Summary
Yoluyla eritromisin A heterolog biyosentezi
Abstract
Karmaşık doğal ürünlerin heterolog üretimi mevcut sınırlamalar ve gelecekteki olanakları yönelik olarak tasarlanmış bir yaklaşımdır. Bu, tedavi edici değere sahiptir fakat yeterince üretilmiş ya da üretim geliştirilmiş bir şeklinde yararlanacak edilemeyen bileşikler için özellikle yararlıdır. ; 2) heterolog sulandırma ve 3) ürün analizi 1) gen transferi: dahil deneysel prosedürleri üç bileşenden ayrılabilir. Her deneysel bileşen zorlukları karşılamak ve yeni ortaya çıkan bu yaklaşım ile ilişkili fırsatları öngörmeye sürekli iyileştirme altında.
Heterolog biyosentez değerli bir doğal ürün sorumlu genetik dizisinin kimliği ile başlar. Heterolog bir host bu sıra aktarma ürünün oluşumundan sorumlu biyosentetik karmaşıklığı nedeniyle karmaşıklaşır. Bir antibiyotik eritromisin iyi bir örnektir. Yirmi gen ()> 50 kb toplam nihai biyosentezi için gereklidir. Buna ek olarak, bu genlerin üç boyutlu olarak megasynthases, çoklu alan enzimlerin her biri ~ 300 kDa kodlamaktadır. Bu genetik materyal olarak tasarlanmış ve E. transfer edilmelidir Sulandırılan biyosentezi için coli. PCR izolasyon, operon yapı, çok-cystronic plazmidler, ve elektro-transformasyon kullanımına E. eritromisin A genetik küme aktarılması olarak tarif edilecektir coli.
Sonra transfer, E. coli hücre nihai biyosentezi desteklemesi gerekir. Bu süreç aynı zamanda E. arasındaki önemli farklılıklar verilir meydan okuduğunu coli ve karmaşık doğal ürün oluşumundan sorumlu en özgün ana. Hücre biyosentezi desteklemek için gerekli ortamlar sağlarlar ve koordineli aktif enzimleri üretmek için aktarılan genetik kümede ifade etmelidir. Eritromisin A, E. halinde coli hücre iki öncüleri (pr sağlamak üzere tasarlanmış olması gerekiyorduopionyl-CoA ve (2S)-metilmalonil-CoA) biyosentezi için gereklidir. Buna ek olarak, gen sekans değişiklikleri, plazmit kopya sayısı, chaperonin birlikte ekspresyonu, post-translasyonel enzimatik modifikasyon ve işlem sıcaklığının aynı zamanda nihai eritromisin A oluşumuna izin vermek için gerekli idi.
Son olarak, başarılı üretim değerlendirilmelidir. Eritromisin bir olgu için, iki yöntem sunacak. İlk sıvı kromatografi-kütle spektrometresi (LC-MS) üretim onaylamak ve ölçümüdür. Eritromisin A biyoaktivitesi de antibiyotik aktivite Bacillus subtilis karşı test edildiği bir biyo-analizi kullanımı yoluyla teyit edilecektir. E. eritromisin kurmak değerlendirme deneyleri A biyosentezi üretimi artırmak veya çeşitlendirmek için gelecek mühendislik çalışmaları için ve bu yaklaşımı kullanarak yeni kompleks doğal bileşiklerin üretimi için sahne coli ve ayarlayın.
