Summary
効率的なゲノムワイドな単一遺伝子突然変異法は使用して確立されている
Abstract
トランスポゾン突然変異誘発及び単一遺伝子欠失は細菌1,2におけるゲノムワイドな遺伝子ノックアウトで適用2つの方法です。トランスポゾン突然変異誘発は、低コスト、時間の無駄であり、完成したゲノム情報を必要としませんが、この方法で2つの弱点がありますが：低下競争を有する変異体をカウンターで選択された混合された変異体ライブラリー内の異なる変異体（1）の可能性が;と、（2）部分的な遺伝子の不活性化の可能性はそれによって遺伝子が完全にトランスポゾンの挿入後に、その機能を失うことはありません。単一遺伝子欠失解析は、トランスポゾン突然変異誘発に付随する欠点を補償することができる。ゲノムワイドな単一遺伝子欠失の効率を改善するために、私たちはモデル生物として連鎖球菌血統を使ってゲノムワイドな単一遺伝子欠失のためのハイスループット技術を確立しようとします。各遺伝子の欠失は、Sで構築血統ゲノムは1を備えるように設計されています標的遺伝子の-kbの上流に、標的遺伝子のカナマイシン耐性タンパク質をコードAPHA-3遺伝子、および1-kbの下流。それぞれのプライマーF1/R1、F2/R2、F3/R3と、、の3つのセットを設計し、各欠失構築物のこれらの3つのコンポーネントのPCR増幅のための96ウェルプレートフォーマットで合成される。プライマーR1とF3はそれらの5 '末端APHA-3遺伝子の領域に相補的な25塩基対の配列を含む。 APHA-3遺伝子の大規模PCR増幅はすべて単一遺伝子欠失構築物を作成するために一回行われます。 APHA-3遺伝子のプロモーターは、当初カナマイシンカセットの潜在的な極性の影響を最小限に抑えるために除外されます。遺伝子欠失構築物を作成するには、ハイスループットPCR増幅および精製は、96ウェルプレートフォーマットで行われます。各遺伝子欠失のための線形換えPCRアンプリコンは、高忠実度DNAポリメラーゼを用いて4つのPCR反応を介して構成されます。初期EXPONSの動増殖期トッドヒューイットブロス中で培養した血統は、不活化ウマ血清をPCR-換え構築物の形質転換のために能力を高めるために使用される2.5％を補足。この条件では、Sの最大20％ 血統細胞は DNAの約50 ngを使用して変換することができます。このアプローチに基づいて、単一遺伝子欠失を持つ2048の変異体は、最終的にSの2270の遺伝子から得られたSに他のORF内に完全に含まれる4つの遺伝子のORFを除く血統血統 SK36と218潜在的な必須遺伝子。遺伝子欠失構築物を作成するための技術は、高スループットであり、任意の形質転換可能な細菌のゲノムワイドな単一遺伝子欠失で使いやすいかもしれません。
Protocol
1。プライマー設計
- プライマーはS.に基づいて家のスクリプトで使用して設計されてい血統 SK36ゲノム配列。プライマー、F1/R1、F2/R2、F3/R3と、3組の標的遺伝子の1-kbの上流配列を増幅するために設計されており、APHA-3をコードする遺伝子、カナマイシン耐性（キロr）はタンパク質3と1それぞれの標的遺伝子の-kbの下流配列、（ 図1）。これらのプライマーのうち、F1およびR3は、プログラムのEMBOSSスイート（でePrimer3を使用して設計されてhttp://emboss.sourceforge.net/apps/cvs/emboss/apps/index.htmlターゲットの上流または下流隣接領域を増幅するために）遺伝子。遺伝子特異的プライマー、R1とF3は、標的遺伝子の5 'および3'配列に基づいて設計されています。 R1とF3プライマーはAPHA-3に相補的であり、それらの5 '末端の25-bpのアダプター配列を含んでいる遺伝子。各プライマーの融解温度は、できるだけ近い60になるように設計されました°C、96ウェルフォーマットで、すべてのPCR反応のため均一なアニール温度の使用を可能にする。
- F1、R1、F3とR3プライマーは遺伝子の順序に基づいて、96ウェルプレート内で合成される。各プレートは、同じ遺伝子の順序におけるプライマーの1種類が入っています。マルチチャンネルピペットを用いてPCR増幅のための10μMの最終濃度になるように96ウェルワーキングプライマープレート内のプライマーを希釈します。
2。ハイスループットPCR増幅および精製
