Summary
Para entender uma ligação entre a resposta imune e comportamento, nós descrevemos um método para medir o comportamento locomotor em
Abstract
A interacção complexa entre a resposta imune e comportamento hospedeiro tem sido descrito em uma grande variedade de espécies. Excesso de sono, em particular, é conhecida a ocorrência de uma resposta à infecção em mamíferos 1 e recentemente também tem sido descrita em Drosophila melanogaster 2. É geralmente aceite que o sono é benéfico para o hospedeiro durante a infecção, e que é importante para a manutenção de um sistema imunológico robusto 3,4. No entanto, a evidência experimental que suporta esta hipótese é limitada 4, e a função do sono em excesso durante uma resposta imune permanece obscura. Nós usamos uma abordagem multidisciplinar para resolver este problema complexo, e realizaram estudos no sistema modelo simples genética, a mosca da fruta Drosophila melanogaster. Usamos um ensaio padrão para medir o comportamento locomotor e do sono em moscas, e demonstrar como este ensaio é utilizado para medir o comportamento de moscas infected com uma estirpe patogénica de bactérias. Este teste é também útil para monitorizar a duração de sobrevivência em moscas individuais durante uma infecção. Medidas adicionais de função imunitária incluem a capacidade de moscas para limpar uma infecção e à activação de NFkB, um factor de transcrição essencial, que é essencial para a resposta imune inata em Drosophila. Tanto resultado da sobrevivência e depuração bacteriana durante a infecção em conjunto são indicadores de resistência e de tolerância à infecção. Resistência se refere à capacidade de moscas para limpar uma infecção, enquanto que a tolerância é definida como a capacidade do hospedeiro para limitar os danos de uma infecção e, assim, sobrevivem apesar dos níveis elevados de agentes patogénicos no interior do sistema 5. Monitoramento em tempo real da atividade NFkB durante a infecção fornece insights sobre um mecanismo molecular de sobrevivência durante a infecção. O uso de Drosophila nestes ensaios simples facilita as análises genéticas e moleculares do sonoe a resposta imune e como estes dois sistemas complexos são reciprocamente influenciadas.
Protocol
Este protocolo utiliza duas configurações (Figura 1) para adquirir quatro leituras diferentes recolhidos de moscas submetidos a uma infecção bacteriana. Estas saídas incluem 1) sono / vigília comportamento, 2) O resultado da sobrevivência, 3) a carga bacteriana em tempo real, e 4) em tempo real a medição de actividade de NFkB repórter in vivo. Em combinação com as ferramentas genéticas que estão disponíveis em Drosophila, estas medições fornecem uma visão mecanicista para a ligação molecular entre a função imunológica e no comportamento.
1. Atividade medida Locomotor e do sono nas moscas
- A configuração utilizada para medir a atividade locomotora e dormir em moscas, que inclui o sistema de monitoramento de atividade de Drosophila (DAM2, Trikinetics), incubadoras, quarto escuro, ea preparação de animais experimentais e tubos de atividade, tem sido descrito anteriormente 6. A mesma abordagem é usada aqui, com algumas pequenas modificações.
- Tubos de actividade são limpos para reutilização por ebulição numa placa quente, em água desionizada. Uma pequena quantidade de detergente é adicionado para a primeira fervura, os tubos são bem enxaguados e fervido duas vezes mais. Se fio é utilizado para ligar o tubo, os tubos da actividade utilizados (contendo comida, cera de mosca, e os fios) pode ser limpo sem remoção prévia dos fios.
- Antes de se iniciar um ensaio, as culturas contendo lugar de pupa tardia encenado moscas em incubadoras de três a quatro dias para se adaptar a iluminação experimental e outras condições ambientais. Light: condições escuras ou constante têm sido comumente usado para medir o comportamento do sono. Neste exemplo, as moscas são aclimatadas à luz constante para eliminar a influência do relógio circadiano sobre a resposta imune e comportamento 2,7,8. Tal como descrito na Figura 1A 6, e registo durante um mínimo de três dias antes da infecção.
2. Moscas infectar com uma cepa patogênica de bactérias
- O protocolo aqui descrito é específico para o S. marcescens, que são fáceis de cultivar e manter. Protocolos para a armazenagem a longo prazo e as condições de cultura para outras espécies de bactérias podem variar. S. marcescens são armazenados em glicerol a 15-50% à temperatura de -80 ° C. Para preparar para a armazenagem a longo prazo, misturar 2 volumes de cultura bacteriana durante a noite (DO600 = 0,5 - 1,0) para 1 volume de glicerol a 50% autoclavada em tubos de microcentrífuga de 1,5 ml. Isto irá resultar numa concentração final de glicerol de 17%. Armazenar os tubos a -80 ° C. Para preparar um curto prazo na utilização de fonte de bactérias, raspar o material congelado com uma ponta de pipeta estéril de 200 ul e realizar uma sequência de três vias numa placa de agar LB. Incubar a placa durante a noite a 37 & dpor exemplo, C para obter colónias isoladas. Armazenar a placa a 4 ° C.