Introduction
Eritromisin A Gram pozitif toprak bakterisi Saccharopolyspora Eritre tarafından üretilen bir poliketid antibiyotik ve mevcut üretim aşamalı geleneksel mutagenez ve tarama protokolleri on yıllar boyunca ve daha yakın proses optimizasyonu düzenleri 1-6 yoluyla ~ 10 g / L için geliştirilmiştir. Mutagenezi ve tarama stratejileri kültür ve / zorluklar sonucu veya genetik olarak yerli üretim ana manipüle ve çünkü hazır antibiyotik etkinlik veya seçimle yardım etmek için geliştirilmiş büyüme fenotipleri antibiyotik doğal ürün geliştirme yaygındır. Eritromisin A, S. durumunda, Eritre üretim ve yeni türevleri biyosentezini engellemektedir hızlı gelişmeler, böylece, bir yavaş büyüme profil ve daha doğrudan genetik manipülasyon teknikleri eksikliği (E. coli gibi canlılar için göreli) ile sınırlıdır. Üretim sorunları tanınan ve diversificati kilidi olmasıeritromisin A gibi bileşikler ile olanakları hakkında, araştırma topluluğu heterolog biyosentezi (Şekil 1) 7 fikrini sürdürmeye başladı. Bu çabalar eritromisin A gen kümesi 8-11 kullanılabilir sırası bilgilerinin çakıştı. Bu kodlanmış tıbbi potansiyeline erişmek için heterolog biyosentezinde çabaların sürdürülmesi ivme sağlayarak, sıralı karmaşık doğal ürün gen kümelerinin sayısını büyük ölçüde 12-16 genişletti vurgulanmalıdır. Bunu yapmak için, heterolog sulandırılması yeni konak spesifik biyosentetik ihtiyaçlarını karşılamak gerekir. E. coli teknik kolaylık, moleküler biyoloji teknikleri geniş kapsayan seti, ve ürün geliştirme için metabolik ve proses mühendisliği stratejileri sağlar. Ancak, yerli üretim ana, E. karşılaştırıldığında koli kompleks doğal ürün üretiminin aynı seviyede sergilemez. Bu nedenle bilinmeyen E olsun. coli karmaşık doğal ürün sentezi için uygun bir heterolog seçenek olarak hizmet verebilir. Bununla birlikte, bu kabul edildiği E. heterolog biyosentezi başarılı olabilir eğer coli ideal bir konak organizma olacaktır.
Akılda Bu amaçla, ilk çabaları 6-deoxyerythronolide B (6dEB) E. aracılığıyla poliketid aglikon üretmeye başladı coli. Ancak, yerli E. coli metabolizmasının propiyonil-KoA kayda değer düzeylerde sağlamak olamazdı ve (2S)-metilmalonil-CoA prekürsörlerinin 6dEB biyosentezi desteklemek için de yeni bir konak sonrası Çevrimsel deoxyerythronolide B sentaz (DEBS) enzimler değiştirmek olabilir gerekli. Bu sorunları çözmek için, yerli ve heterolog enzimleri oluşan bir metabolik yolun E. içine inşa edilmiştir Eksojen beslenen propionat (2S)-metilmalonil-CoA sonra propionil-CoA ve dönüştürülmüş hücre içinde olduğu bu coli, bu yolun tamamlamak için mühendislik sırasında, bir sfp gen inci içine yerleştirildiE. e kromozom yeni bir gerginlik üretmek için coli BL21 (DE3) BAP1 adlandırılır. Sfp enzim DEBS enzimler 17,18 için 4'-phosphopantetheine kofaktör bağlamak bir phosphopantetheinyl transferaz yeteneğine sahiptir. Üç DEBS genleri (her biri yaklaşık 10 kb) sonra indüklenebilir T7 arttırıcılar ihtiva eden iki ayrı ayrı ifade vektörleri seçilebilir yerleştirildi. Postindüksiyon sıcaklığı (22 ° C) önemli bir ayardan sonra, DEBS genler koordineli 6dEB 19 üretme yeteneğine sahip bir aktif devlet BAP1 içinde ifade edildi.
Tam eritromisin peşinde bir biyosentezi ardından Micromonospora megalomicea gelen benzer bir gen küme veya S. gelen genlerin oluşan melez bir yolu kullanmaya başladı Eritre, S. fradiae, ve S. sırasıyla ara eritromisin C ve 6-deoxyerythromycin D, 20-22 üretilmiş venezuelae. Son zamanlarda, bizim grup erythrom üreterek bu çabaları genişlettiE. aracılığıyla ycin A (eritromisin klinik olarak en-ilgili formu) coli. Önceki çalışmaları aksine, bizim strateji koordineli 20 orijinal S. ifade Eritre genler poliketid biyosentezi, deoxysugar biyosentezi ve eki, ek terzilik, ve öz-direnci (Şekil 2) için gerekli. Toplamda, 26 (yerli ve heterolog) genleri E. izin geliştirilmişti A 4 mg / L 23,24 Eritromisin de üretmek için coli. Bu sonuç, E. kullanılarak kompleks bir poliketid doğal ürün komple üretim kurulmuş coli ve kaldıraç bu yeni üretim seçeneği veya yenilerini takip için bir temel olarak hizmet vermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Aşağıdaki metin eritromisin A antibiyotik için spesifik olan, ancak adımları heterolog biyosentezi için aday olan diğer doğal ürünler için genel olarak uygulanabilir olacak şekilde tasarlanmıştır.