- ターゲットSの1-kbの上流または下流を増幅する高スループットへ血統の遺伝子は、1640μlのddH 2 Oを、250μlの10xHighフィデリティPCRバッファー、10mMのdNTP混合液200μl、50mMのMgSO 4を 、100μlの100μlを含む15 mlコニカルチューブ内の氷の上でPCRカクテル混合物を組み立てる10 ng /μlにS.血統 SK36ゲノムDNAおよび10μlのプラチナTaq DNAポリメラーゼpolyme撃つ高忠実度やマルチチャンネルピペットを用いて、96ウェルPCRプレートに各ウェルに23μlの混合物を転送します。マルチチャンネルピペットを用いて、PCRプレートにプライマープレートを作業10μMから各F1とR1（またはF3およびR3）の1μLを。 PCRプレートを密封し、1.5分間、30秒、68℃で30秒間、1分間、及び94℃の30サイクル、54℃、94℃で増幅を行う。
- 48ウェルフィッティングマルチチャンネルピペットのロードとエチジウムブロマイドを含む1％アガロースゲルを準備します。 96ウェルプレートに5xDNAローディングバッファー1μlを4μlのPCR産物を混合し、10μlのマルチチャンネルピペットを用いてアガロースゲルにサンプルをロードします。 30分間135 Vで電気泳動を実行します。 UVPのマニュアルおよび解析システムでゲル上のバンドを調べます。
- 製造業者の指示に従って遠心分離を用いPureLink 96 PCR精製キットでPCR産物を精製する。 DNAを溶出するために、bのウェルに40μlの滅菌蒸留H 2 Oを追加プレートをinding。
- ランダム光度計、分光光度計を用いてDNA濃度を調べるために板の上にいくつかの精製されたアンプリコンを選ぶ。 〜10 ng /μlに、プレート上のアンプリコンの濃度を調整します。
- プラスミドを含むキロRカセットは PCR鋳型としてEcoRIにて Iを用いて消化される。消化したプラスミドをQIAquick PCR精製キットにより精製されており、線状プラスミドDNAは最終DNA濃度が10 ng /μlに調整されます。 4、10μM、F2、1μlの1μlのSO 16.4μlのddH 2 Oを、2.5μlの10xHighフィデリティPCRバッファー、10mMのdNTP混合液2μl、50mMのMgの1μlを含むキロRカセットリコン用の25μlの混合物を組み立てる10μMのR2は、1μlの線状プラスミドDNAを、0.1μlのプラチナTaq DNAポリメラーゼハイファイ。 ℃で1分間、30秒、68のために30秒で1分、そして94℃の30サイクル、55℃、94℃でPCR増幅を行う。 1％アガロースゲル上で電気泳動によりPCR産物を調べます。うんちQIAクイックPCR精製キットで10個々のPCR精製からキロRカセットリコンのラバルク。 10 ng /μlにするアンプリコンの濃度を調整します。
- 最後の直線換えPCRアンプリコンを取得するには、3つのPCRアンプリコンはウェルPCRテンプレートとして1 PCRプレートの各1μlを（ほぼ等しいモル量で）と結合されます。他のPCRコンポーネント4、10μMのF1を1μl、10μMR3の1μlのは、SO 14.4μlのddH 2 Oを、2.5μlの10xHighフィデリティPCRバッファー、10mMのdNTP混合液2μl、50mMのMgの1μlを含めて追加されます0.1μLプラチナTaq DNAポリメラーゼハイファイ。 PCR増幅は4分間3.5分、最後に68℃で30秒、68℃30秒55℃2分間、94℃で30サイクル、94℃で行われる。
- アガロースゲル上のPCR増幅産物を調べます。上記のように、PCR産物を精製し、定量化する。 -20℃で再結合されたPCRアンプリコンを凍結
3。 COMpetent細胞の調製
- トッドヒューイットブロスを作製し、室温まで冷却し、0.22μmのポリスチレンフィルタ4を用いて滅菌した後沸騰するまで加熱10NのNaOHを用いてpHを7.6に調整。 TH + HS媒体を補うために、15 mlコニカルチューブに11.7ミリリットルトッドヒューイットブロスに300μlの熱不活化ウマ血清（2.5％最終濃度）を追加します。アリコートのTH + HS培地2ml及びチューブ内に10ミリリットル。
- 株式Sの5μlを接種血統 SK36は2ミリリットルのTH + HS培地中に-80℃で凍結し、37℃でしっかりとプレインキュベート10ミリリットル-TH + HSチューブ伴う℃をキャッピングで一晩培養した培養液をインキュベートする。
- 一晩後、10ミリリットルのTH + HSに50μlの培養を転送し、3時間（0.07から0.08のOD 660に対応）37℃でチューブをインキュベート、直ちに形質転換のために使用します。
4。細胞の形質転換と抗生物質選択