Um dia antes da infecção programada, escolher uma única colónia da placa de agar LB com um ponta de pipeta estéril de 200 uL e submergir a ponta para um tubo de cultura que contém 5 ml de meio LB. Bactérias crescem durante a noite, ou até 16 horas dentro de um agitador de incubador a 37 ° C e 250 rpm até que ele atinja a fase de crescimento exponencial. Medir a concentração com um espectrofotômetro a OD 600. A concentração desta fase varia de 0,5 a 1. Se a concentração for demasiado elevada, a subcultura das bactérias e crescem durante mais várias horas, para obter uma concentração óptima. Execute o procedimento perto de uma fonte de chama. Algumas estirpes bacterianas foram concebidas para a resistência aos antibióticos e são cultivadas e seleccionadas para antibiótico apropriado adicionado ao meio. S. marcescens (ATCC # 8100) não são resistentes a antibióticos e por isso são cultivadas em meio estéril, sem antibiótico. Para verificar técnica estéril, fazer um simulado culture sem bactérias, como controlo.
A solução para infectar moscas contém bactérias (diluído para 0,1 OD = 600) e coloração de alimentos a 1% (Brilliant Blue FCF) em PBS. Prepara-se uma solução de controlo de injecção por adição de quantidade equivalente de meio LB utilizado em solução infecção e corante alimentar azul a 1% em PBS. Armazenar as soluções em gelo. - Prepare agulhas de vidro para injetar as moscas. Puxe capilares de vidro (od = 1 mm, id = milímetros 0,58, WPI) para uma ponta fina usando um extrator micropipeta (Narishige). Sob um microscópio de dissecação, utilizar uma pinça fina para quebrar a ponta da agulha de modo que a abertura é grande o suficiente para encher com o líquido de injecção através da aplicação de sucção com uma seringa, mas suficientemente pequena para minimizar os danos para a mosca durante o processo de injecção. Depois de romper a ponta, o tamanho da ponta deve ser cerca de 40-50 ^ m. A agulha de vidro é ligada a uma seringa de plástico de 3 cc, com uma extensão de tubagem. O fluxo de meio de injecção é controlado manualmente a aplicação de pressão positiva ou sução com a seringa. Evitar a contaminação do tubo de borracha com o fluido de injecção, como o aparelho de seringa é utilizado tanto para a infecção e as injecções de controlo.
- Anestesiar moscas, colocando-os em um bloco de CO 2. CO 2 é passado através de um recipiente selado de água para humedecer a almofada e para reduzir a electricidade estática, o que pode complicar a manipulação de moscas sobre a almofada. Injectar moscas picando a agulha de vidro na região acima do escutelo do tórax dorsal. A passagem do meio de injeção na mosca é verificada pela coloração de alimento - as moscas ficam azuis como os spreads corante alimentar através do sistema. A dose de bactérias que as moscas recebem podem ser quantificados como descrito na Seção 3, abaixo. Alguns projetos experimentais incluir um grupo controle que recebe lesão asséptica injetando moscas com coloração PBS e comida, mas sem bactérias.
3. Determinar a carga bacteriana
Uma abordagem para evaluating a resposta imune contra a infecção bacteriana é determinar a infecção bacteriana pós carga. D. melanogaster é um excelente modelo para determinar este parâmetro, porque a mosca inteira pode ser homogeneizado para estimar o número total de bactérias dentro de um indivíduo. A lógica por trás deste protocolo é de que, quando cultivadas em meio sólido tal como caldo de Luria (LB) agar em placas de Petri (placa LB), uma única bactéria forma uma colónia visível distinguíveis. Portanto, por homogeneização moscas infectadas em meio líquido LB, gerando uma série de diluições do homogeneizado, e espalhando o homogeneizado diluído em placas de LB, o número de células bacterianas que infectam uma mosca pode ser determinada. Um grupo de controlo de moscas injectadas com PBS e corante alimentar, mas sem bactérias deve ser usada para verificar se a infecção não foi contaminada com outras espécies bacterianas. Não deve haver colónias na placa de agar LB nesta condição.
