Summary
Das heterologe Biosynthese von Erythromycin A durch
Abstract
Die heterologe Produktion von komplexen Naturstoffen ist ein Ansatz entwickelt, um die jeweiligen Einschränkungen und zukünftigen Möglichkeiten anzugehen. Es ist besonders nützlich für solche Verbindungen, welche therapeutischen Wert besitzen, kann aber nicht ausreichend hergestellt waren oder aus einer verbesserten Form der Produktion profitieren. , 2) heterologe Rekonstitution; und 3) Produkt-Analyse 1) Gentransfer: Die experimentellen Verfahren beteiligt kann in drei Komponenten unterteilt werden. Jede experimentelle Komponente ist unter ständige Optimierung, um die Herausforderungen zu meistern und antizipieren die Chancen, die mit diesem neuen Ansatz verbunden.
Heterologen Biosynthese beginnt mit der Identifikation einer genetischen Sequenz, die für wertvolle Naturprodukt. Übertragen dieser Sequenz mit einer heterologen Host wird durch den Biosyntheseweg Komplexität verantwortlich für die Produktentwicklung Bildung kompliziert. Das Antibiotikum Erythromycin A ist ein gutes Beispiel. Zwanzig Gene (in Höhe von> 50 kb) sind für eventuelle Biosynthese erforderlich. Zusätzlich codieren drei dieser Gene Megasynthasen, Multi-Domain Enzyme jeweils ~ 300 kDa groß. Dieses genetische Material müssen so ausgelegt und übertragen werden E. coli für rekonstituierte Biosynthese. Die Verwendung der PCR Isolierung, Konstruktion Operon, Multi-cystronic Plasmiden und elektrooptischen Umwandlung wird bei der Übertragung der Erythromycin A bis E. genetischen Cluster beschrieben coli.
Einmal übertragen, das E. coli Zelle muss unterstützt eventuelle Biosynthese. Dieser Prozess wird auch gegen die wesentlichen Unterschiede zwischen E. gegeben coli und originellsten Hosts verantwortlich komplexen Naturstoff Bildung. Die Zelle muss erforderlichen Substrate, um die Biosynthese unterstützen und koordinativ Ausdruck der übertragenen genetischen Cluster aktive Enzyme zu produzieren. Im Fall von Erythromycin A, das E. coli-Zelle musste entwickelt, um die beiden Vorstufen (pr liefernopionyl-CoA und (2S)-Methylmalonyl-CoA) für die Biosynthese erforderlich. Zusätzlich wurden Gensequenz Modifikationen Plasmidkopienzahl, Chaperonin Koexpression, posttranslationale enzymatische Modifikation und Prozesstemperatur auch erforderlich, damit endgültige Erythromycin A Formation.
Schließlich muss eine erfolgreiche Produktion beurteilt werden. Für die Erythromycin Ein Fall, präsentieren wir zwei Methoden. Die erste ist Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS), um zu bestätigen und zu quantifizieren Produktion. Die Bioaktivität von Erythromycin A wird auch durch die Verwendung eines Bioassays, in dem der antibiotische Aktivität gegen Bacillus subtilis getestet wird bestätigt werden. Die Bewertungskriterien Assays etablieren Erythromycin A-Biosynthese aus E. coli und die Bühne für die zukünftige technische Anstrengungen zur Verbesserung oder Diversifizierung der Produktion und für die Herstellung neuer, komplexer Naturstoffe mit diesem Ansatz.
Introduction
Erythromycin A ist ein Antibiotikum Polyketid durch die Gram-positive Bodenbakterium Saccharopolyspora erythraea produziert und die laufende Produktion wurde schrittweise auf ~ 10 g / L durch jahrzehntelange traditionellen Mutagenese und Screening-Protokolle und neuerdings durch Prozessoptimierung Systeme 1-6 verbessert. Mutagenese und Screening-Strategien sind in antibiotischen Naturstoffen Produktentwicklung gemeinsame als Folge der Schwierigkeiten bei der Kultivierung und / oder genetisch manipuliert einheimische Produktion Hosts und wegen der leicht verfügbar antibiotische Aktivität oder verbesserte Wachstumsphänotypen zur Auswahl zu helfen. Im Fall von Erythromycin A, S. erythraea wird durch ein langsames Wachstum Profil und das Fehlen von mehr direkte genetische Manipulationsverfahren (bezogen auf Organismen wie E. coli) begrenzt somit behindern rasche Verbesserung der Produktionseffizienz und der Biosynthese von neuen Derivaten. Nachdem erkannte die Fragen der Produktion und entriegelt diversificatiüber die Möglichkeiten mit Verbindungen wie Erythromycin A, begann die Forschung, um die Idee von heterologen Biosynthese (Abbildung 1) 7 verfolgen. Diese Bemühungen fiel mit verfügbaren Sequenz für das Erythromycin A-Gencluster 8-11. Es sollte betont werden, dass die Zahl der sequenzierten komplexen Naturstoff Gencluster hat stark 12-16 erweitert werden und bietet den Anstoß für weitere Anstrengungen in heterologen Biosynthese kodiert medizinisches Potenzial zugreifen. Um dies zu tun, erfordert heterologen Rekonstitution, dass die neuen Host die Bedürfnisse der spezifischen Biosyntheseweg zu erfüllen. E. coli bietet technischen Komfort, eine breite umspannenden Reihe von Techniken der Molekularbiologie und Stoffwechsel-und Prozess-Engineering-Strategien für die Produktentwicklung. Doch wenn die einheimische Produktion Gastgeber, E. Vergleich coli zeigt nicht das gleiche Maß an komplexen Naturstoff Produktion. Es war daher nicht bekannt, ob E. coli konnte als eine tragfähige heterologen Option für komplexe Naturstoff-Biosynthese dienen. Es wurde jedoch angenommen, dass E. coli wäre eine ideale Wirtsorganismus sein, wenn heterologe Biosynthese erreicht werden könnte.
Mit diesem Ziel im Hinterkopf, begann anfänglichen Bemühungen um die Polyketid-Aglykon 6-Desoxyerythronolid B (6dEB) durch E. produzieren coli. Allerdings, native E. coli Stoffwechsel konnten keine nennenswerte Ebenen der Propionyl-CoA und (2S)-Methylmalonyl-CoA benötigt, um Vorstufen 6dEB Biosynthese unterstützt noch konnte der neue Host posttranslational modifizieren Desoxyerythronolid-B-Synthase (DEBS) Enzyme. Um diese Probleme zu beheben, wurde ein Stoffwechselweg von nativen und heterologen Enzymen bestehen, in E. gebaut coli, so dass exogen zugeführten propionat intrazellulär wurde zu Propionyl-CoA überführt und anschließend (2S)-Methylmalonyl-CoA; im Engineering, um dieses Weges zu vervollständigen, wurde ein Gen in sfp th platzierte Chromosom von E. coli BL21 (DE3), um einen neuen Stamm zu produzieren genannt BAP1. Die Sfp Enzym ist ein Phosphopantetheinyl Transferase Lage der Befestigung der 4'-Phosphopantethein Cofaktor den DEBS Enzyme 17,18. Die drei DEBS Gene (jeweils ~ 10 kb) wurden dann auf zwei separat wählbar Expressionsvektoren, induzierbare T7 Promotoren gestellt. Nach einer Einstellung des Schlüssels nach Induktion Temperatur (bis 22 ° C) wurden die DEBS Gene koordinativ innerhalb BAP1 in einem aktiven Zustand erzeugen kann 6dEB 19 exprimiert.
Das Streben nach voller Erythromycin A-Biosynthese begann dann mit einem analogen Gencluster aus Micromonospora megalomicea oder ein hybrides Weg der Gene von S. zusammen erythraea, S. fradiae und S. venezuelae die Zwischenprodukte Erythromycin C und 6-deoxyerythromycin D, jeweils 20-22 produziert. Kürzlich hat unsere Fraktion diese Bemühungen durch die Herstellung erythrom verlängertycin A (die meisten klinisch relevanten Form von Erythromycin) durch E. coli. Im Gegensatz zu früheren Arbeiten, unsere Strategie koordiniert äußerte die 20 original S. erythraea Gene für Polyketidbiosynthese, Desoxyzucker-Biosynthese und Befestigung, zusätzliche Anpassung und Selbst-Widerstand (Abbildung 2) benötigt. Insgesamt wurden 26 (native und heterolog) Gene entwickelt, damit E. coli zu Erythromycin A mit 4 mg / l 23,24 erzeugen. Dieses Ergebnis gegründet komplette Produktion eines komplexen Polyketid natürliches Produkt mit E. coli und dient als Grundlage zu nutzen, diese neue Produktion Option oder verfolgen neue.
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Protocol
Der Text ist spezifisch für das Antibiotikum Erythromycin A, aber die Schritte ausgebildet sind allgemein anwendbar auf andere natürliche Produkte als Kandidaten für heterologe Biosynthese.
Ein. Erythromycin A Genetic Cluster Übertragung
- PCR-Primer-Design zu amplifizieren alle Gene mit dem Erythromycin A Cluster innerhalb des zugeordneten S. erythraea Chromosom. Dieser Schritt ist speziell auf diese Naturprodukt Kandidaten, deren genetische Sequenzen bestimmt wurden. Alternativ können die gewünschten Gene synthetisiert (durch mehrere kommerzielle Herstelleroptionen) mit dem Vorteil, dass die neu synthetisierte Gene für optimalen Codonverwendung würde innerhalb der neuen E. ausgebildet sein -coli-Wirt. Wenn die DNA-Synthese verfolgt wird, wird ein Strom Herausforderung Erzeugen megasynthase Gene, die 10 kb in der Länge überschreiten darf. Technisch kann Synthese bewerkstelligt werden, aber es ist schwierig und kostspielig. Es wird erwartet, dass kontinuierliche improvemEltern in Gensynthese-Technologie wird sich aktuellen Nachteile und weiter zu validieren diesen Ansatz für die Bereitstellung von heterologen genetischen Materials.
- Führen Sie die PCR mit frisch zubereiteten S. erythraea genomische DNA als Matrize. Die chromosomale DNA kann aus Kulturen von S. hergestellt werden erythraea oder aus gefrorenen Beständen des Bakteriums (Abbildung 3) 25. PCR-Reaktionen können von der Zugabe von DMSO (4 pl in 50 ul Reaktionen) zur Berücksichtigung hohen G+ C-Gehalt im Target profitieren S. erythraea Gene. Jede amplifizierte Gen sollte sequenziert, um zu bestätigen, dass die vollständige Gen abgerufen wurde und dass keine Mutationen in den PCR-Prozess eingeführt werden.
- Durch Restriktionsverdau und Ligation, legen jedes der isolierten Gene in Expressionsvektoren für E. konzipiert coli (Abbildung 3). Dies wird durch die Gestaltung Restriktionsstellen innerhalb der PCR-Primer, um die Verdauung und Ligation in geeignete Ex erlauben initiiertpression Vektoren (ein Beispiel ist in Abbildung 3 wurde im Lieferumfang enthalten). Wir haben sowohl pET21 und pET28 Vektoren verwendet. Die pET28 Vektor erlaubt die Einbeziehung eines 5'-Leader-Sequenz, die Genexpression in dem Fall Erythromycin A unterstützt. Bestätigen einzelnen Genexpression durch RT-PCR, SDS-PAGE-Analyse (unter Verwendung von löslichen Proteinfraktionen) oder bequemer phänotypischen Assays (Abbildung 4).
- Konstruieren Operons auf Gene erfolgreich von einzelnen Expressionsplasmide (Abbildung 3) ausgedrückt. Wir haben traditionell Kombinationen kompatible kohäsive-Restriktionsenzymen (z. B. Xba I und Spe I) 24 verwendet, um sequentiell umzuwandeln Gene Operons, jedoch werden die Restriktionsschnittstellen für Operon Konstruktion gewählt darf innerhalb befinden (oder müssen aus entfernt werden) das isolierte Gensequenzen (ein Problem, das vermieden werden, wenn Gen-Synthese verwendet werden kann). Dieser Schritt festigt die 20 Erythromycin A Gene vor der E. coli traformationen. Derzeit haben wir diese Methode verwendet, um bis zu 20 kb fremder DNA in einem Standard-pET-Vektor (zwei Gene von ~ 10 kb jeweils). Darüber hinaus haben wir diesen Ansatz verwendet, um Operons enthält neun Gene zu erzeugen. Es ist nicht bekannt, wie viel oder wie viele DNA Gene können in pET-Typ Plasmide zu integrieren, wobei jedoch die oben genannten Metriken eine Referenz für komplizierte Systeme wie das Erythromycin Biosyntheseweg bereitzustellen. Schließlich Standard-in vitro-Ligation Schritte und anschließende erfolgreiche Transformation Schritte zunehmend schwieriger als Operon und Plasmid Größe zunimmt. Ligation Temperatur (12-22 ° C) und die Zeit (3-24 Stunden) sind vielfältig und elektro-Transformation wird verwendet, um den Prozess der Herstellung der fertigen Plasmidkonstrukte unterstützen.
- Verwandeln Sie die neu gestaltete biosynthetischen Plasmide in E. coli-Stamm BAP1 mit elektro-Transformation (Abbildung 5). Das Verfahren kann mit Plasmiden eingeführt versucht werden entweder nacheinander oder in Zusammenarbeitmbination. Bei der Umwandlung size-Lage oder zahlreiche Plasmide, haben wir traditionell elektro-Transformation (im Gegensatz zu chemischen Umwandlung Gegensatz) verwendet. Sobald transformiert, Platte die Zellen auf festem LB-Medium mit Tetrazyklin (5 mg / l), Carbenicillin (100 mg / l), Kanamycin (50 mg / l), Streptomycin (50 mg / l) und Apramycin (50 mg / l ) für Plasmids wählen. Es ist höchst ungewöhnlich, dass sechs verschiedene Selektionsantibiotika post-Transformation eines E. verwenden coli-Zelle, aber dies einfach gibt die Gesamtzahl von Plasmiden erforderlich, damit endgültige Erythromycin A-Biosynthese. Während möglich ist, wird der Ansatz begrenzen die Produktionsmöglichkeiten der Verbindung einmal Kultivierung begonnen hat (siehe unten).
2. E. coli Biosynthetische Rekonstitution
- Belastung BAP1 wurde entwickelt, um die erforderlichen Substrate für die Biosynthese geben und posttranslational modifizieren Desoxyerythronolid B megasynthase. Einzelne Gene des Erythromycin Ein Weg haben für die Genexpression getestet und konsolidiert Operons in Expressionsplasmide. Dieser Abschnitt ist Kulturbedingungen für konzertierte Aktionen der vollen Erythromycin Ein Weg testen gewidmet.
- Take 3 separaten Kolonien des frisch transformierten BAP1 und 1,5 ml LB beimpft Kulturen, das die erforderlichen Antibiotika Plasmidselektion (bei den gleichen oben angegebenen Konzentrationen, um auf Transformanten auf festem Medium auszuwählen), Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG; 100 uM ) und Arabinose (2 mg / ml), um die Genexpression und 20 mM Natriumpropionat um intrazelluläre Biosynthesevorstufe Bildung unterstützt induzieren. Sobald die Produktion bestätigt wurde, können größere Kulturen in einem Versuch zu skalieren und zu maximieren Produkt Titer durchgeführt werden.
- Kultur der Zellen bei 22 ° C und 250 rpm für 24-48 Std. In diesem Fall sorgt Antibiotikaselektion dass die erforderlichen Plasmide in den frühen Stadien der Zellkultur gehalten werden. Jedoch Plasmidss kann leicht verloren werden Selektionsantibiotikum Ebenen im Laufe der Anzucht ändern. Dies kann zu Plasmidinstabilität (dh, der Verlust von einem oder mehreren Plasmiden während der Kultivierung), die dann begrenzen würde Produktionskapazität führen. Das Problem wird verschlimmert, wenn inkompatible Plasmide verwendet werden, um eine vollständige heterologe Gencluster einzuführen. Dies ist der Fall für die Erythromycin A Verbindung (Abbildung 5) und müssten beseitigt werden, um wirklich Überproduktion der Verbindung aus E. coli. Für die Zwecke der Demonstration anfänglichen Produktion werden solche Konstruktionsfehler Gründen der zügig Gründung der Durchführbarkeit des heterologen Ansatz toleriert.
- Klärung der Kulturen durch Zentrifugation bei 10.000 rpm in einer Eppendorf-Mikrozentrifuge. Entfernen Sie den Überstand und bei 4 ° C für die Analyse.
- Im Fall von Erythromycin A, fehlende Verbindung Produktion wurde durch den Einschluss des GroES / EL Chaperonin (unter Verwendung pGro7 gerichtetspeziell ansprechen mangelnde Aktivität der Enzyme post-Expression) und die Aufnahme zusätzlicher Genkopien (für jene Gene schwache Expression / Aktivität vermutet). Ähnliche Strategien können mit anderen heterologen Naturprodukt Produktion Anstrengungen erforderlich werden.
3. Product Analysis
- Um zu bestätigen und zu quantifizieren Erythromycin A Formation, Injektion des Kulturüberstandes auf einem LC-MS-Systems (Abb. 6). Kommerziell erhältliche Erythromycin A wurde verwendet, um die Produktion zu bestätigen und als ein Standard bei der Quantifizierung. Für die Fälle, ohne kommerziell verfügbaren Standards würde LC-MS-Analyse erfordern zusätzliche chemische Charakterisierung durch NMR-und hochauflösender Massenspektrometrie.
- Vergleichen Produktion zwischen den 3 Kolonien / Kulturen aus dem BAP1 Transformation. Wählen Sie die höchste Produzent und bereiten eine Glycerin Lager aus der Kolonie Quelle. Dieser Schritt kann gleichzeitig mit den Produktionskulturen Abschnitt des Protokolls erfolgen2 durch Verwendung eines kleinen Teils der Kulturen, um Glycerinstammkulturen vorzubereiten. Bewahren Sie das Glycerin Lager in einem -80 ° C Gefrierschrank.
- Mit der Bestätigung höchsten produzierenden Zelle Lager, beginnt eine getrennte Produktion Kultur und extrahieren die endgültige Überstand mit 2x Volumen Ethylacetat. Verwenden Sie einen Staubsauger Verdunstungskontrollsystem um den Extrakt trocknen und resuspendieren in 100 ul Methanol. Übertragen des Extrakts auf einen Sterilfilter Scheibe (~ 1/4 Zoll Durchmesser) und damit die Scheibe zu trocknen. Separat, Kultur B. subtillis in LB Flüssigkeit über Nacht. Fügen Sie 20 ul der B. subtilis Kultur zu je 20 ml LB-Agar bei 45 ° C. Platte der Agar und lassen sich zu verfestigen. Setzen Sie den Filter Scheibe auf der Platte und bei 37 ° C (Abbildung 7). Alternativ kann der Extrakt die Flüssigkulturen in einer 96-Well-Platte zugesetzt werden, um die Aktivität unter Verwendung eines Plattenlesegeräts (Abbildung 7) zu quantifizieren.
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Representative Results
Das gewünschte Ergebnis dieses Ansatzes ist die Produktion eines vollständig bioaktiven Naturprodukt aus dem E. coli heterologe Wirt. Dies wird am besten durch die LC-MS-Ergebnisse verwendet, um zu bestätigen und zu quantifizieren Produktion (Abbildung 6) und die antibakterielle Bioassay zur endgültigen Aktivität zu bestätigen (Abbildung 7) dargestellt. In die allgemeine Systematik der heterologen Biosynthese, legt dieses Ergebnis Erfolg. Einmal erreicht, Forschungsanstrengungen dann Optimierung (sowohl auf zellulärer und Verfahren Skalen) und molekularen Engineering einzuschalten. Die endgültigen Ziele sind wirtschaftliche Produktionsprozesse für die ursprüngliche Verbindung und Kontrolle über die heterologen System, so dass rationale Änderungen an den Verfahren hergestellt werden, um Varianten der ursprünglichen Verbindung mit dem Potenzial für eine erhöhte oder verbreitert Wirkungsspektrum zu produzieren.
Failure, um die gewünschte Verbindung herzustellen löst dann zahlreiche Notfallpläne to beurteilen, welche Teil der Ansatz verbietet erfolgreichen Biosynthese. Viele dieser Trouble-Shooting-Mechanismen innerhalb des oben beschriebenen Verfahrens in-gebaut. Nach unserer Erfahrung ist es wichtig, auf ein Minimum, um erfolgreiche Genexpression (SDS-PAGE-Analyse der löslichen Biosyntheseenzyme) des neu eingeführten Gen-Cluster, bevor versucht wird, um die Biosynthese des gebildeten natürliches Produkt Beurteilung bestätigen. Post Expression, wie oben angegeben, haben die Verwendung von Proteinfaltung Chaperonen verbesserte Genkopienzahl und Prozesstemperatur wirksam mittels wodurch eventuelle Biosynthese.
Abbildung 1. Eine umfassende Darstellung der heterologen Naturprodukt Biosyntheseschema mit der Erythromycin A Verbindung. Die experimentellen Schritte umfassen: 1) Design und Übertragung der Erythromycin Gencluster from S. erythraea zu E. coli, 2) Rekonstitution der Biosynthese in E. coli und 3) Produkt-Analyse von Erythromycin A.
Abbildung 2. Erythromycin A. Das Gencluster wie in der nativen S. organisiert erythraea Chromosom. B. Erythromycin A-Biosynthese. Innerhalb E. coli wird die Sfp Enzym für posttranslationale Modifikation des DEBS1, 2, und 3 Polyketidsynthase Enzyme (je> 300 kDa) erforderlich, was durch den Verbindungsarm mit jedem ACP-Domäne assoziiert bezeichnet. Die DEBS Enzyme bilden ein α 2 β 2 γ 2-Komplex in Moduleinheiten unterteilt, die die aufeinander folgenden Kondensationen eines Starters Propionyl-CoA-Einheit und sechs (2 S)-Methylmalonyl-katalysierenCoA Verlängerungseinheiten zu bilden das Polyketid 6-Desoxyerythronolid-B (6dEB). KS-Ketosynthase; AT-Acyltransferase; AKP-Acyl-Carrier-Protein; KR-Ketoreduktase (mit dem inaktiven KR notierte in Modul 3); DH-Dehydratase; ER-Enoylreduktase; TE-Thioesterase. Ein PrpE (Propionyl-CoA Synthetase) und PCC (Propionyl-CoA Carboxylase, aus zwei Untereinheiten zusammengesetzt Protein) sind erforderlich, um exogene Propionat zur Ausgangssubstrate Propionyl-CoA und (2 S)-Methylmalonyl-CoA zu konvertieren. Die Gene für Sfp und PrpE wurden bisher innerhalb der BAP1 E. entwickelt coli Chromosom 19. Umbau des 6dEB Molekül Erythromycin wird durch die Desoxyzucker-Biosynthese und Befestigung, zusätzliche Anpassung und Selbst-Resistenz-Enzyme durchgeführt. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .
Abbildung 3. A. Isolierung einzelner Gene für Erythromycin A-Biosynthese (ohne die drei DEBS Gene) erforderlich. Individuelle Plasmid-Konstruktion einschließlich der PCR Oligonukleotidprimer zur Isolierung eryCI verwendet; Primer Restriktionsstellen sind fett dargestellt und komplementäre Sequenz angedeutet wurde unterstrichen. Ebenfalls enthalten ist die Restriktionsanalyse der resultierenden pET21 und pET28 Vektoren, die einzelnen Gene und Operons. B. i. Konsolidierung der Biosynthesegene für Polyketid Schneiderkunst als Operons zur Einführung in E. nötig .. coli II Restriktionsschnittstelle und anderen Ausdruck Elemente mit Operon Konstruktion und Ausführung beteiligt sind; X / S stellt die kompatiblen kohäsiven Ligation Xba I und Spe I-Stellen, die in einer neuen Sequenz unerkannte ergibt entweder restrictiam Enzym. Klicken Sie hier, um Abbildung 3 zu sehen .
Abbildung 4. A. SDS-PAGE-Analyse der einzelnen Gene in Abbildung 3 dargestellt. Die Sternchen bezeichnen diejenigen Gene mit 5'-Leader-Sequenzen, die aus der pET28 Expressionsvektor exprimiert. B. Bewertung der phänotypischen ermE (Erythromycin A-Resistenz). Erythromycin A in der festen Medium verwendet, um E. testen coli-Stämme, die Plasmide mit oder ohne den ermE Erythromycin A-Resistenzgen. Das Zellwachstum wird mit mit ermE Ausdruck gerettet.
Abbildung 5. A. Schematische Darstellung des vollständigen Erythromycin Ein Weg eingeführt, um E. coli, einschließlich eines Plasmides zur GroEL / ES Chaperonin (pGro7) und einem Plasmid, enthaltend eine zusätzliche Kopie des eryK. B. Transformation Vergleich zwischen chemischen und elektromechanischen Methoden unter Verwendung sowohl Kombination (i) und sequentiellen (ii) Einführung der Plasmide. C. Plasmid Stabilität der transformierten Stamm. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .
Abbildung 6. Ein Standard-LC-MS Spur von Erythromycin A hergestellt aus E. coli.
