L'utilisation de la microscopie à Time Lapse Visualisez anoxie induite Suspended Animation en<em> C. elegans</em> Embryons
Summary
Décrit ici est un<em> In vivo</emTechnique> à l'image des structures sous-cellulaires chez les animaux exposés à une anoxie en utilisant un écoulement de gaz à travers la chambre microincubation en liaison avec un microscope confocal à disque rotatif. Cette méthode est simple et suffisamment souple pour s'adapter à une variété de paramètres expérimentaux et des systèmes modèles.
Abstract
Elegans Caenorhabdits a été largement utilisé dans l'étude de la résistance au stress, ce qui est facilité par la transparence des stades adultes et d'embryons ainsi que par la disponibilité de mutants génétiques et des souches transgéniques exprimant une myriade de 1-4 des protéines de fusion. En outre, les processus dynamiques comme la division cellulaire peut être consulté en utilisant des protéines marquées par fluorescence reporter. L'étude de la mitose peut être facilitée par l'utilisation de time-lapse expériences dans divers systèmes, y compris les organismes intacts; ainsi le début C. embryon elegans est bien adapté pour cette étude. Présentée ici est une technique par laquelle l'imagerie in vivo de structures subcellulaires en réponse à anoxique (99,999% de N 2; <2 ppm 2 O) le stress est possible en utilisant un flux de gaz simple grâce à l'installation sur un microscope très puissant. Une chambre microincubation est utilisé en conjonction avec un débit d'azote gazeux à travers et un microscope confocal à disque rotatifà créer un environnement contrôlé dans lequel les animaux peuvent être imagé in vivo. Utilisant la GFP-tubuline marqués gamma et des histones, la dynamique et arrêt de la division cellulaire peut être surveillé avant, pendant et après l'exposition à un environnement privé d'oxygène. Les résultats de cette technique sont en haute résolution, des vidéos et des images détaillées des structures cellulaires au sein de blastomères d'embryons exposés à la privation d'oxygène.
Protocol
Representative Results
Discussion
La privation d'oxygène et de Suspended Animation
Bien que l'exposition à la privation d'oxygène graves peuvent être mortels pour certains organismes, certains organismes sont capables de survivre à l'exposition à l'anoxie. Dans le cas de C. elegans, la survie de l'exposition anoxie dépend du stade de développement et de réponse à l'anoxie est entrée dans un état d'animation suspendue réversible dans lequel un certain nombre de processu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à exprimer notre reconnaissance pour la contribution et les commentaires des membres du Laboratoire Padilla. Souches de nématodes dans ce travail ont été fournies par le Centre de Caenorhabditis Genetics, qui est financé par le NIH Centre National de Ressources de recherche (NCRR). Nous reconnaissons et remercions le Dr Lon-Turnbull pour l'assistance technique en microscopie confocale. Ce travail a été soutenu par une subvention de la National Science Foundation (NSF-IOS, carrière) au PAP
Materials
| Reagents/Equipment | Composition | ||
| Hypochlorite solution | 0.7 g KOH, 12 ml 5% NaOCl, bring to 50 ml with ddH20 | ||
| M9 buffer | 3 g KH2PO4, 11 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml (1 M) MgSO4 per 1 L ddH2O | ||
| Glass microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-343 | 3″x1″x1.0 mm |
| Round micro coverglass | Electron Microscopy Sciences | 72223-01 | 25 mm Diameter |
| Halocarbon oil 700 | Sigma | H8898-100ml | |
| Anesthetic | 0.5% tricaine, 0.05% tetramisole | ||
| Leiden Closed Perfusion Microincubator | Harvard Apparatus | 650041 | |
| UHP Nitrogen | Calgaz (Air Liquide) | >99.9990% N2 <2 ppm O2 | |
| Plastic tubing | VWR | 89068-468 | 0.062″ ID x 0.125″ OD |
| Spinning Disk Confocal Microscope | McBain Systems | Zeiss inverted optical microscope, epifluorescence illumination system, CSU-10 Yokogawa confocal scanner, Hamamatsu electron multiplier CCD camera. |
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