全基因组基因缺失<em>链球菌血统</em通过高通量PCR
Summary
已经建立一个高效的全基因组单基因突变的方法使用<em>链球菌血统</em作为一种模式生物。通过这种方法已经取得了高通量重组PCR和转换。
Abstract
转座子突变和单基因缺失的两种方法适用于全基因组基因敲除细菌1,2。虽然转座子诱变是耗时更少，成本更低，并且不需要完成的基因组信息，在该方法中有两个缺点：（1）在该混合反选择竞争降低的突变体的突变体库的一个完全不同的突变体的可能性;和（2）的部分的基因失活的可能性，即基因的不完全失去的转座子的插入后，它们的功能。单基因的缺失分析可能补偿相关的缺点与转座子诱变。为了提高效率的全基因组的单基因缺失，我们尝试建立了高通量技术的使用链球菌血统作为模式生物的全基因组单基因缺失。每个基因缺失构建S.血统基因组被设计成包括1-kb的上游的靶基因，APHA-3基因，编码卡那霉素抗性的蛋白质，和1-kb的下游的靶基因。分别三套引物F1/R1 F2/R2和F3/R3，设计并合成用于PCR扩增这三个组成部分的每个删除构建在96孔板中的格式。引物R1和F3包含25-bp的序列的APHA-3基因在它们的5'末端的区域是互补的。执行一次创建所有的单基因缺失构建一个大型的APHA-3基因的 PCR扩增。 APHA-3基因的启动子的初步排除卡那霉素磁带，以减少潜在的极性效应。要创建的基因缺失构建，高吞吐量的PCR扩增和纯化是在96孔板中的格式进行。线性每个基因缺失的重组PCR扩增子将通过4采用高保真DNA聚合酶的PCR反应。最初的expon差分生长阶段的S.血统 Todd Hewitt肉汤培养在补充有2.5％灭活的马血清是用来增加PCR的重组构建体的转化能力。在此条件下，高达20％的S.血统细胞可以使用〜50ng的DNA转化。根据此方法，2048个单基因缺失的突变体，最终获得的2270个基因在S.血统不包括4个基因的ORF完全包含在其他的ORF S.血统 SK36和218潜在的必需基因。该技术是高通量基因缺失结构，可以很容易使用任何变形菌的全基因组的单基因缺失。
Protocol
Representative Results
Discussion
为了尽量减少可能的极性的影响1与外源性抗生素基因对邻近基因的靶基因的更换，采取两个步骤，而最初的引物设计。对于大多数已删除的基因，引物R1和F3被设计用于删除后的6个碱基的30 bp的起始密码子到终止密码子之前的编码区。最后保留了30个碱基对，以保护潜在的使用相邻的下游基因的核糖体结合位点。两个相邻的基因之间的保留区域被扩展到100 bp的，当他们位于相反方向，这两种蛋白的…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作是支持的补助金从美国国立卫生（PX）和R01DE018138部分，弗吉尼亚联邦大学校长科研奖励计划（PRIP）144602-3（PX）。我们感谢博士。雷震，西城区月坛窦和小静王为协助建设的全基因组突变体。我们也感谢的DNA核心设施在弗吉尼亚联邦大学进行DNA测序。
Materials
| Names | Company | Catalog# | Comments (optional) |
| Primer F2 | Integrated DNA Technologies | TGACTAACTAGGAGGAATAAATG GCTAAAATGAGAATAT |
|
| Primer R2 | ibid | CATTATTCCCTCCAGGTACTAAAA CAATTCATCCAGT |
|
| Primer F2p | ibid | GATAAACCCAGCGAACCATTTGA | |
| Primer P1 | ibid | GCTTATATACCTTAGCAGGAGACA | |
| Primer P2 | ibid | GTATGACATTGCCTTCTGCGTCC | |
| Primer 5′ end_R1_seq | ibid | GCCATTTATTCCTCCTAGTTAGTCA | |
| Primer 5′ end_F3_seq | ibid | GTTTTAGTACCTGGAGGGAATAATG | |
| Primer 5′ end_R1p_seq | ibid | CCTCAAATGGTTCGCTGGGTTTATC | |
| CSP | Synprep | Sequence:NH2-DLRGVPNPWGWIFGR-COOH | |
| DNA Polymerase | Invitrogen | 11304-102 | Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity |
| EcoRI | New England Biolabs Inc | R0101S | Restriction enzyme |
| Agar | American Bioanalytical | AB01185 | |
| Agarose | Promega | V3125 | |
| BHI | BD Biosciences | 237500 | Brain Heart Infusion |
| Horse serum | Fisher Scientific | SH3007403 | Horse serum |
| Km | Fisher Scientific | BP906-5 | Kanamycin |
| TH broth | BD Biosciences | 249240 | Todd Hewitt broth |
| PureLink 96 | Invitrogen | K310096 | PureLink 96 PCR purification kit |
| QIAquick | Qiagen | 28106 | QIAquick PCR purification kit |
| Filter | Corning | 431117 | 0.22 μm polystyrene filter |
| Anoxomat System | Mart Microbiology b.v. | Anoxomat Mark II | |
| Benchtop centrifuge | Thermo Scientific | 75004377 | Sorvall Legend RT Plus microplate rotor |
| Gel Documentation | UVP LLC | BioDoc-It 210 | |
| Incubator | Fisher Scientific | 11-690-625D | Isotemp |
| Labnet’s Gel XL | Labnet | E0160 | Labnet’s Gel XL |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 22621408 | Microcentrifuge 5415 R |
| Multichannel pipettes | Thermo Scientfic | 4661040, 4661020 | Finnpipette F1 |
| Thermal Cycler | Applied Biosystems Inc. | N805-0200 | GeneAmp PCR system 9700 |
References
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