- Autoclavar todos os materiais que irão ser utilizados para estaprocedimento antes de realizar o passo de homogeneização real. Isso inclui 200 dicas Pipetar cortadas com tesoura, mídia LB, e pilões utilizados para a homogeneização. Preparar as placas vertendo meio LB / agar autoclavada em 10 centímetros placas de Petri estéreis, pelo menos, 1 dia antes da homogeneização moscas.
- Anestesiar moscas e recolher em 1,5 ml tubos de microcentrífuga e tubos armazenar em gelo.
- Realizar a homogeneização perto de uma chama para evitar a contaminação. A homogeneização de controlo contendo moscas sem infecção é recomendada em especial quando se utiliza uma estirpe bacteriana tal como S. marcescens, que não são resistentes a antibióticos. Homogeneizar um mínimo de 2 grupos de 10 moscas cada condição experimental por. O número de moscas utilizadas por homogenato é determinado pelo experimentador. Alguns grupos utilizaram uma mosca por homogenato, o qual é útil para avaliar a variação na carga bacteriana entre moscas individuais 8, ao passo que outros autores utilizaram 3-10 moscas por homogenatoa comparação entre o genótipo ou condição experimental 9-12.
- Adicionar 400 ul de meio LB a cada tubo de microcentrífuga contendo moscas e homogeneizar utilizando um pequeno motor e um pilão (Kontes).
- Usando pontas de pipetas estéreis cortadas, serial diluir a 1:10 homogenado por adição de 20 ul de homogeneizado meio LB / bacteriano a 1,5 ul de tubo de microcentrifugadora contendo 180 ul de meio LB. Cortar as pontas da pipeta impede o bloqueio de detritos mosca e assegura que um volume adequado está a ser transferido.
- Factor de diluição é determinado empiricamente e dependerá do genótipo da mosca, a estirpe bacteriana utilizada, e da condição experimental. Para o tipo selvagem moscas infectadas com S. marcescens, utilizar as diluições de 1:10 ou 1:10 2 3 para moscas homogeneizadas imediatamente após a infecção e, em diluições de 1:10 ou 1:10 4 5 para moscas homogeneizado 24 horas pós-infecção.
- Adicionar 100 ul de LB / média bacteriana a partir do microfonetubos contendo rocentrifuge diluição final e espalhar o meio sobre uma placa de LB usando esferas de vidro (VWR) para assegurar uma distribuição uniforme.
- Descartar as bolas de vidro em 100% de solução de EtOH. Colocar as placas de LB numa incubadora a 37 ° C durante a noite.
- Como etapa opcional, utilizar um sistema de imagem de luz visual para obter uma imagem das placas de LB (FluorChem 8900; Alpha Innotech). Contar o número de colónias ou no prato em si ou a partir da imagem da chapa usando a ferramenta de contar com o software Photoshop (Adobe Photoshop CS3).
- Calcula-se o número de unidades formadoras de colónias por mosca utilizando a fórmula: [n / (N * D * v)] * V, onde n = número de colónias que cresceram na placa de LB, N = o número de moscas agrupados num tubo de microcentrífuga, D = factor de diluição, e v = volume da solução espalhada sobre cada placa; V = volume inicial do homogeneizado.
4. Avaliar sono e Duração sobrevivência após infecção
- Paramoscas que não são colhidas para medir a carga bacteriana, continue monitorando o comportamento por mais 7-10 dias. Duração sobrevivência é influenciada pelo genótipo da mosca, condições ambientais e espécies de bactérias utilizadas para a infecção.
- Depois de ~ 10 dias, terminar o experimento, baixar e processar dados comportamentais como descrito anteriormente 6. Insomniac2 software personalizado, que é baseado em Matlab, é usado para analisar parâmetros do sono. É importante eliminar moscas mortas da análise comportamental. Normalmente, isto restringe a análises para dentro do primeiro dia após a infecção, dependendo do tipo de infecção e do genótipo da mosca. Morte no ensaio é indicado pelo tempo de todas as contagens de actividade atingiu zero. Para facilitar a análise de sobrevivência, Drosonex, software personalizado escrito em Microsoft Visual C + + 6.0, é usada para processar arquivos de dados brutos do sistema DAM Trikinetics. Os relatórios do software como arquivos de Excel, duração sobrevivência de cada mosca (em horas), compila atividade data partir de todos os monitores em uma única planilha, e relata a sobrevivente voa por cento ao longo do tempo, conforme definido pelo usuário. Os arquivos do Excel são projetados para integrar em outros pacotes de software estatísticos para análise posterior.
