Summary
Qui descritto è un
Abstract
Elegans Caenorhabdits è stato ampiamente utilizzato nello studio della resistenza alle sollecitazioni, che è facilitato dalla trasparenza degli stadi adulti ed embrioni nonché dalla disponibilità di mutanti genetici e ceppi transgenici che esprimono una miriade di proteine di fusione 1-4. Inoltre, i processi dinamici come la divisione cellulare può essere visualizzato utilizzando proteine del reporter fluorescente etichettati. Lo studio della mitosi può essere facilitata attraverso l'utilizzo di time-lapse esperimenti in vari sistemi, compresi gli organismi intatti e di conseguenza l'inizio C. embrione elegans è adatto per questo studio. Presentato qui è una tecnica con la quale immagini in vivo di strutture subcellulari in risposta a anossica (99.999% N 2; <2 ppm O 2) lo stress è possibile con un semplice flusso di gas attraverso la configurazione di un potente microscopio. Una camera microincubation viene utilizzato in combinazione con un flusso di azoto e gas attraverso un microscopio confocale disco rotanteper creare un ambiente controllato in cui gli animali possono essere esposte in vivo. Utilizzando GFP-tubulina gamma etichettato e istoni, la dinamica e arresto della divisione cellulare può essere monitorato prima, durante e dopo l'esposizione ad un ambiente privo di ossigeno. I risultati di questa tecnica sono ad alta risoluzione, video e immagini dettagliate delle strutture cellulari all'interno blastomeri di embrioni esposti a deprivazione di ossigeno.
Protocol
1. Preparazione del campione
- Produrre o ottenere adeguata transgenici C. elegans ceppo di interesse utilizzando metodologie transgeniche o da Caenorhabditis Genetica Image Center (CGC) o un collega. In questo caso stiamo usando ceppo TH32 (pie-1 :: TBG-1 :: GFP; pie-1 :: GFP :: H2B) 5 per visualizzare i cromosomi e centrosomi come marcatori per la divisione cellulare.
- Genera una popolazione sincronizzato utilizzando uno dei tre metodi: 1) si disintegrano adulti gravide in soluzione di ipoclorito e utilizzare gli embrioni restanti 6, 2) raccogliere adulti gravide su un piatto semi e farli posare embrioni per 1-2 ore, o 3) raccogliere L4 larve da una popolazione mista e passaggio ad una nuova piastra testa di serie.
- Grow nematodi a 20 ° C fino all'età adulta gravido giovani, che avrà circa 96 ore dalla schiusa, 72 ore da larve L1 o 24 ore dopo molt L4. Gli embrioni (2-20 celle) in utero contengono blastomeri grandi e nuclei che sono ottimali per imagmodifiche zione sub-cellulari e sub-nucleare, rispettivamente. Questo metodo fornisce un mezzo per generare una popolazione di giovani adulti che contengono un numero abbondante di embrioni precoci.
2. Preparazione Far scorrere e anossia Camera Set Up
- Effettuare una camera umida per contenere vetrini preparati mettendo un tovagliolo di carta umido all'interno di un grande piatto Petri o contenitore coperto con un coperchio di dimensioni sufficienti.
- Preparare fuso agarosio al 2% in acqua deionizzata H 2 O per riscaldamento composto in vetro con bagno forno a microonde o in acqua.
- Mettere 1-3 gocce di caldo agarosio su un vetrino da microscopio pulito di vetro. Porre immediatamente una seconda slitta invertito perpendicolarmente sulla cima della goccia agarosio (s), premere leggermente in modo che la pastiglia risultante sarà sottile e privo di bolle d'aria.
- Attendere che si raffreddi e lentamente smontare i due vetrini che lasciano intatto il pad agarosio su una delle diapositive. È importante assicurare il pad agarosio è sufficientemente sottile da non interfenuovamente con la capacità di concentrare il microscopio tardi. Capacità di visualizzare campione dipende anche la distanza ottica specifica dell'obiettivo in uso, che può variare tra microscopi.
- Utilizzare una lama di rasoio pulito per modellare pad agarosio in una piccola piazza. Memorizzare nella camera umida preparata fino al momento dell'uso.
- Accuratamente, utilizzando la stessa lama di rasoio pulito, prendere il bordo del pad agarosio e trasferirlo dal vetrino su un tondo 25 millimetri micro coprioggetti, evitando l'accumulo di bolle d'aria sotto il pad. Il copri tutto selezionato da utilizzare si inserisce in modo appropriato nella microincubator.