1. Eritromisin A Genetik Küme Transferi
- Tasarım PCR primerleri S. içindeki eritromisin A kümesi ile ilişkili genlerin tüm yükseltmek için Eritre kromozom. Bu adım olan genetik dizileri tespit edilmiş olan doğal ürün adaylar özgüdür. Alternatif olarak, gerekli genlerin yeni sentezlenen genlerin yeni E. içinde optimum kodon kullanım için tasarlanmış olacağını avantajı ile (birkaç ticari satıcı seçenekleri arasında) sentez edilebilir coli konak. DNA sentezi takip edilirse, güncel bir meydan uzunluğu 10 kb aşabilir megasynthase genler oluşturuyor. Teknik olarak, sentez gerçekleştirilebilir, ancak zor ve pahalı olabilir. Bu tahmin edilmektedir ki sürekli improvemgen sentezi teknolojisi hastaların mevcut sakıncaları gidermek ve daha heterolog genetik materyali sağlamak için bu yaklaşımı doğrular.
- Taze hazırlanmış S. kullanılarak PCR gerçekleştirin Şablon olarak genomik DNA Eritre. Kromozomal DNA S. kültürlerinden hazırlanabilir Eritre veya bakterinin dondurulmuş stoklarından (Şekil 3) 25. PCR reaksiyonları, hedef olarak yüksek G+ C içeriğine için hesap DMSO ilave (50 ul reaksiyon içinde 4 ul) yararlanabilir S. Eritre genler. Her amplifiye gen tam gen geri alındığını ve hiçbir mutasyon PCR işlemi sırasında tanıtıldı onaylamak için sıralı olmalıdır.
- Kısıtlama sindirimi ve ligasyon ile, E. için tasarlanmış ekspresyon vektörleri içine izole edilmiş genlerin her biri eklemek coli (Şekil 3). Bu, eski haline uygun sindirim ve ligasyon izin vermek için PCR primerleri, içinde kısıtlama siteleri tasarlanması ile başlatılırdepresyon vektörleri (örneğin Şekil 3 'de dahil edilmiştir). Biz pET21 ve pET28 vektörü kullanılmıştır. PET28 vektörü eritromisin A durumda, gen ekspresyonu destekli bir 5 'lider sekansı dahil edilmesine olanak vermektedir. RT-PCR, SDS-PAGE analizi (çözünür protein fraksiyonları kullanılarak), ya da uygun fenotipik analizi (Şekil 4) vasıtasıyla ayrı gen ekspresyonunu kontrol edin.
- Başarıyla bireysel ifade plazmid (Şekil 3) genlerin dayalı operonlar Construct. Biz geleneksel sırayla operonlar genlerin dönüştürmek için uyumlu yapışkan restriksiyon enzimleri (örneğin xba I ve SPE I gibi) 24 bileşimi kullanılmaktadır, ancak operon inşaat için seçilen kısıtlama siteleri içinde ikamet etmemelidir (veya çıkarılması gerekir) izole gen dizileri (gen sentezi kullanılması durumunda önlenebilir bir sorun). Bu adım, E. önce 20 eritromisin A genleri birleştirir coli transfoMüşavirliğimizin. Şu anda, biz bir standart pET vektör (~ 10 kb iki genin her biri) yabancı DNA'nın 20 kb eklemek için bu yöntemi kullandık. Ayrıca, dokuz genleri içeren operonlar oluşturmak için bu yaklaşımı kullanmış. Ancak, yukarıda belirtilen ölçütleri eritromisin biyosentetik gibi karmaşık sistemler için bir referans sağlayacaktır; Bu tam olarak ne kadar DNA veya kaç genlerin pET tip plazmidler entegre olabilir bilinmemektedir. Son olarak, standart in vitro ligasyonu adımları ve sonraki başarılı dönüşüm adımları operon ve plazmid büyüklüğü arttıkça giderek zorlaşmıştır. Ligasyon sıcaklığına (12-22 ° C) ve zaman (3-24 saat) çeşitlidir ve elektro-dönüşüm son plazmid yapıları üretme sürecine yardımcı olmak için kullanılır.