- 70 ngのSの2μlを加え血統 SK36コンペタンス刺激ペプチド（CSP）および37のブロック96ウェル、それらプリ暖かい上のエッペンドルフチューブに2μlの線形リコンビナントPCRアンプリコン（〜50 ngの）℃各試験管に3時間インキュベートしたSK36文化の330μlを。 1時間37℃でインキュベートする。制御などの滅菌ddH 2 OでDNAを交換してください。
- 氷の上にブロックを配置し、500μg/ mlのカナマイシンをブレインハートインフュージョン（BHI）寒天プレート上でそれぞれの変換の100μlを広げた。微好気条件下で2日間37℃でプレートをインキュベートする。
5。変異体の確認とストレージ
- それぞれの置換変異体は、ランダムに、2個のコロニーを拾う500μg/ mlのカナマイシンを含む5mlのBHI培地にコロニーを接種し、37℃で一晩microaerobically接種をインキュベート℃に-80℃で30％グリセロールで各文化を凍結保存°C
- 、予想される遺伝子置換を含む変異体は、それぞれの変異体を使用してF1とR3にはコロニーPCRを行うかどうかを調べるために、96ウェルPCRプレートのプライマー。個々のコロニーから約1μlの一晩培養物を25μlのPCR-増幅反応におけるDNA鋳型として使用されます。 PCRは℃で3.5分、最後に68℃で4分間、30秒、68で30秒、55℃で5分、94、35サイクルの°Cのために94℃で行われる。
- 正確にはダブルバンド変異体又は汚染PCRアンプリコンを識別するには、エチジウムブロマイド染色で> 12センチ2％アガロースゲル上で4時間電気泳動によってPCRアンプリコンを調べます。このアガロースゲル電気泳動条件の下で、≥100 bpの差を持つ任意のアンプリコンが明確に特定された。キロr のカセットと、野生型遺伝子の増幅に起因するバンドが<100 bpによって異なることが予想されている場合、内部のT1プライマーは、野生型遺伝子をPCRにより検出することができるかどうかを判断するために使用されます。
- さらに削除を確認するには、アンプリコンはPureLink 96 PCR精製キットで精製し、そのP1プライマーを用いて配列決定されるキロRカセットに結合する。配列決定によって確認のみ正しい変異を保持します。
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Representative Results
後のPCRプライマーF1とR1を使用して増幅し、F3およびR3は、それぞれSの約1 kbの上流および下流血統遺伝子は、96ウェルフォーマットであった（ 図2A）で得られた。私たちのPCR条件と使用して設計されたプライマーの下では、特定の製品はSから増幅した各PCR反応における血統ゲノムDNA。この結果は、プライマーがSのターゲットに非常に特異的であった示された血統 。 PCRの再増幅はDNAを鋳型としてプライマーF1およびR3と3リコンを使って通って、線形リコンビナントPCRコンストラクト（〜3キロバイト）は、高スループットの各標的遺伝子の上流領域からなる96ウェルプレート、カナマイシンで作成されたカセット、その順序で各標的遺伝子の下流の領域（ 図2B）。リコンビナントPCRコンストラクトは次にSに転換した血統 SK36とBHI寒天プレート上にカナマイシンで選択されています。 transfoの大半を1000年コロニー以上rmationsは、微好気2 D-インキュベーション後、各プレート上で得た。これらのコロニーは、F1とR3用いてPCR増幅したときは、予想される変異体サイズに対応する単一のDNAバンド（〜3キロバイト）は、ゲル電気泳動（ 図2C）で観察した。潜在的な必須遺伝子を削除しようとすると、全くコロニーは、変換の大部分で得ることができなかった。いくつかの重要な遺伝子の欠失は、しかし、コロニーはまだ次の変換を得た。 F1/R3を使用して、これらのコロニーのPCR増幅後、予想される変異体のサイズと野生型のサイズに対応する二つのDNAバンドとしてゲル電気泳動（ 図2C）によって明らかに登場しました。いくつかの変異体については、予想される変異体のサイズおよびPCRアンプリコンの野生型のサイズが長すぎアガロースゲルで分離することが接近していた。この場合、内部プライマーT1は、野生型の遺伝子配列に基づいて設計されました。 PCRは、内部のT1プライマーを用いて行ったNDのF1プライマー（ 図2D）。野生型SK36は、このPCRのポジティブコントロール株として用いた。予想されるサイズのバンドが内部プライマーを用いた変異から増幅された場合、遺伝子はP1プライマーを用いたDNAシーケンシングにより以前に確認された変異体におけるカナマイシンカセットの存在が必須遺伝子（ダブルバンド突然変異体）として同定された。このプロトコルに基づいて、我々は最終的に2048の非必須Sを収集血統の遺伝子変異体は、他のORF内に完全に含まれているもの4個のORF（ 表1）を除く。私たちは、Sのため不可欠である218遺伝子を同定実験条件下で血統の生存。