- Aggiungere una goccia di anestetico (0,5% tricaine, 0,05% in Tetramisole M9 buffer) sul pad agarosio per uso come anestetico. Scegli vermi 5-10 e posto nella goccia di anestetico. Lasciare 1-3 min per i vermi a cessare il movimento.
- Il razionale per osservare embrioni all'interno dell'utero adulto, invece di embrioni sezionato, è ridurre al minimo il potenziale di embrione desiccazione e movimento a causa del flusso di gas di azoto attraverso l'embrione.
- Immediatamente aggiungere una goccia di olio Halocarbon sopra i vermi per evitare che i vermi di disidratazione il gas viene fatto fluire attraverso la camera. Dal momento che l'olio è viscoso Halocarbon si può usare una punta della pipetta o la punta di una vite senza fine sceglie di raccogliere l'olio e caduta sui vermi.
- Una volta che il coverglass circolare contenente i vermi è pronto, le due metà del Leiden chiuso perfusione microincubator sono separati, e poi attentamente coverglass è posto verticalmente sull'anello inferiore. I due lati della camera vengono poi chiusi ermeticamente insieme.
- La camera è quindi collegato al serbatoio del gas azoto attraverso tubi di plastica flessibile e collocato nel punto appropriato sulla scena microscopio (Figura 1C). In questo momento il tubo e microincubator devono essere attentamente controllati per eventuali perdite assicurando il fissaggio sicuro dei tubi e dei tappi lungo il lato della camera. Si può alcon tanta leggerezza diffondere una piccola quantità di acqua e sapone sul tubo alla ricerca di bolle, che andranno a formare, se è presente una perdita.
3. Microscopia in anossia
- Individuare gli animali a basso ingrandimento, poi, passare al più alto ingrandimento appropriato (64x per questa applicazione) ai tessuti immagine o le cellule di interesse come blastomeri embrionali o ovociti negli adulti. Accendere il laser 488 nm per visualizzare il segnale GFP e proteina di fusione GFP individuare nella cella (s) di interesse.
- Per visualizzare l'arresto al determinata fase di arresto del ciclo cellulare (ad es profase tardi) identificano un blastomero in una fase preliminare di divisione cellulare (ad es interfase in ritardo o profase precoce). Marcatori cellulari, come la posizione centriolo, avvio della condensazione cromosomica, la posizione dei cromosomi e la presenza o l'assenza della busta nucleare permetterà di individuare fasi del ciclo cellulare (Figura 2A).
- La camera viene poi perfusi con gas azoto (99,999%N 2; <2 ppm O 2). In questo caso si utilizza una pressione di 6 psi, tuttavia la pressione può essere necessario regolare e ottimizzato a seconda della dimensione di ciascun microincubator e diametro del tubo in uso. Continuare a monitorare la blastomero (s) come azoto riempie la camera, la regolazione del piano focale come necessario.
- A questo punto, time-lapse imaging è iniziata. Imaging è condotto per il tempo necessario per catturare fenomeno di interesse, in questo caso e arresto profase aggancio dei cromosomi alla membrana interna nucleare. Le immagini sono presi una volta ogni 10 secondi per non più di 30 min. Le frequenze di cattura di immagini e impostazioni quali il guadagno e la potenza del laser deve essere regolato secondo necessità.
- Il tempo in cui gli embrioni rispondere all'ambiente anossico può variare a seconda dello stadio del ciclo cellulare in seguito all'esposizione anossia. Tipicamente anossia arresto indotto profase si verifica entro 20-30 minuti di inizio flusso di gas di azoto. Abbiamo osservato anossia-indotta del ciclo cellulare occu arrestoRing in <20 min. Le immagini possono essere ottenute durante questo lasso di tempo, o le immagini fisse possono essere isolati in seguito da un time-lapse serie. Un'ulteriore opzione è quella di utilizzare la microscopia video per visualizzare strutture subcellulari in embrioni.
- Per documentare recupero dalla anossia indotto stato arrestato, il gas viene spento e la camera viene permesso di tornare normossia per diffusione durante la registrazione di un time-lapse serie. Ripresa della progressione del ciclo cellulare e lo scollegamento dei cromosomi si verifica in genere entro 5-20 minuti di trasformare l'azoto off.
