Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

השתמש של מיקרוסקופיה מעבר זמן לדמיין אנימצית מושעה anoxia מושרה ב doi: 10.3791/4319 Published: December 3, 2012

Summary

תאר כאן

Abstract

elegans Caenorhabdits כבר נעשה שימוש נרחב בחקר עמידות למצבי עקה, שהקלה על ידי השקיפות של השלבים הבוגרים ועובר, כמו גם על ידי הזמינות של מוטציות גנטיות וזנים מהונדסים המבטאים את מספר עצום של חלבוני היתוך 1-4. בנוסף, תהליכים דינמיים כגון חלוקת תא ניתן לצפות באמצעות חלבונים שכותרתו fluorescently כתב. המחקר של מיטוזה ניתן מתאפשר באמצעות השימוש בניסויי זמן לשגות במערכות שונות, כוללים אורגניזמים שלמים, ולכן מוקדם ג עובר elegans גם מתאים למחקר זה. מוצג כאן היא טכניקה שבאמצעותה בתחום הדמית vivo של מבנים תת סלולריים בתגובה לanoxic (99.999% N 2; <2 עמודים לדקת פלט 2) לחץ אפשרי באמצעות זרימת גז פשוט ועד התקנה במיקרוסקופ רב עצמה. קאמרי microincubation משמש יחד עם זרימת חנקן וגז באמצעות מיקרוסקופ confocal דיסק מסתובבכדי ליצור סביבה מבוקרת שבה ניתן הדמית בעלי חיים בחי. שימוש GFP מתויג-טובולין גמא והיסטון, הדינמיקה ומעצרו של חלוקת תא ניתן לנטר לפני, במהלך ולאחר החשיפה לסביבת חמצן מקופח-. התוצאות של טכניקה זו הן ברזולוציה גבוה, קטעי וידאו ותמונות מפורטים של מבנים תאיים בתוך לסטומרים של עוברים שנחשפו למחסור בחמצן.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. לדוגמא הכנה

  1. לייצר או להשיג המהונדס ג המתאים elegans להתאמץ עניין שימוש במתודולוגיות מהונדסות או מCaenorhabditis גנטיקת מלאי מרכז (CGC) או קולגה. במקרה זה אנו משתמשים במתח TH32 (עוגה-1 :: TBG-1 :: GFP; עוגה-1 :: GFP :: H2B) 5 לדמיין הכרומוזומים וcentrosomes כסמנים לחלוקת תא.
  2. צור אוכלוסייה מסונכרנת באמצעות אחת מהשלוש שיטות: 1) תתפורר מבוגרים הרה בתמיסת היפוכלוריט ולהשתמש עוברים שנותרו 6, 2) לאסוף מבוגרים הרה לצלחת seeded ונותן שיגעו לעוברים 1-2 שעות, או 3) לאסוף L4 זחלים מאוכלוסייה ומהלך מעורב לצלחת seeded חדשה.
  3. לגדול נמטודות ב 20 ° C לבגרות הרה צעירה, שתיקח כ 96 שעות מבקיעה, 72 שעות מזחלי L1 או נשירת 24 שעתי הודעת L4. עוברים (2-20 תא) ברחם מכילים לסטומרים וגרעינים גדולים שהם אופטימליים למתארים לעצמיing שינויים תת סלולריים ותת גרעיניים, בהתאמה. מתודולוגיה זו מספקת אמצעי ליצירת אוכלוסייה של צעירים המכילים מספר שופע של עוברים מוקדמים.