- E. içine yeni tasarlanmış biyosentetik plazmidler Dönüşümü coli elektro-dönüşüm (Şekil 5) kullanarak BAP1 süzün. Prosedürü plazmid ile denenebilir ya sırayla ya da eş tanıtıldımbination. Boyutu-mümkün ve çok sayıda plazmidler dönüştürürken, biz geleneksel elektro-dönüşüm (gibi kimyasal dönüşüme karşı) kullandık. Bir kez dönüştürülmüş levha tetrasiklin (5 mg / l), karbenisilin (100 mg / l), kanamisin (50 mg / L), streptomisin (50 mg / l) ve Apramycin (ihtiva eden katı LB ortamı üzerine, hücreler 50 mg / l ) plazmid bakım için seçin. Bir E. altı farklı seçim antibiyotikler dönüşüm sonrası kullanımı oldukça sıradışı coli hücre, ancak bu sadece son eritromisin A biyosentezi sağlamak için gerekli plazmid toplam sayısını gösterir. Mümkün olsa da kültürleme (aşağıya bakınız) başladıktan sonra, yaklaşımı bileşiğin üretim kapasitesini sınırlar.
2. E. coli Biyosentetik Sulandırma
- Gerilme BAP1 biyosentezi için gerekli olan substratlar sağlamak ve post-Çevrimsel deoxyerythronolide B megasynthase değiştirmek üzere dizayn edilmiştir. Eryt Bireysel genlerhromycin bir yolu gen ekspresyonu için test ve ifade plazmid içine operonlar olarak konsolide edilmiştir. Bu bölüm, tam eritromisin A yolun ortak etkinlik için test etmek için kültür koşulları ayrılmıştır.
- Taze dönüştürülmüş BAP1 3 ayrı koloniler al ve istenilen plazmid seçim antibiyotikler (aynı konsantrasyonlarda katı ortam üzerinde transformantlar için seçmek için yukarıda belirtildiği gibi) ihtiva eden 1.5 ml LB kültür, izopropil β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG aşılamak, 100 uM gen ifadesi ve bio-sentetik hücre içi haberci oluşumunu desteklemek için propiyonat, 20 mM sodyum indüklemek için) ve arabinoz (2 mg / ml). Üretim teyit edildikten sonra, daha büyük kültürler ürün büyütmek titreleri ve en üst düzeye çıkarmak için bir girişim olarak yapılabilir.
- 22, Kültür hücrelerinin ° C'de, 24-48 saat boyunca 250 rpm. Bu durumda, antibiyotik seçimi istenilen plazmid hücre kültürünün erken aşamalarında muhafaza edilmesini sağlar. Bununla birlikte, plazmidSeçimi antibiyotik seviyeleri kültür dönemi boyunca değiştirmek gibi s kolayca kaybolabilir. Bu da üretim kapasitesi de sınırlar plasmidi kararsızlık (yani, kültür sırasında bir ya da daha fazla plazmid kaybı), yol açabilir. Uyumsuz plazmidler tam heterolog gen küme tanıtmak için kullanıldığında sorun artar. Bu tür eritromisin A bileşiği (Şekil 5) için durum böyle değildir ve gerçekten E. bileşik fazla üretmek için telafi edilmesi gerekir coli. Bununla birlikte, ilk üretim gösterilmesi amacıyla, bu tür tasarım kusurları süratle heterolog bir yaklaşım olabilirliğini oluşturulması uğruna tolere edilir.
- Bir Eppendorf mikrofuge'de 10.000 rpm'de santrifüj yoluyla kültürler netleştirin. Analizi için 4 de süpernatant ve mağaza ° C çıkartın.
- Eritromisin A, bileşim üretimi eksikliği durumunda pGro7 kullanılarak Groes / EL chaperonin (maddesinin ilavesi ile ele alındıözel enzimler sonrası ifade aktivite eksikliği) ve ek gen kopyalarının (zayıf ekspresyon / aktivite şüphesi bulunan genler için) dahil ele. Benzer stratejiler Diğer heterolog doğal ürün üretim çabaları ile gerekli olabilir.
3. Ürün Analizi
- Bir oluşum onaylamak ve eritromisin ölçmek için, LC-MS sistemi (Şekil 6) üzerine kültür süpernatant enjekte. Ticari olarak temin edilebilen eritromisin A üretim onaylamak ve nicelendirilmek esnasında bir standart olarak kullanılmıştır. Ticari olarak mevcut standartlar olmadan durumlarda, LC-MS ve NMR analizi, yüksek çözünürlükte kütle spektrometrisi ile ek kimyasal nitelemeyi gerektirecektir.