- Si noti che in esperimenti separati un indicatore anossia, resazurina, è stato posto in flusso continuo microcamera, è stato determinato che la camera diventa anossica in media di circa 19 min dopo il flusso del gas di azoto è iniziata.
- Le immagini ei video sono trattati con Imaris, Immagine a J o Photoshop e importati in QuickTime per la visualizzazione.
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Representative Results
C. elegans embrioni esposti a grave carenza di ossigeno (anossia) sono in grado di sopravvivere con l'arresto di processi biologici tra cui lo sviluppo e la divisione cellulare 7. L'anossia arresto indotto di divisione cellulare può essere monitorata, ad un livello sub-cellulare, utilizzando una camera microincubation in combinazione con flusso di azoto e gas attraverso un microscopio confocale disco rotante per creare un ambiente controllato in cui gli animali possono essere esposte in vivo (Figura 1). Strutture cellulari di interesse può essere monitorata nel embrione esposti ad ambienti di gas diversi, in questo caso abbiamo usato GFP-tagged tubulina gamma e istone H2B per monitorare la struttura cromosomica in un embrione esposto a anossia.
All'interno dell'embrione esposto alla anossia, i cromosomi di blastomeri profase si condensa e allinearsi con la periferia interna nucleare, un fenomeno denominato "docking cromosoma" (Figura 2, Movie 1).Al riossigenazione progressione del ciclo cellulare e riprenderà cromosomi di blastomeri profase si sposta dalla periferia nucleare alla progressione piastra equatoriale indicando metafase (Movie 2). Questa tecnica può anche utilizzato per visualizzare l'arresto in altre fasi della divisione cellulare o cromosomi bivalenti di ovociti in ermafroditi esposti a anossia 8.
Figura 1. Esempio di microscopio e camera di configurazione utilizzati per l'analisi in vivo. Invertito microscopio confocale Zeiss con Leiden chiuso perfusione Microincubator e annesso serbatoio di gas azoto (A); portaoggetti e microincubator (B), e la vista ingrandita di microincubator (C).
Figura 2. HAllmark di anossia indotta profase arrestato blastomeri. Mostrato immagini sono rappresentative di un blastomero profase all'inizio del time-lapse imaging (A) blastomero di un embrione esposto a normossia (B) o un blastomero di un embrione dopo 30 minuti di esposizione anossia (C). L'anossia indotta profase arrestato blastomeri cromosomi display ormeggiate nei pressi della periferia interna nucleare e NEBD viene arrestato. Barra della scala = 5 micron.
Movie 1. Time-lapse analisi di un blastomero in transizione da normossia di anossia. Nota cromosomi allineamento alla periferia nucleare. Le immagini sono state catturate 28 min dopo che il flusso di gas attraverso cominciato. Clicca qui per visualizzare filmati .
Movie 2. Time-lapse analisi di un blastomero riprendendo da anossia. Con il ritorno di ossigeno ai riprende ambiente del ciclo cellulare. Le immagini sono state catturate 10 minuti dopo che il flusso di gas attraverso era callentato. Clicca qui per visualizzare filmati .
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Discussion
Privazione di ossigeno e Suspended Animation
Sebbene l'esposizione alla carenza di ossigeno grave può essere fatale per alcuni organismi, alcuni organismi sono in grado di sopravvivere l'esposizione a anossia. Nel caso di C. elegans, la sopravvivenza di esposizione anossia dipende stadio di sviluppo e la risposta alla anossia è entrata in uno stato di animazione sospesa reversibile in cui sono stati arrestati una serie di processi biologici osservabili. Processi di divisione cellulare, lo sviluppo, il movimento, mangiare e riproduttiva cessa finché l'ossigeno viene reintrodotto nell'ambiente 7,9. Progressione del ciclo cellulare, di embrioni di anossia-esposti, reversibilmente arresti in interfase, profase ritardo o metafase. L'uso di cellule tecniche biologiche come immunostaining in campioni fissi e saggi in vivo proteina di fusione GFP, che permette l'imaging di specifiche strutture subcellulari in un ambiente privo di ossigeno, sono fondamentali per identificare e caratterizzarecaratteristiche specifiche di anossia indotta animazione sospesa in C. elegans 8,10,11.
Sia embrioni e ovociti visualizzare caratteristiche contrassegnate di anossia indotta animazione sospesa che sono facilmente visibili con il microscopio a fluorescenza in combinazione con proteine fluorescenti marcate o anticorpi contro le proteine specifiche per analizzare gli embrioni fissi. Blastomeri interfase, di embrioni esposti a fenomeni di anossia, sono caratterizzati da parziale condensazione della cromatina e l'arresto della progressione del ciclo cellulare, con un po 'di cromatina allineando alla periferia nucleare 9. Mentre ripartizione involucro nucleare (NEBD) significa un impegno definitivo alla mitosi in anossia, arresto profase è caratterizzata da arresto di NEBD, e l'allineamento dei cromosomi condensati completamente alla periferia nucleare 10,12. Arresto metafase, invece, si caratterizza per l'arresto dei cromosomi nella piastra di metafase e parziale depolimerizzazione dei microtubuli, tra l'altro,cose. Anossia indotta arresto del ciclo cellulare in tutte le fasi è reversibile e su riossigenazione, ciclo cellulare riprende progressione. In esposizioni anossia di 24 ore o meno, animali di controllo e sperimentali sono indistinguibili ad avvenuta guarigione 7. Utilizzando i metodi descritti qui l'animale è in grado di resistere all'esposizione anossia.
Imaging di analisi e considerazioni
Il metodo qui presentato utilizza il TH32 (unc-119 (ED3) ruIs32 III; ddIs6) ceppo di C. elegans. Questo ceppo esprime due proteine fluorescenti marcate che facilitano la visualizzazione dei centrosomi e cromosomi. Centrosomi sono contrassegnati da ddIs6 [pie-1 :: TBG-1 :: GFP + unc-119 (+)], che codifica per GFP-tagged tubulina gamma, e si localizza a centrosomi durante il ciclo cellulare. La posizione dei centrosomi è indicativo della fase del ciclo cellulare ed è utile per cronometrare esperimenti anossia. I cromosomi sono contrassegnati da ruIs32 [unc-119 (+) pie-1 :: GFP :: H2B], che codifica una proteina istone GFP marcato ed è guidato da una linea germinale promotore specifico 5. Così, il movimento e la localizzazione di cromosomi all'interno blastomeri o ovociti può essere seguita. All'interno di un embrione, prima anossia indotta arresto del ciclo cellulare, un blastomero, e così il nucleo, può muoversi fuori dal piano focale rendendo necessario regolare il piano focale durante l'imaging. È possibile seguire più di un blastomero o nucleo ma manuale focalizzazione sull'oggetto cellulare di interesse può essere necessario fare per ottimizzare la visualizzazione delle molteplici componenti cellulari di interesse. Ciò può limitare la possibilità di automatizzare il processo a meno che non si sta usando il software per monitorare una regione specifica e seguirlo. Non abbiamo cercato di automatizzare il processo.
Per ottimizzare il protocollo per il proprio dosaggio specifico si può considerare vari aspetti della microscopia e background genetico di interesse 13 (NPP-16 (ok1839)) usando la stessa tecnica (ad es stesso tempo di esposizione anossia) come controlli e trovato che il fenotipo (in questo caso l'arresto anormale di blastomeri profase) può essere catturato entro 30 min di esposizione a 10 anossia. Gli embrioni possono sopravvivere più di tre giorni di anossia con altre metodologie, non abbiamo identificato mutazioni che si traducono in una resistenza all'esposizione anossia (sopravvivenza esteso oltre 3 giorni di esposizione) nell'embrione.
Per i nostri scopi, noi siamo l'immagine di un processo altamente dinamico cellulare, e si utilizza un microscopio confocale disco rotante per una rapida acquisizione delle immagini. A seconda delle esigenze particolari di un esperimento, sarà necessario determinare se un diverso tipo di tecnica di microscopia può essere più di unppropriate.
Quando si sceglie o sviluppare un ceppo transgenico per questo metodo, è importante considerare la sensibilità del microscopio che verrà utilizzato così come la tendenza fotodecolorazione del fluoroforo particolare. L'uso di immagini lasso di tempo in questa metodologia può portare a significative foto sbianca in ceppi che non fortemente esprimono una proteina fluorescente.
Ci sono diversi problemi tecnici e limitazioni da prendere in considerazione quando si raccolgono le immagini in vivo, utilizzando questa metodologia. A causa delle dimensioni della camera, e la natura potenzialmente tempo degli esperimenti, può essere difficile analizzare un gran numero di campioni in un breve lasso di tempo. Gli esperimenti che richiedono campioni di grandi dimensioni spesso può essere accoppiato con altri metodi di esposizione anossia per generare grandi quantità di dati, e imaging in vivo può essere utilizzato per documentare, verificare o più esaminare attentamente un fenotipo di interesse. Additionally, se l'esperimento richiede un esame in punti temporali specifici durante una esposizione a lungo termine, problemi con essiccazione del campione possono sorgere. Nonostante sia coperto di olio Halocarbon, gli animali possono iniziare ad essiccare a causa del flusso continuo di gas, di conseguenza limitare il tempo sperimentale potrebbe alleviare questo problema. Inoltre, si può considerare l'utilizzo di gas idrato o una camera, che permette il controllo dell'umidità per alleviare problemi essiccazione.
Un vantaggio di questa tecnica è che gli esperimenti ipossia sono anche fattibili. Così, per ulteriori studi privazione di ossigeno si può semplicemente utilizzare un serbatoio di gas con una concentrazione di ossigeno specificato (ad esempio 1% O 2 equilibrato con N 2) per esaminare le risposte all'ipossia piuttosto che un ambiente completamente anossico. Inoltre, un'altra modifica semplice e flessibile è l'uso di altri gas tra O 2 livelli superiori al 21%, H 2 S oppure CO, tuttavia, la sicurezza di utilizzare queste miscele di gas è un major esame e ulteriori precauzioni devono essere prese 14.
Significato della Tecnica
Mentre abbiamo descritto questo metodo per esporre C. elegans per anossia e visualizzare i tratti distintivi di anossia indotta animazione sospesa all'interno di un embrione con molto specifiche sub-cellulari marcatori, questi risultati sono rappresentativi solo un singolo test in una vasta gamma di possibilità sperimentali che utilizzano il sistema camerale che descriviamo qui. Privazione di ossigeno ha dimostrato di influenzare un numero di processi cellulari in una vasta gamma di organismi, e sfruttando questa tecnica, effetti specifici di anossia, ipossia, e una varietà di altri ambienti possono essere visualizzati e catturato in vivo. Ad esempio, utilizzando C. elegans questo sistema potrebbe essere utilizzato per analizzare altri fenotipi indotti da carenza di ossigeno, come consentito con l'uso del tricaine / tetramizole anestetico (cioè pompaggio faringea e reproductive processi).
L'applicazione di questa metodologia non è limitata a C. elegans. Questo flusso di gas attraverso la camera di configurazione fornisce un metodo semplice per esporre cellule e organismi interi a basse concentrazioni di ossigeno e contemporaneamente catturare cambiamenti cellulari e visualizzazione dell'attività di fusioni di proteine fluorescenti. Per esempio, questo metodo è facilmente adattabile al lievito, coltura cellulare o piccolo invertebrato o embrioni di vertebrati cui dimensioni non sono troppo grandi per la camera.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Vorremmo esprimere il nostro apprezzamento per l'ingresso e commenti dei membri del laboratorio Padilla. Ceppi di nematodi in questo lavoro sono stati forniti dalla genetica Caenorhabditis Center, che è finanziato dalla National NIH Center for Research (NCRR). Prendiamo atto e ringraziamo il Dott. Lon Turnbull per l'assistenza tecnica con la microscopia confocale. Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento della National Science Foundation (NSF-IOS, CARRIERA) per PAP
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents/Equipment | Composition | ||
| Hypochlorite solution | 0.7 g KOH, 12 ml 5% NaOCl, bring to 50 ml with ddH20 | ||
| M9 buffer | 3 g KH2PO4, 11 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml (1 M) MgSO4 per 1 L ddH2O | ||
| Glass microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-343 | 3"x1"x1.0 mm |
| Round micro coverglass | Electron Microscopy Sciences | 72223-01 | 25 mm Diameter |
| Halocarbon oil 700 | Sigma | H8898-100ml | |
| Anesthetic | 0.5% tricaine, 0.05% tetramisole | ||
| Leiden Closed Perfusion Microincubator | Harvard Apparatus | 650041 | |
| UHP Nitrogen | Calgaz (Air Liquide) | >99.9990% N2 <2 ppm O2 | |
| Plastic tubing | VWR | 89068-468 | 0.062" ID x 0.125" OD |
| Spinning Disk Confocal Microscope | McBain Systems | Zeiss inverted optical microscope, epifluorescence illumination system, CSU-10 Yokogawa confocal scanner, Hamamatsu electron multiplier CCD camera. |
References
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