2. הכנת מצגת וanoxia קאמרי הגדרה

  1. הפוך תא לח להחזיק שקופיות שהוכנו על ידי הצבת מגבת נייר לחה בתוך צלחת פטרי גדולה או פח מכוסה במכסה בהיקף מספיק גדול.
  2. הכן מותך 2% agarose בdeionized H 2 O על ידי חימום תערובת זכוכית באמבטיה באמצעות מיקרוגל או מים.
  3. הנח 1-3 טיפין של agarose החם בשקופית מיקרוסקופ זכוכית נקיה. מייד למקם את השקופית שנייה ההפוכה ניצב בראש טיפת agarose (הים), לחץ מעט כדי שהמשטח שיתקבל יהיה דק וללא בועות אוויר.
  4. לאפשר זמן להתקרר ולפרק לאט את שתי שקופיות מיקרוסקופ עוזבים את כרית agarose שלם על אחת המגלשות. זה חשוב כדי להבטיח את כרית agarose הוא דק מספיק כדי לא interfeמחדש עם היכולת להתמקד מיקרוסקופ מאוחר יותר. יכולת לחזות מדגם תלוי גם במרחק המסוים האופטי של המטרה בשימוש, אשר יכול להשתנות בין מיקרוסקופים.
  5. השתמש בסכין גילוח נקי לעצב כרית agarose בכיכר קטנה. אחסן בתא הלח המוכן עד מוכן לשימוש.
  6. בזהירות, תוך שימוש באותה סכין הגילוח נקי, לקחת את קצה משטח agarose ולהעביר אותו מהשקופית על coverglass מ"מ מייקרו 25 עגול, הימנעות מההצטברות של בועות אוויר מתחת לכרית. Coverglass הסיבוב בחר להשתמש משתלב כראוי בmicroincubator.
  7. הוסף טיפה של חומר ההרדמה (0.5% tricaine, tetramisole 0.05% בM9 חיץ) על כרית agarose לשימוש כחומר הרדמה. פיק תולעים ומקום 5-10 לירידה של חומר הרדמה. אפשר 1-3 דקות לתולעים להפסקות תנועה.
  8. הרציונל להתבוננות עוברים בתוך הרחם הבוגר, במקום עוברים מכותרים, הוא למזער את הפוטנציאל של העובר desiccation ותנועה בגלל הזרימה של גז חנקן על פני העובר.
  9. מייד להוסיף טיפת שמן halocarbon על גבי את התולעים כדי למנוע את התולעים מהתייבשות כזרם גז דרך החדר. מאז שמן halocarbon צמיג אחד יכול להשתמש בטיפ pipet או קצה תולעת לאסוף לאסוף נפט וירידה על התולעים.
  10. ברגע coverglass המעגלי המכיל את התולעים מוכן, שני חצי ליידן נסגרו זלוף microincubator מופרדים, ואז coverglass הוא מונח בזהירות הזקופה לטבעת התחתונה. שני הצדדים של החדר לאחר מכן, סגורים היטב יחד.
  11. לאחר מכן התא מחובר למכל גז החנקן באמצעות צינור פלסטי גמיש ולהציב לתוך המקום המתאים בשלב מיקרוסקופ (התרשים 1C). בשלב זה הצינור וmicroincubator צריכים להיבדק בזהירות לכל דליפות על ידי הבטחת התקשרות בטוחה של הצנרת ושל תקעי היציאה בצד של החדר. אפשר אלכך התפשט בקלילות כמות קטנה של מי סבון על הצינורות לחפש בועות, שתהווינה אם דליפה היא הווה.