- BAP1 dönüşümü 3 koloni / kültürler arasındaki üretim karşılaştırın. Yüksek yapımcı seçin ve koloni kaynağından bir gliserol stoku hazırlamak. Bu adım, Protokol Bölüm üretim kültürleri ile paralel olarak yapılabilirGliserol stokları hazırlamak kültürlerin küçük bir bölümünü kullanarak 2. Bir -80 ° C derin dondurucuda gliserol stok saklayın.
- Teyit, yüksek üreten hücre stoku kullanarak, ayrı bir üretim kültürünün başlaması ve etil asetat 2x hacmi ile son süpernatant ayıklayın. Özü kuru ve 100 ul metanol içinde tekrar süspansiyon için bir vakum buharlaştırıcı sistemi kullanın. Steril bir filtre disk (~ 1/4 inç çapında) özü aktarın ve disk kurumasını bekleyin. Ayrı, kültür B. gecede LB sıvı subtillis. B. 20 ul ekle 45 sıvı LB agar 20 ml subtilis kültür ° C. Plaka agar ve katılaşmaya izin. 37 ° C (Şekil 7) ve levha üzerinde inkübe filtre diski yerleştirin. Alternatif olarak, ekstrakt bir plaka okuyucu (Şekil 7) kullanılarak etkinlik miktarını belirlemek için bir 96-gözlü tabak içindeki sıvı kültüre eklenebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu yaklaşımın istenilen sonucu E. tamamen biyoaktif doğal ürünün üretim konak heterolog coli. Bu, en iyi üretim (Şekil 6) ve (Şekil 7) nihai aktivitesini teyit etmek için kullanılan antibakteriyel biyoassay onaylamak ve ölçmek için kullanılan LC-MS sonuçlar ile temsil edilir. Heterolog biyosentezinin genel düzenlemesinde, bu sonuç, başarı tanımlar. Bir kez başarılı, araştırma çabalarının ardından optimizasyonu (hem hücresel hem de süreç ölçeklerde) ve moleküler mühendislik açın. Nihai amaçları işlem için rasyonel modifikasyonlar yüksek bir etkinlik ya da genişletilmiş spektrumlu için potansiyele sahip olan orijinal bileşiğin türevleri üretmek üzere yapılabilir ki bu gibi heterolog sistem üzerinde orjinal bileşik ve kontrol için ekonomik üretim süreci içerir.
İstenilen bileşik oluşturmak üzere bir hata sonra çok sayıda olasılık plan t tetiklerBaşarılı biyosentez yasaklayan bir yaklaşımın hangi bölümünü değerlendirmek o. Bu sorun giderme mekanizmalarının çoğu yukarıda özetlenen yordamı içinde in-inşa edilmiştir. Bizim tecrübelerimize göre, önceden oluşmuş doğal ürün biyosentezi değerlendirmek teşebbüs Yeni tanıtılan gen küme başarılı gen ekspresyonu (SDS-PAGE çözünür biyosentetik enzim analizi) onaylamak için, en azından önemli. Mesaj ifadesi, yukarıda belirtildiği gibi, protein katlanması şaperonlar, gelişmiş gen kopya sayısı ve proses sıcaklık kullanımı nihai biyosentezini sağlayan etkili bir araç olmuştur.