5. Medir actividade de NFkB durante a infecção usando um ensaio de repórter de luciferase
Transgenic kB-luc moscas utilizadas neste ensaio foram gerados como descrito anteriormente em Kuo et al., 2010 2. Resumidamente, o repórter kB-luc contém oito repetições de uma sequência de ligação de NFkB, que foram inseridos em um promotor a montante de um quadro de leitura aberta de luciferase.
- Ajuste moscas às condições de iluminação experimentais, como descrito na seção 1.2. Neste exemplo, 1-4 dias de idade kB-luc moscas são alojados em frascos contendo 5% de sacarose, 2% de meio de alimento agar e colocadas em luz constante (LL), durante 2 dias, para atingir a mesma idade de outras moscas durante a infecção.
- Prepara-se uma microplaca de 96 poços para as moscas. Cada poço contém 2 camadas de meio de alimento (Figura 2), a camada de topo contém a luciferina, o substrato da luciferase. Adicionar 300 ul de sacarose a 5%, solução de agar a 2% a cada poço e deixa-se solidificar. Em seguida, adicionar uma camada de 50 ul de topo de cada uma das cavidades contendo sacarose a 5%, ágar a 1%, e 2 mM de luciferina (Gold Biotechnology, Inc.). Concentrações de luciferina utilizadas para a actividade repórter de medição em Drosophila têm variado na literatura, e têm sido tão baixas quanto 100 uM 13. A concentração necessária pode ser determinada empiricamente. Entre as camadas de distribuição de alimentos, cobrir a placa com um tecido de malha fina para facilitar a secagem, mantendo a esterilidade. A placa deve ser deixado secar completamente, até uma hora, a fim de evitar que as moscas de ficar presa em forma de gotas de condensação. Porque luciferina é sensível à luz, evite expor as placas à luz mais do que o necessário.
- Aplique uma película adesiva (Superior-Seal-A; Perkin Elmer) a uma placa de micropoços de 96 poços e perfurada com uma agulha fina com uma quantidade de 2 orifícios por poço. Estes buracos não só permitir a troca de ar a cada poço, mas também irá fornecer uma forma de anestesiar moscas em uma base individual. Usando uma lâmina afiada e borda em linha reta, introduzir um corte entre cada coluna. Isto irá proporcionar uma forma fácil de carregar / descarregar as moscas em grupos de 8 de cada vez.
Para carregar as moscas para a microplaca, retire os frascos da incubadora e moscas anestesiar sobre uma almofada de CO 2. Carga voa um por um para cada poço, coluna por coluna. Se um voar inadvertidamente ficar preso ao selo adesivo, deixar a voar sozinho como eles são capazes de libertar-se sem intervenção. Voltar a microplaca para a incubadora no LL de 8-24 horas para se ajustar ao novo ambiente e para consumir o substrato luciferina. - Cultura de bactérias, S. marcescens, e preparar uma solução para a infecção, tal como descrito acima.
- Anestesiar tvoa usando uma ponta de micropipeta ligada a uma baixa pressão de linha de CO 2. Colocar a ponta da micropipeta directamente por cima dos orifícios de ventilação feitas para cada poço. Tomar cuidado para assegurar que a pressão de CO 2 é suficientemente elevada para anestesiar a mosca, mas baixa o suficiente para evitar danos à mosca. Em grupos de oito, cada mosca transferir individualmente para uma almofada de CO 2, e infectar como descrito acima. Após a infecção, o retorno de cada mosca ao seu original e feche bem a microplaca.
- Luminescência medida (TopCount NXT-luminescência e Contador de Cintilação; Perkin-Elmer). O contador de luminescência TopCount contém uma cassete de empilhamento de chapas, o que permite leituras programadas e automatizadas continuamente em incrementos desejadas para qualquer período de tempo (geralmente superior a cinco dias). Este recurso não está disponível em todos os instrumentos, e coleta de dados para experimentos realizados com outros instrumentos podem, portanto, ser menos frequentes. O contador de luminescência é abrigado em um room com uma temperatura controlada e horário de iluminação. Ao carregar as placas para a cassete de empilhamento, empilhar as placas contendo as moscas claras entre placas em branco para garantir que as moscas recebem luz. Luminómetro programa de acordo com as especificações do fabricante para recolher as leituras de hora em hora durante um mínimo de 24 hr. Neste exemplo, os detectores são programados para ler cada poço por 10 seg e expressar o resultado como contagens (em unidades arbitrárias) por segundo. Este valor é a média entre 3 leituras por poço. Exportar os arquivos de dados para uma planilha e realizar uma análise padrão, gráficos os resultados de luminescência.