| クラス | オープンリーディングフレーム（ORF） |
| トータルの遺伝子* | 2270 |
| 標的遺伝子 | 2266 |
| 非必須（APHA-3プロモーター） | 1973 |
| （プロモーターAPHA-3）非必須 | 75 |
| エッセンシャル（無形質転換体） | 60 |
| エッセンシャル（ダブルバンド） | 158 |
他のORF内に完全に含まれている* 4つのORF。
表1の S.血統遺伝子変異要約。
図1。プライマーのリコンビナントPCR。3セット（F1/R1、F2/R2とF3/R3）は、それぞれ、上流の配列、薬剤耐性遺伝子（Km r）および下流配列を増幅するために設計されています。 R1とF3プライマーの5 '末端の両方が共存配列を含んで抗生物質耐性遺伝子のカセットとmplementary。 Sで挟まれた抗生物質選択マーカーを含む最終的なPCR産物の組換えDNA 血統ゲノムDNAはF1/R3を用いて製造される。組換えDNAがSに統合されますダブルクロスオーバー組換えによるゲノム血統 。
図2。アガロース上のPCR増幅産物の代表的なゲル電気泳動。ターゲットSの上流または下流の、1 kbのPCRアンプリコン血統の遺伝子。 A、B、標的遺伝子とプロモーターAPHA-3の上流側と下流から成る組換えDNAのPCR。 Sの変態からC、コロニーPCRアンプリコンPCR産物の組換えDNAと血統 、レーン4、10、14、15、20と24でダブルバンド。 D、プライマーF1/T1を使用して、野生型と変異コロニーのPCR増幅、M、変異体、W、野生型。
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Discussion
初期のプライマーが設計しながら、隣接する遺伝子の外因性の抗生物質遺伝子と1標的遺伝子の交換の可能性極性効果を最小限に抑えるためには、2つのステップがとられる。削除された遺伝子のほとんどは、プライマーR1とF3は前に終止コドンから30 bpに開始コドンに続く6 BPからコーディング領域を削除するために設計されています。最後の30塩基対は、隣接する下流遺伝子によって使用される潜在的なリボソーム結合部位を保護するために保持されます。彼らは反対の向きと両方のタンパク質のN末端に位置していたときに隣接する二つの遺伝子間の保持領域は100塩基対まで拡張され潜在的なプロモーター領域を削除を防ぐために互いに近接しています。 APHA-3遺伝子のプロモーターは、遺伝子欠失5の組換え構築物で除外されている。リボソーム結合部位は、翻訳用のAPHA-3遺伝子に導入される。私たちの戦略をテストするために、我々は、ランダムに10、次に96対立遺伝子交換変異体を構築した。我々OプロモーターレスはAPHA-3遺伝子はほとんどのケースでうまく表現されたことを示唆し、カナマイシン選択プレート上にそれぞれ10と93の変異体を、btained。次に、Sのすべての遺伝子欠失のためのプロモーターレスAPHA-3遺伝子のためのプライマーを設計し、合成血統ゲノム。しかし、我々はSにいくつかの遺伝子を発見血統が低い可能性が高いプロモーターAPHA-3遺伝子およびそれ故にカナマイシン選択の発現に影響を与えれる表明または発現していなかった。この問題を解決するために、プラスミドからAPHA-3のプロモーター遺伝子はキロRカセットに導入した。プロモーターキロRカセットリコンの大部分は、プライマーF2p/R2を用いて、10個々のPCRから得られた。その新しいR1のプロモータープライマーR1PがプロモーターキロRカセットリコンを補完のために設計されている場合を除き、他のすべての工事手順は、プロモーターレスの建設のためのと同じであった。
efficiencを改善するために、相同組換えのyは、我々はSの上流と下流の隣接配列（1キロバイト）時間を選択遺伝子欠失構築物を作るの血統の標的遺伝子。 （1）DNA断片の長さ（〜3キロバイト）APHA-3遺伝子（〜1キロバイト）に加えて使用して隣接配列の2キロバイトの許容準備PCR増幅：フランキング配列のサイズは、2つの点に基づいて1キロバイトに制限されていました高忠実度DNAポリメラーゼ、および（2）の両端（〜1キロバイト）からABIのシークエンス法によりフランキング領域をシークエンシングの可能性。 Sのほとんどの形質転換体の数が多い血統の遺伝子欠失は、ノックアウトの標的遺伝子を十分にあったが、それぞれ、1キロバイト上流と下流の配列を示した。
