För att förstå en koppling mellan immunförsvaret och beteende, beskriver vi en metod för att mäta motorisk beteende<em> Drosophila</em> Under bakteriell infektion samt förmåga flugor att montera ett immunsvar genom övervakning överlevnad, bakteriell belastning, och i realtid aktivitet hos en viktig regulator av medfödd immunitet, NFkB.
En komplex interaktion mellan immunsvaret och värd beteende har beskrivits i ett brett spektrum av arter. Överskott sömn, i synnerhet, är känd att inträffa som en följd av infektion hos däggdjur 1 och har även nyligen beskrivits i Drosophila melanogaster 2. Det är allmänt accepterat att sömnen är fördelaktigt för värden under en infektion och att det är viktigt för upprätthållandet av ett stabilt immunsystem 3,4. Emellertid är experimentellt bevis som stöder denna hypotes begränsad 4, och funktionen av överskott sömn under ett immunsvar är fortfarande oklart. Vi har använt ett tvärvetenskapligt synsätt för att ta itu med detta komplexa problem, och har genomfört studier i den enkla genetiska modellsystem, den fruktflugan Drosophila melanogaster. Vi använder en vanlig analys för att mäta motorisk beteende och sova i flugor, och visa hur denna analys används för att mäta beteende i flugor infected med en patogen stam av bakterier. Denna analys är också användbar för att övervaka varaktigheten av överlevnad i enskilda flugor under en infektion. Ytterligare åtgärder för immunförsvaret inkluderar möjligheten av flugor för att rensa en infektion och aktivering av NFkB, en viktig transkriptionsfaktor som är central för den medfödda immunsvaret i Drosophila. Både överlevnad och bakteriell clearance vid infektion är tillsammans indikatorer på motstånd och tolerans mot infektioner. Resistens hänför sig till förmågan av flugor för att rensa en infektion, medan toleransen definieras som förmågan hos värden att begränsa skador från en infektion och därigenom överleva trots höga nivåer av patogen inom systemet 5. Realtidsövervakning av NFkB aktivitet under infektion ger en inblick i en molekylär mekanism för överlevnad under infektion. Användningen av Drosophila i dessa enkla analyser underlättar genetiska och molekylära analyser av sömnoch immunförsvaret och hur dessa två komplexa system har motsvarande påverkas.
Detta protokoll beskriver en metod för att undersöka hur beteende, särskilt sova, är kopplad till immunsvar parametrar. Dessa parametrar inkluderar bakteriell belastning, överlevnad, och NFkB aktivitet mätt genom en luciferas reporter in vivo. Tillsammans dessa parametrar ger information om hur bra en fluga kan bekämpa en infektion. Bakteriell belastning och överlevnad är immunsvar parametrar som innebär en enkel mätning i Drosophila. Rel E20 mutanter som saknar en NFKB transkript…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av National Science Foundation i bidrag # IOS-1025627 och av National Institutes of Health i bidrag # 1R21NS078582-01 till JAW
Material Name | Company | Catalogue number | Comments |
Equipment | |||
Incubators | Percival Scientific, Inc. | I30BLLC8 I36VLC8 |
Any incubator capable of running programmed light/temperature schedules is appropriate. |
Drosophila Activitiy Monitors | Trikinetics Inc., Waltham, MA | DAM2 | As described elsewhere6, this system requires a computer interface, software, and other accessories. |
Pyrex Glass Tubes | Trikinetics Inc., Waltham, MA | PGT-5×65 | |
Microplate scintillation and luminescence counter | Perkin Elmer | TopCount NXT 12 detector |
Any microplate reader capable of detecting luminescence can be used for this type of reporter assay. TopCount contains multiple detectors and an automated stacker; it is capable of being programmed to read continuously from multiple plates. |
FluorChem 8900 | Alpha Innotech | Imaging of bacterial cultures is optional; any digital imaging system with visual light capability is sufficient. | |
Micropipette Puller | Tritech Research, Inc. | Narishige PC-10 | |
Supplies | |||
Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instrument Inc. | 1B100F-4 | |
3 ml Syringe | Fisher Scientific | BD 305482 | |
Syringe Needles | Fisher Scientific | BD 305196 | 18 G – cut off the tip of the needle to prevent damage to the tubing. |
Silicone Tubing, i.d. (0.030″) o.d. (0.065″) Wall Thickness (0.018″) | VWR | 60985-706 | Used for attaching glass capillary needles to a syringe |
3 Way Stopcock | American Pharmaseal Company | K75 | |
Kontes Pellet Pestle Cordless Motor | Fisher Scientific | K749540-0000 | |
Kontes Pellet Pestle | Fisher Scientific | K749521-1590 | |
Glass balls 3mm | VWR | 26396-630 | |
Microplate Microlite 1+ | Thermo Scientific | 7571 | Select 96-well plates that are appropriate for luminescence – they must be opaque. |
TopSeal-A:96-well Microplates | PerkinElmer | 6005185 | Microplate Press-On Adhesive Sealing Film |
D-Luciferin, Potassium Salt | Gold BioTechnology, Inc. | LUCNA | |
Software | |||
Insomniac2 | Available upon request to the authors | custom; written by Lesley Ashmore, Ph.D. (Westminster College) | Matlab based software that has been used routinely for analysis of sleep2,6,11 |
Drosonex | Available upon request to the authors | custom; written by Thomas Coradetti (Sidewalk Software) | A PC MSVC6 program used for survival analysis from raw data files collected with the Trikinetics system |
Photoshop CS3 | Adobe | Useful for obtaining numbers of cfu/plate from digital images (optional) |