3. מיקרוסקופי באנוקסיה

  1. אתר חיות בהגדלה נמוכה, ולאחר מכן, להעביר להגדלה המתאימה הגבוהה יותר (64x עבור יישום זה) לרקמת תאי תמונה או עניין כגון לסטומרים או ביציות עובריות במבוגרים. הפעל את ליזר ננומטר 488 כדי להציג אות ה-GFP ולאתר חלבון היתוך GFP בתא (הים) של עניין.
  2. כדי להמחיש את המעצר בשלב מסוים של מחזור תא מעצר (prophase מאוחר למשל) לזהות blastomere בשלב מוקדם של חלוקת תא (לדוגמא interphase מאוחר או prophase מוקדם). סמנים סלולריים כמו עמדת centriole, ייזום של עיבוי כרומוזום, כרומוזום מיקום ונוכחות או עדר של מעטפת הגרעין יסייעו לזהות שלב מחזור תא (איור 2 א).
  3. אז הקאמרי הוא perfused עם גז חנקן (99.999%N 2; <2 עמודים לדקת פלט 2). במקרה זה אנו משתמשים בלחץ של 6 אטמוספרות, אולם לחץ ייתכן שיצטרך להיות מותאם ומותאם בהתאם לגודלו של כל microincubator וקוטר של צינורות בשימוש. המשך לעקוב אחר blastomere (הים) כחנקן ממלא את החדר, התאמת מטוס המוקד בהתאם לצורך.
  4. בנקודה זו, הדמית זמן לשגות החלה. הדמיה מבוצעת לכל זמן שיידרש כדי ללכוד תופעה של עניין, במקרה המעצר הזה prophase והעגינה של כרומוזומים לקרום הגרעין הפנימי. תמונות נלקחות פעם אחת בכל 10 שניות לא יותר מ 30 דקות. תדרים של לכידת תמונה והגדרות כגון רווח וכוח הליזר צריכים להיות מותאמים לפי צורך.
  5. הזמן שבו העוברים מגיבים לסביבת anoxic יכול להשתנות בהתאם לשלב מחזור התא בתגובה לחשיפת חמצן בדם. בדרך כלל מעצר prophase אנוקסיה מושרה מתרחש בתוך 20-30 דקות מתחילת זרימת גז חנקן. אנו צפינו occu עצירת מחזור התא אנוקסיה המושריתrring ב< 20 דקים '. תמונות ניתן לקבל במסגרת זמן זו, או תמונות מסוימות יכולות להיות מבודדות מאוחר יותר מסדרת הזמן לשגות. אפשרות נוספת היא להשתמש במיקרוסקופ וידאו לדמיין מבני משנה הסלולר בעוברים.
  6. כדי לתעד את ההתאוששות מהמדינה נעצרה אנוקסיה המושרית, מופעל הגז מול וקאמרי הוא יורשה לחזור לnormoxia ידי דיפוזיה עת הקלטת סדרת זמן לשגות. חידוש התקדמות מחזור התא וundocking של כרומוזומים מתרחש בדרך כלל בתוך 5-20 דקות של כיבוי גז החנקן.
  7. יש לציין כי בניסויים נפרדים מחוון חוסר חמצן, resazurin, הוצב בזרימה דרך microchamber; נקבע כי התא הופך anoxic בממוצע של כ 19 דקות לאחר שזרימת גז החנקן החלה.
  8. תמונות וקטעי וידאו מעובדים באמצעות Imaris, התמונה J או פוטושופ ויובאו לQuickTime לתצוגה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

עוברי ג elegans החשופים למחסור בחמצן קשה (אנוקסיה) מסוגלים לשרוד במעצר תהליכים ביולוגיים הכולל פיתוח וחלוקת תא 7. מעצר אנוקסיה המושרית של חלוקת תא יכול להיות במעקב, ברמת משנה הסלולר, באמצעות תא microincubation בשיתוף עם זרימת חנקן וגז באמצעות מיקרוסקופ confocal דיסק מסתובב כדי ליצור סביבה מבוקרת שבה ניתן הדמית חיות בחי (איור 1). מבנים תאיים של עניין ניתן לפקח בעובר נחשף לגז סביבות שונות, במקרה זה השתמשנו GFP-tagged טובולין גמא וH2B היסטון לפקח מבנה כרומוזום בעובר נחשף לחמצן בדם.

בתוך העובר נחשף לחוסר חמצן, את הכרומוזומים של לסטומרים prophase יצטמצמו וליישר עם פריפרית הגרעין הפנימית; תופעה המכונית "כרומוזום עגינה" (איור 2, סרט 1).עם התקדמות מחזור התא מחדש חמצון תתחדש וכרומוזומים של לסטומרים prophase יעברו מהפריפריה הגרעינית להתקדמות המשוונית הצלחת מצביעה לmetaphase (סרט 2). טכניקה זו יכולה גם שמשה כדי להמחיש מעצר בשלבים אחרים של חלוקת תא או כרומוזומים דו ערכיים של ביציות בהרמפרודיטים נחשפו לאנוקסיה 8.