成功した"PCR増幅組換えでAPHA-3遺伝子、プライマー、R1、F2、R2とF3はその5で追加される予定の両端で標的遺伝子の上流と下流を接続するには、購入と相補的である余分なシーケンスを終了多くの細菌の遺伝子欠失例6,7の反対側の端をecting。予備研究では、余分な配列がこのリコンビナントPCRプロトコルのための25 bpまで低減できることが示された。このプロトコルでは、APHA-3遺伝子のプライマーF2とR2の余分な配列を排除し、Sの上流及び下流でR1とF3の5 '末端に25 bpの余分な配列を追加しました血統の標的遺伝子。この設計では、プライマーの長さと量を減少させ、それゆえ単一遺伝子欠失の効率を向上させるコストとPCR時間を減らすことができます。当研究室では、この設計にも成功などのストレプトコッカス·ミュータンスと肺炎球菌 、およびポルフィロモナス·ジンジバリスなどの他の微生物の遺伝子欠失のために実証されている。
このプロトコルでは、PCRプライマーの特異性は非常に重要です。プライマーの融解温度（> 58℃）高く、プライマーのサイズは（> 21 bp）の長さだった、とプライマー双方向ndingサイトはS.のゲノム中にユニークだった血統 。このデザインは私たちのPCR増幅のほぼそれぞれに単一の遺伝子特異的な製品を生産。 PCR増幅から単一の遺伝子特異的な製品には、最後のPCR増幅のために重要です。それ以外の場合は、最後の組換え体の形成の結果は、それぞれ、各遺伝子の上流および下流地域や抗生物質遺伝子カセットから構成される最終的なPCR増幅が困難であろう。
変態の細胞密度依存性は、Sのような多くの球菌で実証されている血統8、S.タンス 9とS.肺炎 10。 Sの時の細胞密度血統は、THで0.07から0.08のOD 660（〜5×10 6 cfu / mlに相当する）に達し+ HS培地、Sの最高変換効率をリニア換えPCRアンプリコンと血統が得られ、Sの最大20％であった血統細胞変換することができます。 Sにおけるゲノムワイドな遺伝子欠失の完了後血統 、我々はいくつかの非必須遺伝子の欠失のための形質転換体の数は、（〜10）に低かったことがわかった。細菌の高い形質転換効率がゲノムワイドな遺伝子ノックアウトの非必須遺伝子欠失を全て満たすことが重要であることは間違いありません。
PCRによる組換え構築物の作成を除き、単一遺伝子の不活性化のための他の技術もあります。例えば、自殺プラスミド作成は広範囲に小規模で細菌遺伝子を不活化するために適用されてきました。大規模なプラスミドの作成がはるかに時間がかかり、面倒であり、いくつかの細菌が特定の自殺プラスミドを作成する必要があるため、この技術は、ゲノムワイドな単一遺伝子の不活性化のために使用されていない。マーカーレス遺伝子の欠失は、抗生物質耐性遺伝子の可能性極性効果を避けることがありますが、伝統的なマーカーレス遺伝子欠失法は、より多くの時間-CONです自殺プラスミドの方法よりも遺伝子を不活性化するsumingと難しい。 大腸菌では、ゲノムワイドマークレス遺伝子欠失は、抗生物質耐性遺伝子で置換によって得られた後、耐性カセット6を撤廃する。しかし、この大腸菌大腸菌株は、λファージレッドリコンビナーゼを必要とします。遺伝子欠失変換する前に、赤ヘルパープラスミドpKD46を大腸菌に導入されるべきである大腸菌 11。我々の手法では、遺伝子欠失変異体の大多数のAPHA-3耐性遺伝子のプロモーターを除去し、極性のを避けるために、遺伝子欠失領域の発現構造に従うAPHA-3 ORFの2エンドを設計耐性カセットの効果の問題。今まで、我々は、この技術によって作成された多数の変異体の機能を調べた後、極性効果の問題を発見していない。 S.で取得必須遺伝子のゲノムワイドかつ明確なセット目を使用して血統テクニック12はまた、システム内の抗生物質カセットの極性効果の低い可能性を暗示しています。我々はこのようなエリスロマイシンおよびクロラムフェニコール耐性遺伝子などの他のプロモーターレス抗生物質耐性遺伝子を、実証している（データは示されていない）この方法に適用することができる。さらに、この技術は自殺プラスミドと再構成されたホストを必要としません。全体的に、この技術は、ゲノムワイドな遺伝子欠失構築物を作成するためのハイスループットであり、細菌のゲノムワイドな単一遺伝子の突然変異で実行するのは簡単かもしれません。
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Disclosures
特別な利害関係は宣言されません。
Acknowledgments