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Representative Results
- Infecção promove o sono. Neste exemplo, Canton-S (CS) moscas do tipo selvagem e moscas mutantes desprovidos de um gene NFkB, Relish (Rel E20) 14, foram carregados em dois DAM2 monitores de actividade (n = 32 para cada genótipo) e infectadas, como descrito acima. As moscas foram mantidas em luz constante para eliminar a influência do relógio circadiano no comportamento e infecção 2,7,8. Os mutantes foram isogenized E20 Rel de CS, tal como descrito previamente 11. Ambos os conjuntos de moscas foram infectados com S. marcescens e os resultados estão representados na Figura 3. Em alguns casos, um grupo de controlo adicional tratado é útil para diferenciar os efeitos de manipulação do efeito de infecção 2. Grupos de controlo tratados são expostos às mesmas alterações ambientais como os grupos infectados, o que inclui a remoção de incubadoras e anestesiados durante o mesmo período de tempo, mas que não recebem uma injecção. No entanto, neste exemplo, é evidente que a Rel E20 mutantes experimentar menos sono que voa CS controle após a infecção (Figura 3A). Como descrito anteriormente 6, existem outros parâmetros comportamentais que podem ser medidos a partir do ensaio BARRAGENS. Estes podem incluir a contagem de actividade total por unidade de tempo (Figura 3B). Neste exemplo, a mudança na actividade após infecção que os espelhos de sono. Nós também relatam taxa de atividade, ou atividade conta por minuto de vigília (Figura 3C). Este parâmetro é um indicador da capacidade locomotora em moscas. Neste caso, a taxa de actividade de vigília não alterar em qualquer genótipo durante a infecção, o que sugere que a redução da actividade ou o aumento do sono não é um resultado da capacidade locomotora reduzida.
- A Figura 4A mostra a taxa de sobrevivência após a infecção. Consistentes com descobertas anteriores 14,15, Rel E20 mutantes rapidamente sucumbir à noinfecção, em comparação com as moscas de tipo selvagem. Mais moscas sobreviveram à injecção asséptica controlo (Figura 4B), indicando que as moscas sucumbiu à infecção, e não para o ferimento, devido à injecção. Porque os mutantes Relish morreu tão rapidamente, moscas CS apenas foram utilizados para demonstrar a carga bacteriana após a infecção (Figura 5). Figura 5 mostra que S. marcescens continua a proliferar na mosca hr 24 após a infecção.
- Actividade repórter da luciferase é representada ao longo do tempo no ensaio em quatro moscas individuais (Figura 6). Grande variação entre os pontos de dados individuais e moscas pode ser atribuído a que as moscas que se deslocam em torno de dentro dos poços. Embora o sinal é derivado a partir de todos os tecidos no interior da mosca, não é esperado que todos os tecidos que libertam a mesma quantidade de sinal, e a visibilidade do tecido para o detector que variam à medida que a mosca. Neste exemplo, as moscas foram infectadas e comparadoscom um grupo de controlo tratado. As moscas que morreram foram excluídos da análise através de um grupo de moscas mostrado na Figura 7A. Moscas mortas são determinadas por inspeção visual. Nestes moscas, há uma queda brusca no sinal de luciferase, assim como uma diminuição na variação do sinal, indicando que a mosca não está em movimento. KB-luc actividade repórter de forma constante aumenta após a infecção (Figura 7A) e de lesão asséptica (Figura 7B ). O repórter picos de atividade em torno de 12 horas pós-lesão e pós-infecção. Manipulações genéticos e / ou comportamentais de moscas são esperados para modificar kB-luc actividade repórter durante a infecção. Por exemplo, nós descrito anteriormente 2, que a indução da kB-luc actividade repórter foi grandemente atenuada durante a infecção em Rel E20 mutantes, indicando que este repórter kB-luc é específico de NFkB.
Figura 1. Fluxograma que descreve os passos principais de medir as respostas imunes em Drosophila (A) A sequência de passos é delineada para o sono de medição, a sobrevivência e a carga bacteriana durante a infecção,. (B) A sequência dos passos é descrito para a medição de NFkB dependente actividade repórter da luciferase durante a infecção. Experimentos pode continuar em qualquer lugar de 1-5 dias, dependendo da taxa de letalidade da espécie bacteriana utilizados.
Figura 2. Moscas esquemáticas de uma microplaca de poços individuais. São colocados em opaco, placas de 96 poços contendo meio e cobertos, como mostrado. Porque moscas serão tratados individualmente para ser infectado, é importante tó restringir o número de moscas por placa para um valor que possa ser razoavelmente gerida dentro de um determinado período de tempo, dependendo das circunstâncias experimentais.