איור 1
איור 1. דוגמה של מיקרוסקופ והתקנת תא המשמשת לניתוח בגוף חי. Zeiss התהפך confocal מיקרוסקופ עם ליידן הסגורה זלוף מכל גז חנקן מצורף () Microincubator ו; שלב מיקרוסקופ וmicroincubator (ב); ונוף מוגדל של microincubator (C).

איור 2
איור 2. Hallmark של prophase אנוקסיה המושרית נעצר blastomere. הראו הן תמונות מייצגות של blastomere prophase בתחילת זמן לשגות הדמיה () blastomere של עובר נחשף לnormoxia (B) או blastomere של עובר לאחר 30 דקות של חשיפת אנוקסיה (C). Prophase אנוקסיה המושרית נעצר כרומוזומים מציג blastomere עגנו ליד הפריפריה הגרעינית הפנימית וNEBD הוא נעצר. סרגל קנה מידה = 5 מיקרומטר.

סרט 1. ניתוח זמן לשגות של blastomere במעבר מnormoxia לחמצן בדם. שים לב כרומוזומים יישור לפריפריה הגרעינית. תמונות נתפסו 28 דקות לאחר זרימת גז דרך החל. לחץ כאן לצפייה בסרט.

סרט 2. ניתוח זמן לשגות של blastomere מתאושש מחמצן בדם. כמחזיר חמצן לקורות חי מחזור תא הסביבה. תמונות נתפסו 10 דקות לאחר זרימת גז דרך היה גהוקל. לחץ כאן לצפייה בסרט.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

מחסור בחמצן ואנימצית מושעה

למרות חשיפה למחסור בחמצן חמור יכולה להיות קטלנית לאורגניזמים מסוימים, כמה אורגניזמים מסוגלים לשרוד חשיפה לחמצן בדם. במקרה של ג elegans, הישרדות חשיפת אנוקסיה תלויה על במה ותגובה לאנוקסיה התפתחותית היא כניסה למצב של חיות מושהות הפיך שבו מספר התהליכים ביולוגיים נצפים הם נעצרו. חלוקת תאים, התפתחות, תנועה, אכילה ורביית תהליכים ייפסקו עד חמצן מחדש לסביבת 7,9. התקדמות במחזור תא, בעוברים שנחשפו-אנוקסיה, הפיך מעצרים בinterphase, prophase או metaphase מאוחר. השימוש בשיטות ביולוגיות כגון תאי immunostaining בדגימות קבועות ובמבחני vivo GFP היתוך חלבון, המאפשר הדמיה של מבנים ספציפיים משנה הסלולר בסביבת חמצן מקופח, היה גורם חשוב בזיהוי והאפיוןסימני היכר ייחודיים של חיות מושהות אנוקסיה מושרות בג elegans 8,10,11.

שני עוברים וביציות להציג מאפיינים מסומנים של חיות מושהות אנוקסיה מושרות שנראים בקלות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בשילוב עם חלבונים שכותרתו fluorescently או נוגדנים כנגד חלבונים ספציפיים לנתח עוברים קבועים. לסטומרים Interphase, של עוברים שנחשפו לחוסר חמצן, מאופיינים בהתעבות חלקית של הכרומטין ומעצר של התקדמות מחזור תא בכרומטין מסוים יישור בפריפריה הגרעינית 9. למרות התמוטטות מעטפת גרעין (NEBD) מסמל התחייבות סופית למיטוזה בחוסר חמצן, מעצר prophase מאופיין במעצרו של NEBD ויישור של כרומוזומים מלאי תמצית בפריפריה הגרעינית 10,12. מעצר Metaphase, לעומת זאת, מאופיין במעצרם של הכרומוזומים בצלחת metaphase וdepolymerization החלקי של microtubules, בין יתרדברים. עצירת מחזור תא anoxia מושרה בכל השלבים היא הפיכה ועל reoxygenation קורות חיים, תא מחזור התקדמות. בחשיפות anoxia של 24 שעות או פחות, בקרה וניסוי חיות הם נבדלים על התאוששות 7. שימוש בשיטות שתוארה כאן הם בעלי החיים מסוגלים לשרוד חשיפת חמצן בדם.