Şekil 1. Heterolog doğal ürün biyosentetik düzeni genel bir tasviri eritromisin A bileşiği içeren. Gerekli deneysel adımlar) eritromisin gen küme fr tasarım ve transferi 1 içerirom S. E. Eritre coli; E. içinde biyosentezi 2) sulandırılması coli ve eritromisin A. 3) ürün analizi
Şekil 2. A. gibi yerli S. eritromisin gen küme organize Eritre kromozom. B. Eritromisin A biyosentezi. E. Içinde coli, Sfp enzim DEBS1 arasında posttranslasyonel modifikasyonu, 2, ve 3 poliketid sentaz enzimleri (her> 300 kDa) için gereklidir, bu her ACP etki alanı ile ilişkili bağlantı kolu ile gösterilir. DEBS enzimler bir α 2 β 2 bir başlangıç propiyonil-KoA ünitesi ve altı (2 S) ardışık terlemeyi katalize modül üniteler bölünmüştür γ 2 kompleks oluşturur-metilmalonil-CoA genişletici birimleri poliketid 6-deoxyerythronolide B (6dEB) olarak tanımlanmıştır. KS-ketosynthase; AT-açil transferaz; ACP-açil taşıyıcı protein; KR-ketoreductase (inaktif KR Modül 3'te not); DH-dehidrataz; ER-enoyl redüktaz; TE-tiyoesteraz. A PrpE (propionil-CoA sentetaz) ve PCC (iki protein alt üniteden oluşan propionil-CoA karboksilaz), başlangıç substrat propionil-CoA ve (2 S)-metilmalonil-CoA ekzojen propionat dönüştürmek için gereklidir. Sfp ve PrpE için genler önceden BAP1 E. içinde planlanmışlardır coli kromozom 19. Eritromisine 6dEB molekülün Dönüşüm deoxysugar biyosentezi ve eki, ek terzilik, ve öz-direnci enzimler tarafından gerçekleştirilir. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 3,. Eritromisin A biyosentez (üç DEBS genler hariç) için gerekli bireysel genlerin A. İzolasyonu. EryCI izole edilmesi için kullanılan PCR oligonükleotid primerleri de dahil olmak üzere bireysel plasmid tasarım; astar Sınırlama alanları, kalın ve tamamlayıcı sekans içinde gösterilmiştir altı çizilmiştir. Da dahil bireysel genler ve operonlar içeren sonuç pET21 ve pET28 vektörlerin kısıtlama analizidir. B. E. giriş için operonlar olarak poliketid ayarlaması için gereken biyosentetik genlerin i. Konsolidasyon .. operon yapısı ve tasarımı ile ilgili coli ii Kısıtlama site ve diğer ifade öğeleri; X / S uyumlu yapışkan xba I ligasyonu ve restricti biri tarafından tanınmayan yeni bir dizi ile sonuçlanır SPE I siteleri temsilenzim üzerinde. Şekil 3. görüntülemek için buraya tıklayın .
Şekil 4. Şekil 3 'de gösterilen tek tek genlerin A. SDS-PAGE analizi. Yıldızlarla pET28 ekspresyon vektörü kaynaklanan 5 'lideri dizileri ile ifade edilen genlerin ifade. Erme B. Fenotipik değerlendirmesi (eritromisin A direnci). E. test etmek için kullanılan katı ortam içinde eritromisin A coli suşunun bir direnç geni ile ya da Erme eritromisin olmadan Plazmitleri besleyen. Hücre büyümesi Erme ifadesi ile kurtarıldı.
Şekil 5,. Tam eritromisin A yolunun A. şematik E. tanıtıldı GroEL / ES chaperonin (pGro7) ve hem de kombinasyon, (i) ve plazmid ardışık (ii) bir giriş kullanılarak kimyasal ve elektro yöntemleri arasında bir Eryk fazladan bir kopyasını ihtiva eden plasmid. B. Dönüşüm karşılaştırma için bir plazmid içeren coli. C. transforme zorlanma Plazmid stabilitesi. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 6. Eritromisin A standart LC-MS iz A E. üretilmiş coli.
Şekil 7. I içeren filtre diskleri A. Katı faz biyoassay. Bir uninduced BAP1 E. ayıklamak coli negatif kontrol; ii ticari olarak temin eritromisin A (pozitif kontrol);.. ve iii eritromisin A indüklenmiş BAP1 E. ekstrakte coli sistemi. Diskler B. bir çim ekildi subtilis bakteri ve inhibisyon sonucu bölgeleri antibiyotik aktivite gösterir. B. Assay 96-plaka zamanlı kurs numuneleri kullanılarak sıvı faz gösterilmiştir. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
2) biyosentetik sulandırma, ve 3) ürün analizi 1) Genetik aktarım: heterolog biyosentezinde Kritik adımlar sürecinde üç usul noktaların her birinde rastlanır. Herhangi bir aşamada bir sorun heterolog biyosentezi kurulması nihai hedefi rayından olacak. Bu kesinlikle başarılı analizine olanak gerekli olduğundan Belki de sürecin en zor yanı, sulandırılmış biyosentezi kuruyor. Ancak, sulandırma nihai biyosentezi sorumlu genetik materyalin dikkatli bir tasarım ve transferi bağlıdır. Aynı şekilde, kurulan hassas analitik yöntemler (LC-MS gibi) aksi üretim eksikliği olarak yorumlanabilir küçük titresi düzeyini algılar. Bu heterolog biyosentezi zorlu kılan bu durumların sonucudur.