この作品は、バージニアコモンウェルス大学研究所理事長奨励プログラム（PRIP）144602から3（PX）で、国立衛生研究所（PX）からの助成金によってR01DE018138と部分的にサポートされていました。我々は博士に感謝します。レイ·チェン、Yuetanドウとゲノムワイド変異体の構築をサポートするため、王をXiaojing。我々はまた、DNAシークエンシングのためにバージニアコモンウェルス大学でDNAの中核施設に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primer F2 | Integrated DNA Technologies | TGACTAACTAGGAGGAATAAATG GCTAAAATGAGAATAT |
|
| Primer R2 | ibid | CATTATTCCCTCCAGGTACTAAAA CAATTCATCCAGT |
|
| Primer F2p | ibid | GATAAACCCAGCGAACCATTTGA | |
| Primer P1 | ibid | GCTTATATACCTTAGCAGGAGACA | |
| Primer P2 | ibid | GTATGACATTGCCTTCTGCGTCC | |
| Primer 5' end_R1_seq | ibid | GCCATTTATTCCTCCTAGTTAGTCA | |
| Primer 5' end_F3_seq | ibid | GTTTTAGTACCTGGAGGGAATAATG | |
| Primer 5' end_R1p_seq | ibid | CCTCAAATGGTTCGCTGGGTTTATC | |
| CSP | Synprep | Sequence:NH2-DLRGVPNPWGWIFGR-COOH | |
| DNA Polymerase | Invitrogen | 11304-102 | Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity |
| EcoRI | New England Biolabs Inc | R0101S | Restriction enzyme |
| Agar | American Bioanalytical | AB01185 | |
| Agarose | Promega | V3125 | |
| BHI | BD Biosciences | 237500 | Brain Heart Infusion |
| Horse serum | Fisher Scientific | SH3007403 | Horse serum |
| Km | Fisher Scientific | BP906-5 | Kanamycin |
| TH broth | BD Biosciences | 249240 | Todd Hewitt broth |
| PureLink 96 | Invitrogen | K310096 | PureLink 96 PCR purification kit |
| QIAquick | Qiagen | 28106 | QIAquick PCR purification kit |
| Filter | Corning | 431117 | 0.22 μm polystyrene filter |
| Anoxomat System | Mart Microbiology b.v. | Anoxomat Mark II | |
| Benchtop centrifuge | Thermo Scientific | 75004377 | Sorvall Legend RT Plus microplate rotor |
| Gel Documentation | UVP LLC | BioDoc-It 210 | |
| Incubator | Fisher Scientific | 11-690-625D | Isotemp |
| Labnet's Gel XL | Labnet | E0160 | Labnet's Gel XL |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 22621408 | Microcentrifuge 5415 R |
| Multichannel pipettes | Thermo Scientfic | 4661040, 4661020 | Finnpipette F1 |
| Thermal Cycler | Applied Biosystems Inc. | N805-0200 | GeneAmp PCR system 9700 |
References
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