ניתוח הדמיה ושיקולים

השיטה שהוצגה כאן מנצלת TH32 (UNC-119 (ed3) ruIs32 III; ddIs6) הזן של ג elegans. מתח זה מבטא שני חלבונים שכותרתו fluorescently המאפשרים ההדמיה של centrosomes וכרומוזומים. Centrosomes מסומן על ידי ddIs6 [עוגה-1 :: TBG-1 :: GFP + UNC-119 (+)], אשר מקודד GFP-tagged טובולין גמא, וlocalizes לcentrosomes לאורך כל מחזור התא. המיקום של centrosomes מעיד על השלב של מחזור התא ומסייע בתזמון ניסויי אנוקסיה. הכרומוזומים מסומנים על ידי ruIs32 [UNC-119) + (עוגה-1 :: GFP :: H2B], מקודד חלבון ה-GFP שהכותרת היסטון והוא מונע על ידי אמרגן 5 ניבט קו מסוים. לפיכך, התנועה והלוקליזציה של כרומוזומים בתוך לסטומרים או ביציות יכולות להיות אחריו. בתוך עובר מתפתח, לפני המעצר אנוקסיה מושרה במחזור תא, blastomere, ובכך לגרעין, תוכל לעבור ממישור המוקד של מה שהופך את הצורך להתאים את מישור המוקד תוך הדמיה. אפשר לעקוב blastomere יותר מאחד או גרעין, אבל מיקוד ידני על האובייקט הסלולרי של עניין ייתכן שיצטרך לעשות כדי לייעל ויזואליזציה של המרכיבים התאיים המרובים של ריבית. הדבר עלול להגביל את היכולת למכן את התהליך אלא אם כן אחד לא משתמש בתוכנה כדי לעקוב אחר אזור מסוים ולעקוב אחריו. יש לנו לא ניסיתי להפוך את התהליך.

כדי לייעל את הפרוטוקול לבדיקה הספציפית של אדם אחד עשוי לשקול היבטים שונים של מיקרוסקופיה ורקע גנטי של עניין 13 (NPP-16 (ok1839)) תוך שימוש באותה טכניקה (אותו זמן למשל חשיפת אנוקסיה) כפקדים ומצא כי הפנוטיפ (במעצר חריג זה מקרה של לסטומרים prophase) ניתן ללכוד בתוך 30 דקות של חשיפה לאנוקסיה 10. עוברים יכולים לשרוד במשך שלושה ימים של חוסר חמצן באמצעות מתודולוגיות אחרות, יש לנו לא זוהו מוטציות שגורמים להתנגדות לחשיפת אנוקסיה (הישרדות הוארכה העבר 3 ימים של חשיפה) בעובר.

למטרות שלנו, אנחנו הדמית תהליך הסלולר מאוד דינמי, ומשתמשים במיקרוסקופ confocal דיסק מסתובב לרכישת תמונה מהירה. בהתאם לצורכים המיוחדים של ניסוי, זה יהיה צורך לקבוע האם סוג אחר של טכניקה מיקרוסקופית יכול להיות יותרppropriate.

בעת בחירה או לפתח זן מהונדס לשיטה זו, חשוב לשקול את הרגישות של מיקרוסקופ שישמש כמו גם הנטייה של photobleaching fluorophore המסוים. השימוש בזמן לשגות הדמיה בשיטה זו עשויה להוביל לתמונה משמעותית הלבנה בזנים שאינם חזק מבטאים חלבון פלואורסצנטי.

