Summary
इरिथ्रोमाइसिन एक heterologous के माध्यम से biosynthesis
Introduction
इरीथ्रोमाइसीन एक एक polyketide ग्राम पॉजिटिव मिट्टी के जीवाणु Saccharopolyspora erythraea द्वारा उत्पादित एंटीबायोटिक है, और वर्तमान उत्पादन संवर्द्धित पारंपरिक mutagenesis और स्क्रीनिंग प्रोटोकॉल के दशकों के माध्यम से और अधिक हाल ही में अनुकूलन प्रक्रिया 1-6 योजनाओं के माध्यम से किया गया है ~ 10 जी / एल सुधार. Mutagenesis और स्क्रीनिंग रणनीतियों एंटीबायोटिक प्राकृतिक उत्पाद विकास में संवर्धन और / में कठिनाइयों का एक परिणाम के रूप में या आनुवंशिक देशी उत्पादन मेजबान से छेड़छाड़ और आसानी से उपलब्ध एंटीबायोटिक गतिविधि या बेहतर विकास के लिए चयन सहायता phenotypes क्योंकि आम हैं. इरिथ्रोमाइसिन ए, एस के मामले में erythraea एक धीमी गति से विकास प्रोफ़ाइल और अधिक प्रत्यक्ष आनुवंशिक हेरफेर तकनीक (ई. कोलाई जैसे जीवों की तुलना में) की कमी के द्वारा सीमित है, इस प्रकार, उत्पादन और नए डेरिवेटिव के biosynthesis में तेजी से सुधार में बाधा. उत्पादन मुद्दों को मान्यता दी और diversificati खुलाइरिथ्रोमाइसिन एक तरह यौगिकों के साथ संभावनाओं पर अनुसंधान समुदाय heterologous (1 चित्रा) biosynthesis 7 के विचार को आगे बढ़ाने के लिए शुरू किया. इन प्रयासों इरिथ्रोमाइसिन एक जीन 8-11 क्लस्टर के लिए उपलब्ध अनुक्रम जानकारी के साथ आया. यह जोर दिया जाना चाहिए कि अनुक्रम जटिल प्राकृतिक उत्पाद जीन समूहों की संख्या बहुत 12-16 का विस्तार किया गया है, निरंतर प्रयासों heterologous biosynthesis में इनकोडिंग औषधीय क्षमता का उपयोग करने के लिए प्रोत्साहन प्रदान करते हैं. ऐसा करने, heterologous पुनर्गठन की आवश्यकता है कि नए मेजबान विशिष्ट biosynthetic मार्ग की जरूरतों को पूरा ई.. कोलाई तकनीकी सुविधा, आणविक जीव विज्ञान तकनीक की एक विस्तृत फैले सेट, और चयापचय और प्रक्रिया इंजीनियरिंग उत्पाद विकास के लिए रणनीति प्रदान करता है. फिर भी, जब देशी उत्पादन मेजबान, ई. की तुलना कोलाई जटिल प्राकृतिक उत्पाद के उत्पादन का एक ही स्तर का प्रदर्शन नहीं करता. इसलिए यह अज्ञात था ई है कि क्या. कोलाई जटिल प्राकृतिक उत्पाद biosynthesis के लिए एक व्यवहार्य heterologous विकल्प के रूप में सेवा कर सकता है. हालांकि, यह मान लिया था कि ई. कोली को एक आदर्श मेजबान जीव अगर heterologous biosynthesis पूरा किया जा सकता होगा.
मन में इस लक्ष्य के साथ प्रारंभिक प्रयासों के लिए 6-deoxyerythronolide (6dEB बी) polyketide aglycone ई. के माध्यम से उत्पादन शुरू कर दिया कोलाई. हालांकि, देशी ई. कोलाई चयापचय propionyl सीओए प्रशंसनीय स्तर प्रदान नहीं और (2S) methylmalonyl सीओए व्यापारियों 6dEB biosynthesis के समर्थन की जरूरत है और न ही नए मेजबान के बाद translationally deoxyerythronolide बी (DEBS) synthase एंजाइमों को संशोधित कर सकता सकता है. इन मुद्दों के उपाय करने के लिए, एक चयापचय देशी और heterologous एंजाइमों का बना मार्ग ई. में बनाया गया था ऐसे कोलाई exogenously खिलाया propionate कि intracellularly propionyl सीओए परिवर्तित कर दिया गया और फिर (2S) methylmalonyl सीओए, इस मार्ग को पूरा करने के लिए इंजीनियरिंग के दौरान, एक sfp जीन वें में रखा गया थाई. की ई गुणसूत्र कोलाई BL21 (DE3) एक नई नस्ल का उत्पादन BAP1 कहा जाता है. SFP एंजाइम DEBS 17,18 एंजाइमों को 4'-phosphopantetheine cofactor संलग्न की एक phosphopantetheinyl transferase सक्षम है. तीन DEBS जीन (प्रत्येक ~ 10 केबी) तो दो अलग - अलग चयन अभिव्यक्ति युक्त inducible प्रमोटरों T7 वैक्टर पर रखा गया. प्रेरण के बाद तापमान (22 डिग्री सेल्सियस) की एक प्रमुख समायोजन करने के बाद, DEBS जीन coordinately एक सक्रिय राज्य में 19 6dEB पैदा करने में सक्षम थे, BAP1 भीतर व्यक्त की है.
पूर्ण इरिथ्रोमाइसिन की खोज एक biosynthesis फिर से एक अनुरूप जीन समूह Micromonospora megalomicea या एक संकर एस से जीन से बना मार्ग का उपयोग शुरू किया erythraea, एस. fradiae, और एस. venezuelae जो मध्यवर्ती इरिथ्रोमाइसिन सी और 6-deoxyerythromycin डी, क्रमशः 20-22 का उत्पादन. हाल ही में, हमारे समूह erythrom उत्पादक द्वारा इन प्रयासों को बढ़ा दिया गया हैई. के माध्यम से ycin एक (इरिथ्रोमाइसिन के सबसे चिकित्सकीय प्रासंगिक रूप) कोलाई. पिछले काम के विपरीत, हमारी रणनीति coordinately 20 मूल एस व्यक्त erythraea जीन polyketide biosynthesis, deoxysugar biosynthesis और लगाव, अतिरिक्त सिलाई और आत्म प्रतिरोध (चित्रा 2) के लिए की जरूरत है. कुल में, 26 जीन (देशी और heterologous) ई. अनुमति देने के लिए इंजीनियर थे 4 मिलीग्राम / एल 23,24 पर एक इरिथ्रोमाइसिन उत्पादन कोलाई. इस परिणाम एक जटिल polyketide प्राकृतिक उत्पाद का पूरा उत्पादन स्थापित ई. का उपयोग कर कोलाई और इस नए उत्पादन विकल्प का लाभ उठाने या नए लोगों को आगे बढ़ाने के लिए एक आधार के रूप में कार्य करता है.
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Protocol
नीचे पाठ इरिथ्रोमाइसिन एक एंटीबायोटिक के लिए विशिष्ट है, लेकिन कदम के लिए आम तौर पर heterologous biosynthesis के लिए उम्मीदवार के रूप में अन्य प्राकृतिक उत्पादों के लिए लागू तैयार हो रहे हैं.
1. एक जेनेटिक क्लस्टर स्थानांतरण इरीथ्रोमाइसीन
- डिजाइन पीसीआर प्राइमरों एस भीतर इरिथ्रोमाइसिन क्लस्टर एक के साथ जुड़े जीन की सभी बढ़ाना erythraea गुणसूत्र. यह कदम उन प्राकृतिक उत्पाद उम्मीदवारों जिसका आनुवंशिक दृश्यों निर्धारित किया गया है के लिए विशिष्ट है. वैकल्पिक रूप से, आवश्यक जीन लाभ के साथ कई वाणिज्यिक विक्रेता विकल्प के माध्यम से संश्लेषित है कि हो सकता है कि नव संश्लेषित जीनों नई ई. के भीतर इष्टतम कोडोन उपयोग के लिए डिजाइन किया जाएगा कोलाई मेजबान. यदि डीएनए संश्लेषण अपनाई है, एक मौजूदा चुनौती megasynthase जीन जो लंबाई में 10 केबी से अधिक हो सकता है पैदा कर रहा है. तकनीकी तौर पर, संश्लेषण, पूरा किया जा सकता है लेकिन यह चुनौती है और महंगा है. यह अनुमान है कि नित्य improvemजीन संश्लेषण प्रौद्योगिकी में पिता वर्तमान कमियां पता करने के लिए और आगे heterologous आनुवंशिक सामग्री प्रदान करने के लिए इस दृष्टिकोण को मान्य होगा.