Figura 3. Resposta comportamento de moscas infectadas com S. marcescens. (A) Média ± SEM por cento do tempo de sono gasto que voa e (B) Média ± SEM contagens de actividade total são traçados em incrementos de 4 h para um dia antes e após infecção com S. marcescens. (C) Média ± SEM atividade conta por minuto de vigília antes (BL = baseline) e após a infecção com S. marcescens é representada em 8 incrementos hr. Comportamento é relatado para moscas do tipo selvagem CS que sobreviveram durante pelo menos 24 horas após a infecção, e para imuno-deficiente Rel E20 voa that sobreviveram durante pelo menos 8 horas após a infecção. n = 13 para CS e para Rel E20. ** = P <0,01 e * = p <0,05, t de Student - teste.
Figura 4. O resultado da sobrevivência das moscas infectadas e não infectadas. (A) curvas representativas de Kaplan-Meier foram determinadas para ambos do tipo selvagem CS e imuno-deficientes moscas E20 Rel que foram infectados com S. marcescens. p = 8.13x 10 -13, teste log rank. n = 31 para CS e n = 32 para as moscas E20 rel. (B) as curvas representativas de Kaplan-Meier foram relatados como em (A), excepto as moscas recebido ferimentos por injecção asséptica com meios líquidos sem bactérias. Quase todas as moscas sobreviveram lesão asséptica até ao fim das experiências (60 pós ferimento hr). p> 0,97, log rank teste, n = 32 para CS e Rel E20 moscas.
Figura 5. Quantificação da carga bacteriana nas moscas infectadas com S. marcescens. (A) Representante cultura bacteriana de CS moscas infectadas com S. marcescens, que foram colhidas imediatamente após a infecção (painel esquerdo), ou 24 horas após a infecção (painel direito). Factores de diluição são indicados abaixo de cada figura. Neste exemplo, a 10 moscas foram homogeneizados em 400 ul de solução para cada grupo. 100 ul da solução final foi espalhada em cada prato. A placa esquerda contém 29 unidades formadoras de colónias (ufc). Para calcular cfu / voar, dividir por 29 cfu [10 moscas * 0,001 (factor de diluição) * 100 ul (volume de propagação na placa)], que é igual a 29, e depois multiplicar pelo volume inicial de 400 uL = 11600. Para esta placa particular, têm uma média de 1,16 x 10 4cfu / mosca. A placa de direito contém 257 colônias. Usando a mesma fórmula, encontramos uma média de 1,03 x 10 6 ufc / mosca. (B) Depois de calcular cfu / mosca de cada placa em cada condição experimental, gerar-box e-Whisker imediata. Neste exemplo, o percentil, 25 50 (mediana) e 75 são apresentados como o fundo, meio e topo da caixa. As barras de erro representam o desvio padrão através de três experimentos independentes. ** P <0,01 aluno teste t.
Figura 6. NFkB atividade dependente repórter luciferase em moscas individuais infectados com S. marcescens. exemplos representativos de dados brutos são mostrados para cada moscas não infectados (controle manipulados; painéis da esquerda) e moscas infectadas (painéis da direita). Uma leitura inicial (tempo '0 ') foi realizada imediatamente antes da infecção ou manipulação; todos os outrosOs pontos de tempo foram recolhidas após as moscas foram tratadas. Observe as diferenças de escala nos eixos-y entre moscas em condições de controle infectados e tratados. Grande variação do sinal dentro de cada mosca pode ser atribuída ao movimento das moscas dentro da microplaca.
Figura 7. A infecção com S. marcescens ou ferimentos com injecção asséptica aumenta kB-luc actividade repórter nas moscas vivas. Média ± SEM actividade da luciferase (unidades arbitrárias) é representada a cada 4 h em todas as moscas que foram infectados (A) ou feridas por injecção asséptica (B) e sobreviveram até a 24 no ensaio. One-way ANOVA com medidas repetidas indicou que a atividade repórter aumentou significativamente em infectado (p <0,05), feridos (inj, p <0,01), e sua con tratadocontrole (HC, p <0,01) grupos com relação à sua linha de base (tempo de '0 '; Tukey post-hoc). (Insert, painel A): Os dados do grupo HC são plotados em uma escala diferente. O pequeno mas significativo aumento na actividade repórter no grupo HC sugere que as moscas podem ter experimentado estresse leve ou aumentou a vigília de manuseamento (transferência de e para a placa de microcavidades e equivalente anesthetization para moscas infectadas). Ambos os grupos infectados e os lesada foi induções fortes de kB-luc actividade repórter que foram significativamente maiores do que no grupo HC em pontos de tempo indicados * = p <0 0,05; ** = p <0,01 0,. T de Student - de ensaio; Para (A) n = 20 n = HC e 13 Infecção; para (B), n = 15 e n = HC 14 lesão.