יש כמה אתגרים טכניים ומגבלות שיש לשקול בעת איסוף תמונות in vivo שימוש במתודולוגיה זו. בשל גודלו של החדר, ואת אופי הצריכה פוטנציאלית זמן על הניסויים, זה עלול להיות קשה לנתח מספר גדול של דגימות בכמות זמן קצרה. ניסויים הדורשים מדגמים גדולים לעתים קרובות ניתן לזווג עם שיטות אחרות של חשיפת אנוקסיה לייצר ערכות נתונים גדולות, וin vivo ההדמיה ניתן להשתמש כדי לתעד, לאמת או יותר לבדוק מקרוב הפנוטיפ של עניין. Additionally, אם הניסוי מחייב בדיקה בנקודתי זמן מסוימות במהלך חשיפה ארוכת טווח, בעיות עם התייבשות מדגם עלולות להתעורר. למרות היותו מכוסה בשמן halocarbon, בעלי חיים עלולים להתחיל לייבש עקב זרימת גז רציפה, ולכן מגביל את זמן הניסוי יכול להקל על בעיה זו. בנוסף, אפשר לשקול שימוש בגז התייבשות או קאמרית המאפשר בקרת לחות כדי להקל על בעיות יובש.

אחד יתרונות של שיטה זו הוא שניסויי חוסר חמצן הם גם אפשריים. כך, מחקרי מחסור בחמצן נוסף אפשר פשוט להשתמש במכל גז עם ריכוז חמצן שצוין (למשל 1% O 2 מאוזנים עם N 2) לבחון תגובות ליפוקסיה מאשר סביבה לחלוטין anoxic. בנוסף, עוד שינוי פשוט וגמיש הוא השימוש בגזים אחרים, כולל 2 רמות מעל 21% O, H 2 S או CO, אך הבטיחות של שימוש בגז מתערבב אלה היא majoשיקול r באמצעי זהירות נוסף יש לקחת 14.

משמעות של הטכניקה

אמנם יש לנו התוויתי בשיטה זו כדי לחשוף ג elegans לאנוקסיה ולדמיין היכר של חיות מושהות אנוקסיה מושרות בעובר באמצעות סמנים ספציפיים מאוד משנה הסלולר, נציג תוצאות אלו הם רק בדיקה אחת במגוון רחב של אפשרויות ניסוי באמצעות המערכת הקאמרית אנו מתארים כאן. מחסור בחמצן הוכח להשפיע מספר התהליכים תאיים במגוון רחב של אורגניזמים, ותוך ניצול טכניקה זו, השפעות ספציפיות של חוסר חמצן, היפוקסיה, ומגוון רחב של סביבות אחרות יכולות להיות חזותיות ונלכד בגוף חי. לדוגמה, באמצעות ג elegans מערכת זו יכולה לשמש לניתוח פנוטיפים אחרים הנגרמים על ידי מחסור בחמצן, כפי שהותר לשימוש בtricaine / tetramizole ההרדמה (כלומר בלוע השאיבה וreproductivדואר תהליכים).

היישום של מתודולוגיה זו אינו מוגבל לג elegans. זרימת גז זה באמצעות התקנה קאמרית מספקת שיטה פשוטה לחשיפת תאים ואורגניזמים שלמים לריכוזים נמוכים של חמצן ובמקביל לכידת שינויים תאיים ולדמיין פעילות של fusions החלבון פלואורסצנטי. לדוגמה, בשיטה זו היא בקלות להתאמה לשמרים, תרבית תאים או חסר חוליות קטנות או עוברי החולייתנים שגדלים הם לא גדולים מדי לחדר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

Acknowledgments

ברצוננו להביע את הערכתנו לקלט והערות מחברי מעבדת הפדייה. זנים נמטודות בעבודה זו נמסרו על ידי גנטיקת Caenorhabditis המרכז, אשר ממומן על ידי NIH המרכז הלאומי למשאבי מחקר (NCRR). אנו מכירים בכך ומודים לד"ר לון טרנבול לסיוע טכני במיקרוסקופיה confocal. עבודה זו נתמכה על ידי מענק מהקרן הלאומי למדע (NSF-IOS, קריירה) לPAP