- प्रदर्शन पीसीआर का उपयोग कर हौसले से तैयार एस erythraea जीनोमिक डीएनए एक टेम्पलेट के रूप में. गुणसूत्र डीएनए एस संस्कृतियों से तैयार किया जा सकता है erythraea या जीवाणु की जमी शेयरों से (चित्रा 3) 25. पीसीआर प्रतिक्रियाओं DMSO (50 μl प्रतिक्रियाओं में 4 μl) के अलावा उच्च जी सी सामग्री के लिए खाते में लक्ष्य में से लाभ हो सकता है एस erythraea जीन. प्रत्येक प्रवर्धित जीन पुष्टि करने के लिए है कि पूर्ण जीन को पुनः प्राप्त किया गया है और कि कोई परिवर्तन पीसीआर प्रक्रिया के दौरान पेश किया गया है अनुक्रम किया जाना चाहिए.
- प्रतिबंध डाइजेस्ट और ligation के माध्यम से, अलग जीनों की अभिव्यक्ति ई. के लिए डिजाइन वैक्टर में प्रत्येक सम्मिलित कोली (3 चित्रा). यह पीसीआर प्राइमरों के भीतर प्रतिबंध साइटों को डिजाइन करने के लिए उपयुक्त पूर्व में पाचन और ligation की अनुमति के द्वारा शुरू की हैpression वैक्टर (एक उदाहरण चित्रा 3 में शामिल किया गया है). हम दोनों pET21 और pET28 वैक्टर का इस्तेमाल किया है. सदिश pET28 एक '5 नेता अनुक्रम जो इरिथ्रोमाइसिन एक मामले में जीन की अभिव्यक्ति सहायता प्राप्त के शामिल किए जाने की अनुमति देता है. RT-पीसीआर, एसडीएस पृष्ठ विश्लेषण (घुलनशील प्रोटीन fractions का उपयोग करते हुए), या सुविधाजनक प्ररूपी assays (4 चित्रा) के माध्यम से व्यक्ति के जीन की अभिव्यक्ति की पुष्टि.
- सफलतापूर्वक व्यक्तिगत अभिव्यक्ति plasmids (3 चित्रा) से व्यक्त जीनों पर आधारित operons निर्माण. हम पारंपरिक रूप से संगत एकजुट प्रतिबंध एंजाइमों (जैसे Xba मैं और मैं विशेष रूप में) 24 के संयोजन का इस्तेमाल किया है sequentially operons करने के लिए जीन परिवर्तित, तथापि, प्रतिबंध operon निर्माण के लिए चुना साइटों के भीतर निवास नहीं (या से हटाया जाना चाहिए चाहिए) पृथक जीन दृश्यों (एक मुद्दा है कि अगर जीन संश्लेषण में प्रयोग किया जाता है बचा जा सकता है). यह कदम 20 इरिथ्रोमाइसिन समेकित जीन ई. को पहले कोलाई transformation. वर्तमान में, हम इस विधि का इस्तेमाल किया है एक मानक पीईटी वेक्टर में (~ 10 केबी के दो जीनों प्रत्येक) विदेशी डीएनए के 20 केबी के लिए शामिल है. इसके अलावा, हम इस दृष्टिकोण का इस्तेमाल किया नौ जीन युक्त operons उत्पन्न. यह अज्ञात है कि वास्तव में कितना डीएनए या कितने जीन पीईटी प्रकार plasmids में एकीकृत किया जा सकता है, लेकिन ऊपर उद्धृत मीट्रिक इरिथ्रोमाइसिन biosynthetic मार्ग की तरह जटिल प्रणाली के लिए एक संदर्भ प्रदान. अंत में, इन विट्रो ligation कदम और बाद में सफल परिवर्तन कदम में मानक operon और प्लाज्मिड का आकार बढ़ता है के रूप में तेजी से मुश्किल हो गया है. Ligation तापमान (12-22 डिग्री सेल्सियस) और समय (3-24 घंटा) विविध हैं और विद्युत परिवर्तन करने के लिए अंतिम प्लाज्मिड constructs के उत्पादन की प्रक्रिया में सहायता करने के लिए प्रयोग किया जाता है.