Eritromisin ile ilgili olarak bir örnek, PCR ile izole teyit gen dizileri tek exp için test edilmiştirönceden koordineli ifade ve doğal ürün oluşumu için genlerin pekiştirme yansıması. Ürün analizi ile ilk girişimler sırasında, ara bileşiklerin ilk chaperonin (GroEL / ES) gerekli gen kümesi ile birlikte ifade edildi sadece tespit edilmiştir. Biyosentezinin son adım (Eryk) sorumlu olan genin bir ek kopyasının dahil edildiğinde son ürünün tek üretilmiştir. Bu önlemlerin Hem başlangıçta üretiminde değerlendirmek için kullanılan hassas LC-MS analitik yöntem yararlanmıştır.
Şimdi üretim teyit edilmiştir, E. coli hücre arka plan çok sayıda mühendislik fırsatlar sunmaktadır. Bunlardan ilk doğal eritromisin A bileşiğinin üretim optimize etmektir. Bu süreç zaman ve maliyet tasarruf potansiyeli olan alternatif bir üretim rota sunacak. Ayrıca, eritromisin A yolu ürün oluşumu çeşitlendirilmesi amacıyla manipüle edilebilir. Yeni analogları sunuyoruzyeni bir antibiyotik (ya da diğer terapötik) aktivitesinin potansiyel. Bunlar aynı fırsatlar heterolog biyosentezi genel uygulamalar için var ve daha birçok orijinal üreten organizmalar ile karşılaştı zorluklar tarafından desteklenen bir yaklaşım için temel motivasyon sağlamak. Sürekli uygulamaları ve bu makalede açıklanan yaklaşım geliştirmeleri gelecekteki heterolog biyosentetik başarı sıklığı artacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Yazarlar heterolog biyosentezi adanmış projeleri desteklemek için fon NIH (AI074224 ve GM085323) ve NSF (0712019 ve 0924699) teşekkür ederim.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PCR machine | Eppendorf | Mastercycler personal | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher | BP231 | |
| Electroporator | BioRad | Micropulser | |
| IPTG | Fisher | BP1620 | |
| Sodium propionate | Sigma | P1880 | |
| L-arabinose | Sigma | A3256 | |
| Refrigerated Shaker | Thermo Scientific | MaxQ 4000 | |
| Microfuge | Eppendorf | Centrifuge 5415D | |
| pGro7 | Takara | Chaperone Plasmid Set (3340) | |
| pET21, pET28, pCDF-Duet-1 | EMD Chemicals | 69742-3, 69864, 71340 | |
| LC-MS | Applied Biosystems | 3200 Q-Trap | |
| Ethyl acetate | Sigma | 270989 | |
| Methanol | Sigma | 322415 | |
| Vacuum centrifuge | Eppendorf | Concentrator 5301 | |
| Rotary Evaporator | Buchi | R-200 |
References
- Adrio, J. L., Demain, A. L. Genetic improvement of processes yielding microbial products. FEMS Microbiol. Rev. 30, 187-214 (2006).
- Brunker, P., Minas, W., Kallio, P. T., Bailey, J. E. Genetic engineering of an industrial strain of Saccharopolyspora erythraea for stable expression of the Vitreoscilla haemoglobin gene (vhb). Microbiology. 144 (Pt. 9), 2441-2448 (1998).
- Chen, Y., et al. Genetic modulation of the overexpression of tailoring genes eryK and eryG leading to the improvement of erythromycin A purity and production in Saccharopolyspora erythraea fermentation. Appl. Environ. Microbiol. 74, 1820-1828 (2008).
- McGuire, J. M., Bunch, R. L., Anderson, R. C., Boaz, H. E., Flynn, E. H., Powell, H. M., Smith, J. W.
- Minas, W., Brunker, P., Kallio, P. T., Bailey, J. E. Improved erythromycin production in a genetically engineered industrial strain of Saccharopolyspora erythraea. Biotechnol. Prog. 14, 561-566 (1998).