Abbildung 7. A. Festphasen Bioassay Filterscheiben mit i. Von einer induzierten BAP1 E. extrahieren coli Negativkontrolle; ii handelsüblichen Erythromycin A (positive Kontrolle);.. und iii Erythromycin A aus einer induzierten E. BAP1 extrahierten coli-System. Die Scheiben wurden auf einem Rasen ausplattiert von B. subtilis Bakterien und resultierende Hemmzonen antibiotische Aktivität geben. B. Assay nachgewiesen in flüssiger Phase unter Verwendung von 96-Well-Platte Zeitverlauf Proben. Hier eine größere Zahl anzuzeigen .
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Discussion
2) biosynthetischen Rekonstitution; und 3) Produkt-Analyse 1) Gentransfer: Critical Schritte in heterologen Biosynthese sind an jedem der drei Verfahrenssprachen Punkten im Prozess auftreten. Ein Problem in jedem Stadium wird entgleisen das ultimative Ziel der Schaffung heterologen Biosynthese. Vielleicht das schwierigste Aspekt des Verfahrens wird zur Festlegung rekonstituierten Biosynthese, da dies absolut notwendig ist, um erfolgreiche Analyse zu ermöglichen. Jedoch ist die Rekonstitution abhängig sorgfältige Planung und Übertragung des genetischen Materials verantwortlich für eventuelle Biosynthese. Ebenso hergestellt ist, können empfindliche analytische Methoden (wie LC-MS) detektieren kleinen Titers Ebenen, die andernfalls als mangelnde Produktion interpretiert werden kann. Es ist der Höhepunkt dieser Situationen, die heterologe Biosynthese Herausforderung macht.
Mit Hinsicht auf die Erythromycin A wurden beispielsweise bestätigt Gensequenzen mittels PCR isoliert individuell für exp getestetloss vor Konsolidierung die Gene für koordinierte Expression und natürliches Produkt Formation. Während der anfänglichen Versuche Produktanalyse wurden Intermediatverbindungen ersten identifizierten nur wenn ein Chaperonin (GroEL / ES) wurden mit der erforderlichen Gencluster coexprimiert. Das Endprodukt wurde nur produziert, wenn eine zusätzliche Kopie des Gens verantwortlich für den letzten Schritt in der Biosynthese (eryK) aufgenommen wurde. Beide Maßnahmen von der empfindlichen LC-MS verwendeten analytischen Methode, um zunächst zu beurteilen Produktion profitiert.
Nun, da die Produktion wurde bestätigt, wird das E. coli zellulären Hintergrund bietet zahlreiche technische Möglichkeiten. Von denen die erste ist, die Produktion des nativen Erythromycin A Verbindung zu optimieren. Dies würde eine Alternative bieten die Produktion Route mit potenziellen Einsparungen im Prozess Zeit und Kosten. Weiterhin das Erythromycin A Stoffwechselweg können zum Zweck der Diversifizierung Produktbildung manipuliert werden. New Analoga bieten diePotential neuer Antibiotika (oder andere therapeutische) Aktivität. Die gleichen Möglichkeiten bestehen für allgemeine Anwendungen von heterologen Biosynthese und stellen die primäre Motivation für den Ansatz, durch die Herausforderungen mit vielen originalen produzierenden Organismen angetroffen unterstützt. Kontinuierliche Anwendungen und Verbesserungen der Ansatz in diesem Artikel beschrieben wird erhöhen die Häufigkeit der künftigen heterologen Biosynthese Erfolg.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Die Autoren danken den NIH (AI074224 und GM085323) und NSF (0.712.019 und 0.924.699) für die Finanzierung von Projekten gewidmet heterologen Biosynthese zu unterstützen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PCR machine | Eppendorf | Mastercycler personal | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher | BP231 | |
| Electroporator | BioRad | Micropulser | |
| IPTG | Fisher | BP1620 | |
| Sodium propionate | Sigma | P1880 | |
| L-arabinose | Sigma | A3256 | |
| Refrigerated Shaker | Thermo Scientific | MaxQ 4000 | |
| Microfuge | Eppendorf | Centrifuge 5415D | |
| pGro7 | Takara | Chaperone Plasmid Set (3340) | |
| pET21, pET28, pCDF-Duet-1 | EMD Chemicals | 69742-3, 69864, 71340 | |
| LC-MS | Applied Biosystems | 3200 Q-Trap | |
| Ethyl acetate | Sigma | 270989 | |
| Methanol | Sigma | 322415 | |
| Vacuum centrifuge | Eppendorf | Concentrator 5301 | |
| Rotary Evaporator | Buchi | R-200 |
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