- ई. में बदलना नए डिजाइन biosynthetic plasmids कोलाई विद्युत परिवर्तन (चित्रा 5) का उपयोग BAP1 तनाव. प्रक्रिया plasmids के साथ करने का प्रयास किया जा सकता है या तो sequentially या सह में शुरूmbination. जब आकार करने में सक्षम है या कई plasmids बदलने, हम परंपरागत विद्युत परिवर्तन (के रूप में रासायनिक परिवर्तन करने के लिए विरोध) का इस्तेमाल किया है. एक बार बदल प्लेट, ठोस पौंड (5 मिलीग्राम / एल) टेट्रासाइक्लिन कार्बेनिसिलिन (100 मिलीग्राम / एल), केनामाइसिन (50 मिलीग्राम / एल), स्ट्रेप्टोमाइसिन (50 मिलीग्राम / एल), और apramycin (युक्त मध्यम कोशिकाओं पर 50 मिलीग्राम / एल ) प्लाज्मिड रखरखाव के लिए चयन करने के लिए. यह बेहद असामान्य है छह अलग एंटीबायोटिक दवाओं के एक ई के चयन के बाद परिवर्तन का उपयोग कोली सेल, लेकिन यह केवल अंतिम इरिथ्रोमाइसिन biosynthesis अनुमति की जरूरत plasmids की कुल संख्या को दर्शाता है. जबकि संभव है, दृष्टिकोण परिसर का उत्पादन क्षमताओं को सीमित कर एक बार संवर्धन शुरू कर दिया है (कृपया नीचे देखें).
2 ई.. कोलाई biosynthetic पुनर्गठन
- तनाव BAP1 biosynthesis के लिए आवश्यक substrates प्रदान करने के लिए और बाद translationally deoxyerythronolide बी megasynthase को संशोधित करने के लिए बनाया गया है. Eryt की व्यक्तिगत जीनhromycin जीन की अभिव्यक्ति के लिए एक मार्ग का परीक्षण किया है और अभिव्यक्ति plasmids में operons के रूप में समेकित. इस अनुभाग में संस्कृति पूर्ण इरिथ्रोमाइसिन एक मार्ग के ठोस गतिविधि के लिए परीक्षण की स्थिति के लिए समर्पित है.
- हौसले से बदल BAP1 की 3 अलग कालोनियों लो और 1.5 मिलीग्राम लेग आवश्यक प्लाज्मिड चयन एंटीबायोटिक दवाओं (एक ही सांद्रता में ऊपर संकेत ठोस मध्यम पर transformants के लिए चयन) युक्त संस्कृतियों, Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG टीका लगाना, 100 सुक्ष्ममापी ) और (2 मिलीग्राम / एमएल) arabinose जीन अभिव्यक्ति, और 20 मिमी सोडियम propionate intracellular biosynthetic अग्रदूत गठन का समर्थन के लिए प्रेरित करना. एक बार उत्पादन पुष्टि की गई है, बड़ा संस्कृतियों पैमाने पर करने के लिए एक और उत्पाद titers को अधिकतम करने के प्रयास में आयोजित किया जा सकता है.
- 22 में कोशिकाओं संस्कृति डिग्री सेल्सियस और 24-48 घंटे के लिए 250 rpm. इस मामले में, एंटीबायोटिक चयन सुनिश्चित करता है कि आवश्यक plasmids सेलुलर संस्कृति की प्रारंभिक अवस्था में रखा जाता है. हालांकि प्लाज्मिडआसानी से हो सकता है के रूप में चयन एंटीबायोटिक स्तर संवर्धन अवधि के पाठ्यक्रम के साथ बदल खो सकता है. यह प्लाज्मिड (यानी, संस्कृति के दौरान एक या एक से अधिक plasmids के नुकसान) अस्थिरता, जो फिर उत्पादन क्षमता की सीमा होती है को जन्म दे सकती है. समस्या exacerbated है जब असंगत plasmids के लिए एक पूर्ण heterologous जीन समूह शुरू करने के लिए उपयोग किया जाता है. ऐसे इरिथ्रोमाइसिन एक यौगिक (चित्रा 5) के लिए मामला है और remedied किया जा वास्तव में ई. से परिसर overproduce कोलाई. हालांकि, प्रारंभिक उत्पादन का प्रदर्शन करने के उद्देश्य के लिए, इस तरह के डिजाइन दोषों शीघ्रता से heterologous दृष्टिकोण की व्यवहार्यता की स्थापना की खातिर के लिए बर्दाश्त कर रहे हैं.
- एक Eppendorf microfuge में 10,000 rpm पर स्पष्ट centrifugation द्वारा संस्कृतियों. विश्लेषण के लिए सतह पर तैरनेवाला और 4 पर दुकान डिग्री सेल्सियस से निकालें.
- इरिथ्रोमाइसिन ए, यौगिक उत्पादन की कमी के मामले में GroES / एल (chaperonin pGro7 का उपयोग कर के शामिल किए जाने के द्वारा संबोधित किया गया थापता करने के लिए विशेष रूप से एंजाइमों के बाद अभिव्यक्ति की गतिविधि की कमी) और अतिरिक्त जीन प्रतियां (उन कमजोर अभिव्यक्ति / गतिविधि संदिग्ध जीन के लिए) का समावेश. अन्य heterologous प्राकृतिक उत्पाद के उत्पादन के प्रयासों के साथ इसी तरह की रणनीति की जरूरत हो सकती है.
3. उत्पाद विश्लेषण
- पुष्टि करने के लिए और इरिथ्रोमाइसिन मात्रा ठहराना गठन LC-एमएस प्रणाली (चित्रा 6) पर संस्कृति तैरनेवाला इंजेक्षन. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध इरिथ्रोमाइसिन उत्पादन की पुष्टि करने के लिए और मात्रा का ठहराव के दौरान एक मानक के रूप में इस्तेमाल किया गया था. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध मानकों के बिना मामलों के लिए, LC-एमएस विश्लेषण एनएमआर और उच्च संकल्प मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा अतिरिक्त रासायनिक लक्षण वर्णन की आवश्यकता होगी.
- 3 / BAP1 परिवर्तन से कालोनियों संस्कृतियों के बीच उत्पादन की तुलना करें. उच्चतम निर्माता चुनें और कॉलोनी स्रोत से एक ग्लिसरॉल स्टॉक तैयार. यह कदम नयाचार अनुभाग के उत्पादन संस्कृतियों के साथ समानांतर में किया जा सकता है2 संस्कृतियों के एक छोटे से हिस्से का उपयोग ग्लिसरॉल स्टॉक तैयार. ग्लिसरॉल स्टॉक एक -80 ° C फ्रीजर में स्टोर.
- पुष्टि की है, उच्चतम उत्पादन सेल स्टॉक का उपयोग करते हुए, एक अलग उत्पादन संस्कृति शुरू और एसीटेट एथिल 2x मात्रा के साथ अंतिम तैरनेवाला निकालने. एक वैक्यूम बाष्पीकरणीय प्रणाली का उपयोग करने के लिए निकालने सूखी और 100 μl मेथनॉल में resuspend. एक बाँझ फिल्टर डिस्क (~ 1/4 इंच व्यास) को निकालने के स्थानांतरण और डिस्क शुष्क करने की अनुमति. उधर, संस्कृति बी. लेग तरल में रातोंरात subtillis. बी के 20 μl जोड़ें 45 पर subtilis तरल लेग अगर की 20 मिलीलीटर संस्कृति ° सी. प्लेट और अगर कठियाना करने की अनुमति देते हैं. और 37 डिग्री सेल्सियस (7 चित्रा) थाली सेते पर फिल्टर डिस्क रखें. वैकल्पिक रूप से, एक 96 अच्छी तरह से थाली के भीतर निकालने तरल संस्कृतियों के लिए जोड़ा जा सकता है (7 चित्रा) एक प्लेट पाठक का उपयोग गतिविधि यों.