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents/Equipment Composition
Hypochlorite solution 0.7 g KOH, 12 ml 5% NaOCl, bring to 50 ml with ddH20
M9 buffer 3 g KH2PO4, 11 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml (1 M) MgSO4 per 1 L ddH2O
Glass microscope slides Fisher Scientific 12-550-343 3"x1"x1.0 mm
Round micro coverglass Electron Microscopy Sciences 72223-01 25 mm Diameter
Halocarbon oil 700 Sigma H8898-100ml
Anesthetic 0.5% tricaine, 0.05% tetramisole
Leiden Closed Perfusion Microincubator Harvard Apparatus 650041
UHP Nitrogen Calgaz (Air Liquide) >99.9990% N2 <2 ppm O2
Plastic tubing VWR 89068-468 0.062" ID x 0.125" OD
Spinning Disk Confocal Microscope McBain Systems Zeiss inverted optical microscope, epifluorescence illumination system, CSU-10 Yokogawa confocal scanner, Hamamatsu electron multiplier CCD camera.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Powell-Coffman, J. A. Hypoxia signaling and resistance in C. elegans. Trends Endocrinol. Metab. 21, (10), 435-440 (2010).
  2. Padilla, P. A., Ladage, M. L. Suspended animation, diapause and quiescence: Arresting the cell cycle in C. elegans. Cell Cycle. 11, (2012).
  3. Hu, P. J. Dauer. WormBook. 1-19 (2007).
  4. Zhou, K. I., Pincus, Z., Slack, F. J. Longevity and stress in Caenorhabditis elegans. Aging (Albany NY). 3, 733-753 (2011).
  5. Schmidt, D. J., Rose, D. J., Saxton, W. M., Strome, S. Functional analysis of cytoplasmic dynein heavy chain in Caenorhabditis elegans with fast-acting temperature-sensitive mutations. Mol. Biol. Cell. 16, 1200-1212 (2005).
  6. Sulston, J., Hodgkin, J. The Nematode Caenorhabditis elegans. Wood, W. B. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 587-606 (1988).
  7. Padilla, P. A., Nystul, T. G., Zager, R. A., Johnson, A. C., Roth, M. B. Dephosphorylation of Cell Cycle-regulated Proteins Correlates with Anoxia-induced Suspended Animation in Caenorhabditis elegans. Mol. Biol Cell. 13, 1473-1483 (2002).
  8. Hajeri, V. A., Trejo, J., Padilla, P. A. Characterization of sub-nuclear changes in Caenorhabditis elegans embryos exposed to brief, intermediate and long-term anoxia to analyze anoxia-induced cell cycle arrest. BMC Cell Biol. 6, 1471-2121 (2005).
  9. Padilla, P. A., Goy, J. M., Hajeri, Anoxia. Padilla, P. A. InTech. (2012).
  10. Hajeri, V. A., Little, B. A., Ladage, M. L., Padilla, P. A. NPP-16/Nup50 function and CDK-1 inactivation are associated with anoxia-induced prophase arrest in Caenorhabditis elegans. Mol. Biol. Cell. 21, 712-724 (2010).
  11. Nystul, T. G., Goldmark, J. P., Padilla, P. A., Roth, M. B. Suspended animation in C. elegans requires the spindle checkpoint. Science. 302, 1038-1041 (2003).
  12. Margalit, A., Vlcek, S., Gruenbaum, Y., Foisner, R. Breaking and making of the nuclear envelope. J. Cell Biochem. 95, 454-465 (2005).
  13. Maddox, A. S., Maddox, P. S. High-resolution imaging of cellular processes in Caenorhabditis elegans. Methods Cell Biol. 107, 1-34 (2012).
  14. Miller, D. L., Roth, M. B. C. elegans are protected from lethal hypoxia by an embryonic diapause. Curr. Biol. 19, 1233-1237 (2009).
השתמש של מיקרוסקופיה מעבר זמן לדמיין אנימצית מושעה anoxia מושרה ב<em&gt; ג elegans</em&gt; עוברים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Garcia, A. M., Ladage, M. L., Padilla, P. A. Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos. J. Vis. Exp. (70), e4319, doi:10.3791/4319 (2012).More

Garcia, A. M., Ladage, M. L., Padilla, P. A. Use of Time Lapse Microscopy to Visualize Anoxia-induced Suspended Animation in C. elegans Embryos. J. Vis. Exp. (70), e4319, doi:10.3791/4319 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter