner, R. Breaking and making of the nuclear envelope. J. Cell Biochem. 95, 454-465 (2005).
- Maddox, A. S., Maddox, P. S. High-resolution imaging of cellular processes in Caenorhabditis elegans. Methods Cell Biol. 107, 1-34 (2012).
- Miller, D. L., Roth, M. B. C. elegans are protected from lethal hypoxia by an embryonic diapause. Curr. Biol. 19, 1233-1237 (2009).