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Representative Results
इस दृष्टिकोण के वांछित परिणाम ई. से एक पूरी तरह से प्राकृतिक bioactive उत्पाद का उत्पादन होता है मेजबान heterologous कोलाई. यह सबसे अच्छा LC-एमएस परिणाम की पुष्टि करने और उत्पादन (6 चित्रा) और जीवाणुरोधी अंतिम गतिविधि की पुष्टि (7 चित्रा) के लिए इस्तेमाल किया bioassay यों द्वारा प्रतिनिधित्व किया है. Heterologous biosynthesis की समग्र योजना में, इस परिणाम की सफलता को परिभाषित करता है. एक बार पूरा, अनुसंधान प्रयासों तो अनुकूलन (दोनों सेलुलर और प्रक्रिया पैमाने पर) और आणविक इंजीनियरिंग बारी. अंतिम उद्देश्य मूल और heterologous ऐसी है कि प्रक्रिया को तर्कसंगत संशोधन करने के लिए एक गतिविधि बढ़ या चौड़ी स्पेक्ट्रम के लिए क्षमता के साथ मूल परिसर की वेरिएंट का उत्पादन किया जा सकता है प्रणाली पर यौगिक नियंत्रण के लिए किफायती उत्पादन प्रक्रियाओं में शामिल हैं.
वांछित यौगिक उत्पादन करने में विफलता तो कई आकस्मिक योजना टी ट्रिगरदृष्टिकोण के भाग जो सफल biosynthesis पर रोक लगाने का आकलन ओ. ऊपर उल्लिखित प्रक्रिया के भीतर इन मुसीबत शूटिंग तंत्र के कई में निर्मित कर रहे हैं. हमारे अनुभव में, यह महत्वपूर्ण है, कम से कम, नव शुरू जीन समूह के सफल जीन अभिव्यक्ति (एसडीएस पृष्ठ घुलनशील biosynthetic एंजाइमों के विश्लेषण) का गठन प्राकृतिक उत्पाद के biosynthesis का आकलन करने का प्रयास करने से पहले की पुष्टि. पोस्ट अभिव्यक्ति, इसके बाद के संस्करण के रूप में संकेत दिया है, प्रोटीन तह संरक्षिकाओं, बढ़ाया जीन की नकल संख्या, और प्रक्रिया तापमान का उपयोग अंतिम biosynthesis की अनुमति के प्रभावी उपाय किया गया है.
चित्रा 1 heterologous प्राकृतिक उत्पाद biosynthetic योजना का एक समग्र चित्रण इरिथ्रोमाइसिन एक यौगिक की विशेषता. प्रयोगात्मक लिए आवश्यक कदम शामिल हैं 1) और इरिथ्रोमाइसिन जीन क्लस्टर fr के डिजाइन हस्तांतरणओम एस ई. को erythraea कोलाई, ई. भीतर 2) biosynthesis के पुनर्गठन कोलाई, और 3) इरिथ्रोमाइसिन ए के उत्पाद विश्लेषण
चित्रा 2. ए इरिथ्रोमाइसिन जीन समूह के रूप में देशी एस में आयोजित erythraea गुणसूत्र. बी इरीथ्रोमाइसीन एक biosynthesis. ई. के भीतर कोलाई, SFP एंजाइम DEBS1 के posttranslational संशोधन, 2, और 3 polyketide synthase एंजाइमों (प्रत्येक> 300 केडीए) के लिए आवश्यक है, इस जोड़ने के प्रत्येक एसीपी डोमेन के साथ जुड़े हाथ से दर्शाया जाता है. DEBS एंजाइमों एक α 2 2 β γ 2 मॉड्यूल इकाइयों में subdivided जटिल है कि एक स्टार्टर इकाई propionyl सीओए और छह (2 एस) के लगातार condensations को उत्प्रेरित फार्म - methylmalonylसीओए भरनेवाला इकाइयों polyketide 6 deoxyerythronolide बी (6dEB) बनाने के लिए. KS-ketosynthase, एसाइल transferase, एसीपी एसाइल वाहक प्रोटीन, KR-ketoreductase (निष्क्रिय के.आर. के साथ 3 मॉड्यूल में उल्लेख किया है); DH-dehydratase; reductase ईआर enoyl, ते thioesterase. (Propionyl सीओए synthetase) PrpE और पीसीसी (propionyl-CoA carboxylase, दो प्रोटीन का बना) शुरू propionyl सीओए substrates और (2 एस) methylmalonyl सीओए exogenous propionate में परिवर्तित करने के लिए आवश्यक हैं. जीन SFP और PrpE के लिए पहले BAP1 ई. भीतर इंजीनियर थे कोलाई गुणसूत्र 19. Biosynthesis deoxysugar और अनुलग्नक, अतिरिक्त सिलाई, और स्वयं प्रतिरोध एंजाइमों द्वारा इरिथ्रोमाइसिन 6dEB अणु का रूपांतरण पूरा किया है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 