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Discussion
Este protocolo descreve uma abordagem para investigar como o comportamento, particularmente dormir, está ligada a parâmetros de resposta do sistema imunológico. Estes parâmetros incluem a carga bacteriana, resultado da sobrevivência e actividade de NFkB, como medido por um repórter de luciferase in vivo. Juntos, esses parâmetros fornecem informações sobre o quão bem uma mosca pode lutar contra uma infecção. A carga bacteriana e os resultados de sobrevivência são parâmetros da resposta imune que envolvem uma medição simples em Drosophila. Rel E20 mutantes, que não possuem um factor de transcrição NFkB, que é central para a resposta imune, sucumbem rapidamente à infecção bacteriana. Manipulações genéticas ou outras de comportamento também pode influenciar esses parâmetros de resposta do sistema imunológico, possivelmente afectando a actividade NFkB em si. Por exemplo, privação de sono antes da expressão de mRNA infecção aumenta Relish, e reduz ufc / voar em relação ao não-carentes controles 11. Mutants dos genes do relógio, o período de 7 e 8 atemporal, também foram relatados para reduzir a sobrevivência durante uma infecção, bem como desembaraço bacteriana 8. Outros estudos que utilizam esta abordagem são esperados para fornecer uma visão mecanicista de como o comportamento pode influenciar a função imune.
A técnica de injecção / infecção descrevemos aqui é modificada a partir de um método anteriormente descrito por Wu et al 16. Este procedimento é simples e barato. No entanto, uma desvantagem é que o controlo manual do volume de injecção com a utilização de corante como indicador é crua e pode contribuir para a variabilidade. Outros grupos têm utilizado um microinjector para permitir um volume de injecção constante de 17, ou ter esfaqueado moscas com uma agulha mergulhada em cultura bacteriana 18. No entanto, o método aqui apresentado tem tido sucesso na detecção de alterações na depuração bacteriana nas diferentes condições experimentais 11,19 </ Sup>.
A sobrevivência das moscas durante a infecção é normalmente quantificada por contagem das moscas restantes a intervalos regulares de tempo. Aqui usamos o sistema DAM Trikinetics para monitorar o tempo de morte, em moscas individuais, o que é indicado pela cessação da actividade. Temos verificado que o resultado da sobrevivência, tal como determinado por actividade locomotora é o mesmo que o determinado por inspecção visual de moscas nas trompas de atividade durante a infecção (não publicado). Este método também tem sido utilizada anteriormente para medir a duração de vida 20,21. No entanto, é importante notar que a avaliação da sobrevivência no sistema DAM é limitada a esse isolado de moscas, e que os resultados obtidos com esta condição devem ser diferentes daqueles em condições agrupados. Os primeiros estudos têm mostrado diferenças na sobrevivência quando o anfitrião é colocado em grupos versus condições isoladas 22. Um trabalho recente confirmou também que tempo de vida em grupos de moscas é maiordo que em moscas isoladas 20.
Actividade repórter de luciferase foi usado anteriormente para a análise de expressão de gene em moscas relógio de vida (por exemplo, ref 23). Nestes casos, outras considerações técnicas são necessárias, em particular a depleção do substrato luciferina, que ocorre ao longo de vários dias de realização do ensaio. Em contraste, o ensaio aqui descrito é limitada para a sobrevivência das moscas infectadas e envolveu uma medição simples ao longo de 24 horas após a infecção. A ANOVA de medidas repetidas foi suficiente para avaliar as alterações da linha de base dentro de cada grupo. Abordagens estatísticas para análise de uma oscilação circadiana dos repórteres luciferase, juntamente com medidas de normalização para corrigir a depleção de substrato são discutidos em outro lugar 24. Em ambos os casos, a medição em tempo real, a actividade repórter nas moscas individuais é um método mais eficiente para a extracção de informação acerca das suas dinâmicas temporais de standard ensaios bioquímicos e imuno-histoquímico.
No entanto, uma desvantagem potencial para monitorizar a actividade repórter da luciferase in vivo é que é dependente de moscas que comem o substrato luciferina. Anorexia tem sido associada com a infecção em moscas, e de alimentação pode também variar com o tipo de infecção ou de entre os genótipos 25. Para contornar a preocupação com a ingestão do substrato, as moscas podem ser dissecado em partes do corpo separadas ou tecidos após a infecção, e a actividade repórter pode ser medido em cultura, tal como descrito previamente 26. Alternativamente, os resultados do ensaio de luciferase pode ser verificado através de um ensaio padrão que não depende de alimentação. Por exemplo, a PCR quantitativa foi um método comumente usado para medir níveis de expressão de mRNA de péptidos antimicrobianos (AMP). AMPs são alvos conhecidos de NFkB, e, portanto, indicar o seu nível de atividade.