- Zou, X., Hang, H. F., Chu, J., Zhuang, Y. P., Zhang, S. L. Oxygen uptake rate optimization with nitrogen regulation for erythromycin production and scale-up from 50 L to 372 m3 scale. Bioresour. Technol. 100, 1406-1412 (2009).
- Zhang, H., Boghigian, B. A., Armando, J., Pfeifer, B. A. Methods and options for the heterologous production of complex natural products. Nat. Prod. Rep. 28, 125-151 (2011).
- Cortes, J., Haydock, S. F., Roberts, G. A., Bevitt, D. J., Leadlay, P. F. An unusually large multifunctional polypeptide in the erythromycin-producing polyketide synthase of Saccharopolyspora erythraea. Nature. 348, 176-178 (1990).
- Donadio, S., Staver, M. J., McAlpine, J. B., Swanson, S. J., Katz, L. Modular organization of genes required for complex polyketide biosynthesis. Science. 252, 675-679 (1991).
- Salah-Bey, K., et al. Targeted gene inactivation for the elucidation of deoxysugar biosynthesis in the erythromycin producer Saccharopolyspora erythraea. Mol. Gen. Genet. 257, 542-553 (1998).
- Summers, R. G., et al. Sequencing and mutagenesis of genes from the erythromycin biosynthetic gene cluster of Saccharopolyspora erythraea that are involved in L-mycarose and D-desosamine production. Microbiology. 143, 3251-3262 (1997).
- Corre, C., Challis, G. L. New natural product biosynthetic chemistry discovered by genome mining. Nat. Prod. Rep. 26, 977-986 (2009).
- McAlpine, J. B. Advances in the understanding and use of the genomic base of microbial secondary metabolite biosynthesis for the discovery of new natural products. J. Nat. Prod. 72, 566-572 (2009).
- Nett, M., Ikeda, H., Moore, B. S. Genomic basis for natural product biosynthetic diversity in the actinomycetes. Nat. Prod. Rep. 26, 1362-1384 (2009).
- Oliynyk, M., et al. Complete genome sequence of the erythromycin-producing bacterium Saccharopolyspora erythraea NRRL23338. Nat. Biotechnol. 25, 447-453 (2007).
- Wilkinson, B., Micklefield, J. Mining and engineering natural-product biosynthetic pathways. Nat. Chem. Biol. 3, 379-386 (2007).
- Gokhale, R. S., Tsuji, S. Y., Cane, D. E., Khosla, C. Dissecting and exploiting intermodular communication in polyketide synthases. Science. 284, 482-485 (1999).
- Quadri, L. E., et al. Characterization of Sfp, a Bacillus subtilis phosphopantetheinyl transferase for peptidyl carrier protein domains in peptide synthetases. Biochemistry. 37, 1585-1595 (1998).
- Pfeifer, B. A., Admiraal, S. J., Gramajo, H., Cane, D. E., Khosla, C. Biosynthesis of complex polyketides in a metabolically engineered strain of E. coli. Science. 291, 1790-1792 (2001).
- Lee, H. Y., Khosla, C. Bioassay-guided evolution of glycosylated macrolide antibiotics in Escherichia coli. PLoS Biol. 5, e45 (2007).
- Peiru, S., Menzella, H. G., Rodriguez, E., Carney, J., Gramajo, H. Production of the potent antibacterial polyketide erythromycin C in Escherichia coli. Appl Environ Microbiol. 71, 2539-2547 (2005).
- Peiru, S., Rodriguez, E., Menzella, H. G., Carney, J. R., Gramajo, H. Metabolically engineered Escherichia coli for efficient production of glycosylated natural products. Microbial Biotechnology. 1, 476-486 (2008).
- Zhang, H., Skalina, K., Jiang, M., Pfeifer, B. A. Improved E. coli erythromycin a production through the application of metabolic and bioprocess engineering. Biotechnol. Prog. 28, 292-296 (2012).
- Zhang, H., Wang, Y., Wu, J., Skalina, K., Pfeifer, B. A. Complete biosynthesis of erythromycin A and designed analogs using E. coli as a heterologous host. Chem. Biol. 17, 1232-1240 (2010).
- Kieser, T., Bibb, M. J., Buttner, M. J., Chater, K. F., Hopwood, D. A. Practical Streptomyces Genetics. , The John Innes Foundation. Norwich, UK. (2000).