3. व्यक्तिगत इरिथ्रोमाइसिन एक biosynthesis (तीन DEBS जीन को छोड़कर) के लिए आवश्यक जीन ए अलगाव. व्यक्तिगत पीसीआर oligonucleotide eryCI लिए अलग इस्तेमाल प्राइमरों सहित प्लाज्मिड डिजाइन, प्राइमर प्रतिबंध साइटों बोल्ड और पूरक अनुक्रम में दर्शाया गया है को रेखांकित किया गया है. परिणामस्वरूप pET21 और pET28 व्यक्तिगत जीन और operons युक्त वैक्टर के प्रतिबंध विश्लेषण भी शामिल है बी. मैं biosynthetic ई. को परिचय के लिए operons के रूप polyketide सिलाई के लिए आवश्यक जीन का समेकन. / एक्स एस Xba मैं संगत एकजुट ligation और विशेष या तो restricti मैं साइटों है जो एक नई अपरिचित अनुक्रम में परिणाम का प्रतिनिधित्व करता है. कोलाई ii प्रतिबंध साइट और अन्य अभिव्यक्ति तत्वों operon निर्माण और डिजाइन के साथ शामिल है,एंजाइम पर आंकड़ा 3 देखने के लिए यहाँ क्लिक करें .
चित्रा 4. विश्लेषण ए एसडीएस पृष्ठ व्यक्ति जीन चित्रा 3 में प्रस्तुत की. तारांकनों उन 5 'नेता pET28 अभिव्यक्ति वेक्टर से उत्पन्न दृश्यों के साथ व्यक्त जीनों बी ErmE की प्ररूपी मूल्यांकन (इरिथ्रोमाइसिन एक प्रतिरोध) निरूपित. ठोस ई. का परीक्षण किया मध्यम भीतर इरीथ्रोमाइसीन कोलाई उपभेदों plasmids के साथ या ermE इरिथ्रोमाइसिन के बिना एक प्रतिरोध जीन को शरण देने. सेल वृद्धि ermE अभिव्यक्ति के साथ साथ बचाया है.
चित्रा 5. पूर्ण इरिथ्रोमाइसिन एक मार्ग के ए योजनाबद्ध ई. के लिए शुरू की GroEL / ES (pGro7) chaperonin और एरिक की एक अतिरिक्त प्रति युक्त रासायनिक और विद्युत दोनों (i) संयोजन और plasmids के अनुक्रमिक परिचय (ii) तरीकों का उपयोग कर के बीच एक प्लाज्मिड बी परिवर्तन तुलना के लिए एक प्लाज्मिड सहित कोलाई, सी.. बदल तनाव के प्लाज्मिड स्थिरता बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
चित्रा 6 मानक LC-एमएस इरिथ्रोमाइसिन के निशान. ई. से उत्पादित कोलाई.
चित्रा 7. ए फिल्टर मैं युक्त डिस्क ठोस चरण bioassay. एक uninduced BAP1 ई. से निकालने के कोलाई नकारात्मक नियंत्रण, द्वितीय व्यावसायिक रूप से उपलब्ध इरिथ्रोमाइसिन एक सकारात्मक (नियंत्रण);. और iii इरिथ्रोमाइसिन एक प्रेरित BAP1 ई. से निकाला प्रणाली कोलाई. डिस्क बी के एक लॉन पर चढ़ाया गया subtilis बैक्टीरिया और निषेध के परिणामस्वरूप क्षेत्रों एंटीबायोटिक गतिविधि का संकेत बी परख तरल चरण में 96 अच्छी तरह से थाली समय पाठ्यक्रम के नमूने का उपयोग करते हुए प्रदर्शन किया. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
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Discussion
2) biosynthetic पुनर्गठन, और 3) उत्पाद विश्लेषण) 1 आनुवंशिक हस्तांतरण: heterologous biosynthesis में महत्वपूर्ण कदम प्रक्रिया में तीन प्रक्रियात्मक बिंदुओं में से प्रत्येक पर सामना कर रहे हैं. किसी भी स्तर पर एक समस्या heterologous biosynthesis की स्थापना के परम उद्देश्य पटरी से उतर जाएगा. शायद इस प्रक्रिया का सबसे चुनौतीपूर्ण पहलू पुनर्गठन biosynthesis की स्थापना है, क्योंकि यह पूरी तरह सफल विश्लेषण की अनुमति देने के लिए आवश्यक है. हालांकि, पुनर्गठन सावधान डिजाइन और अंततः biosynthesis के लिए जिम्मेदार आनुवंशिक सामग्री के हस्तांतरण पर निर्भर है. इसी तरह, स्थापित, संवेदनशील विश्लेषणात्मक तरीकों (LC-एमएस की तरह) छोटे अनुमापांक स्तर कि अन्यथा उत्पादन की कमी के रूप में व्याख्या की जा सकती है का पता लगा सकते हैं. यह इन स्थितियों कि heterologous biosynthesis चुनौतीपूर्ण बनाता की परिणति है.