O representante dataqui descrito um recapitular trabalho anterior mostrando que NFkB aumenta com desafio imunológico e um aumento subsequente da suspensão 2. No entanto, os leitores são advertidos de que o sono no sistema DAM Trikinetics é indicado por inatividade para um mínimo de cinco minutos consecutivos 27. Medição de sono na mosca por videografia também depende de inatividade 28. Esta definição de sono em moscas podem ser potencialmente problemática durante uma infecção, uma vez que também é conhecido que os animais desafiados imune se torne inactivo durante longos períodos sem dormir 29. Para superar este problema, os ensaios que a responsividade medida sensorial são necessários para verificar se as moscas são realmente dormindo. Os investigadores determinaram a resposta das moscas a estímulos sensoriais, tais como um lápis de torneira 30, que escovam os tubos de actividade com uma vara de madeira 31, ou o aquecimento das extremidades de um tubo 27. Em todos os casos, as moscas de sono são menos sensíveis (medidaquer por latência de resposta ou por cento voa responder como um grupo) que moscas acordados. Nós descobrimos que as moscas que são infectadas de dormir são de facto menos sensíveis a estímulos sensoriais até 6-8 horas pós-infecção (Th. Kuo e JA Williams, observação não publicada). Apesar das limitações técnicas, o sistema DAM Trikinetics proporciona uma vantagem de alto rendimento que será útil para futuros estudos em moscas que exploram uma ligação genética e molecular entre o sono ea função imunológica.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation, Grant # IOS-1025627 e pelo Instituto Nacional de Saúde sob concessão # 1R21NS078582-01 a JAW
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Incubators | Percival Scientific, Inc. | I30BLLC8 I36VLC8 |
Any incubator capable of running programmed light/temperature schedules is appropriate. |
| Drosophila Activitiy Monitors | Trikinetics Inc., Waltham, MA | DAM2 | As described elsewhere6, this system requires a computer interface, software, and other accessories. |
| Pyrex Glass Tubes | Trikinetics Inc., Waltham, MA | PGT-5x65 | |
| Microplate scintillation and luminescence counter | Perkin Elmer | TopCount NXT 12 detector |
Any microplate reader capable of detecting luminescence can be used for this type of reporter assay. TopCount contains multiple detectors and an automated stacker; it is capable of being programmed to read continuously from multiple plates. |
| FluorChem 8900 | Alpha Innotech | Imaging of bacterial cultures is optional; any digital imaging system with visual light capability is sufficient. | |
| Micropipette Puller | Tritech Research, Inc. | Narishige PC-10 | |
| Supplies | |||
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instrument Inc. | 1B100F-4 | |
| 3 ml Syringe | Fisher Scientific | BD 305482 | |
| Syringe Needles | Fisher Scientific | BD 305196 | 18 G - cut off the tip of the needle to prevent damage to the tubing. |
| Silicone Tubing, i.d. (0.030") o.d. (0.065") Wall Thickness (0.018") | VWR | 60985-706 | Used for attaching glass capillary needles to a syringe |
| 3 Way Stopcock | American Pharmaseal Company | K75 | |
| Kontes Pellet Pestle Cordless Motor | Fisher Scientific | K749540-0000 | |
| Kontes Pellet Pestle | Fisher Scientific | K749521-1590 | |
| Glass balls 3mm | VWR | 26396-630 | |
| Microplate Microlite 1+ | Thermo Scientific | 7571 | Select 96-well plates that are appropriate for luminescence - they must be opaque. |
| TopSeal-A:96-well Microplates | PerkinElmer | 6005185 | Microplate Press-On Adhesive Sealing Film |
| D-Luciferin, Potassium Salt | Gold BioTechnology, Inc. | LUCNA | |
| Software | |||
| Insomniac2 | Available upon request to the authors | custom; written by Lesley Ashmore, Ph.D. (Westminster College) | Matlab based software that has been used routinely for analysis of sleep2,6,11 |
| Drosonex | Available upon request to the authors | custom; written by Thomas Coradetti (Sidewalk Software) | A PC MSVC6 program used for survival analysis from raw data files collected with the Trikinetics system |
| Photoshop CS3 | Adobe | Useful for obtaining numbers of cfu/plate from digital images (optional) | |
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