इरिथ्रोमाइसिन करने का संबंध है के साथ एक उदाहरण, पुष्टि जीन पीसीआर द्वारा अलग दृश्यों व्यक्तिगत ऍक्स्प के लिए परीक्षण किया गयाression पूर्व समन्वित अभिव्यक्ति और प्राकृतिक उत्पाद गठन के लिए जीन को मजबूत करने के लिए. उत्पाद विश्लेषण में आरंभिक प्रयास के दौरान, मध्यवर्ती यौगिकों 1 की पहचान की गई है, जब केवल एक chaperonin (GroEL / ते) सह आवश्यक जीन समूह के साथ किया गया था व्यक्त की. केवल अंतिम उत्पाद का उत्पादन किया गया था जब biosynthesis में पिछले कदम (एरिक) के लिए जिम्मेदार जीन की एक अतिरिक्त प्रति शामिल किया गया था. इन उपायों के दोनों संवेदनशील LC-एमएस विश्लेषणात्मक शुरू में उत्पादन का आकलन करने के लिए प्रयोग किया जाता विधि से लाभान्वित.
अब जब कि उत्पादन की पुष्टि की गई है, ई. कोलाई सेलुलर पृष्ठभूमि कई इंजीनियरिंग अवसर प्रदान करता है. जिसमें से 1 देशी इरिथ्रोमाइसिन एक यौगिक के उत्पादन का अनुकूलन है. इस प्रक्रिया में समय और लागत में एक संभावित बचत के साथ वैकल्पिक उत्पादन मार्ग की पेशकश करेगा. इसके अलावा, इरिथ्रोमाइसिन उत्पाद गठन का विविधीकरण करने के उद्देश्य के लिए एक मार्ग चालाकी से किया जा सकता है. नई analogs की पेशकशनया (या अन्य चिकित्सीय) एंटीबायोटिक गतिविधि के संभावित. ये वही अवसर heterologous biosynthesis के सामान्य अनुप्रयोगों के लिए मौजूद हैं और दृष्टिकोण के लिए प्राथमिक प्रेरणा, आगे कई मूल उत्पादक जीवों के साथ सामना करना पड़ा चुनौतियों द्वारा समर्थित प्रदान करते हैं. नित्य अनुप्रयोगों और इस आलेख में वर्णित दृष्टिकोण के सुधार भविष्य heterologous biosynthetic सफलता की आवृत्ति में वृद्धि होगी.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
लेखकों biosynthesis heterologous के लिए समर्पित परियोजनाओं का समर्थन करने के लिए वित्त पोषण के लिए धन्यवाद (AI074224 और GM085323) NIH और NSF (0,712,019 और 0,924,699).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PCR machine | Eppendorf | Mastercycler personal | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher | BP231 | |
| Electroporator | BioRad | Micropulser | |
| IPTG | Fisher | BP1620 | |
| Sodium propionate | Sigma | P1880 | |
| L-arabinose | Sigma | A3256 | |
| Refrigerated Shaker | Thermo Scientific | MaxQ 4000 | |
| Microfuge | Eppendorf | Centrifuge 5415D | |
| pGro7 | Takara | Chaperone Plasmid Set (3340) | |
| pET21, pET28, pCDF-Duet-1 | EMD Chemicals | 69742-3, 69864, 71340 | |
| LC-MS | Applied Biosystems | 3200 Q-Trap | |
| Ethyl acetate | Sigma | 270989 | |
| Methanol | Sigma | 322415 | |
| Vacuum centrifuge | Eppendorf | Concentrator 5301 | |
| Rotary Evaporator | Buchi | R-200 |
References
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