Summary

Genomweiten Gen-Deletionen in<em> Streptococcus sanguinis</em> Von High Throughput PCR

Published: November 23, 2012
doi:

Summary

Eine effiziente genomweiten Gen-Mutation Methode ermittelt worden<em> Streptococcus sanguinis</em> Als Modellorganismus. Diese Methode wurde über einen hohen Durchsatz rekombinanten PCRs und Transformationen erreicht.

Abstract

Transposon-Mutagenese-und Single-Gen-Deletion gibt zwei Methoden in genomweiten Gen-Knockout in Bakterien 1,2 angewendet. Obwohl Transposon-Mutagenese ist weniger zeitaufwendig, weniger kostspielig und erfordert keine abgeschlossene Genom Informationen gibt es zwei Schwachstellen in diesem Verfahren: (1) die Möglichkeit einer unterschiedlichen Mutanten in der gemischten Mutantenbibliothek daß der Zähler-wählt Mutanten mit verminderter Wettbewerb; und (2) die Möglichkeit eines teilweisen Geninaktivierung wobei Gene nicht vollständig verlieren ihre Funktion nach dem Einsetzen eines Transposons. Single-Gen-Deletion Analyse kann für die Nachteile, die mit der Transposon-Mutagenese zu kompensieren. Um die Effizienz der genomweiten einzigen Gen-Deletion zu verbessern, versuchen wir, einen hohen Durchsatz Technik für genomweite einzigen Gen-Deletion mit Streptococcus sanguinis als Modellorganismus zu etablieren. Jedes Gendeletion in S. konstruieren sanguinis Genom soll 1 umfassen-Kb stromaufwärts des Zielgens, das aphA-3-Gen, kodierend Kanamycinresistenz Protein und 1-kb stromabwärts des Zielgens. Drei Sätze von Primern F1/R1, F2/R2 und F3/R3 sind jeweils entworfen und synthetisiert in einer 96-Well-Platte Format für PCR-Amplifikationen von diesen drei Komponenten jedes Deletion konstruieren. Primer R1 und F3 enthalten 25-bp-Sequenzen, die komplementär zu Regionen der aphA-3-Gen an ihrem 5'-Ende sind. Eine große Skala PCR-Amplifikation des aphA-3-Gen wird einmal für die Erstellung aller Single-Gendeletion Konstrukte durchgeführt. Der Promotor aphA-3-Gen wird zunächst ausgeschlossen, um das Potenzial polaren Effekt Kanamycinkassette minimieren. Um die Gendeletion Konstrukte zu erzeugen, werden Hochdurchsatz-PCR-Amplifikation und Reinigung in einem 96-Well-Platten-Format durchgeführt wird. Eine lineare rekombinante PCR Amplikon für jedes Gen Löschung wird nach oben durch vier PCR-Reaktionen mit High-Fidelity DNA-Polymerase erfolgen. Die anfängliche exponential Wachstumsphase S. sanguinis in Todd-Hewitt-Brühe kultiviert, ergänzt mit 2,5% inaktiviertem Pferdeserum wird verwendet, um die Zuständigkeit für die Transformation von PCR-rekombinante Konstrukte zu erhöhen. Unter dieser Bedingung bis zu 20% von S. sanguinis transformierten Zellen können unter Verwendung ~ 50 ng der DNA werden. Basierend auf diesem Ansatz wurden 2.048 Mutanten mit Single-Gen-Deletion letztendlich von den 2.270 Gene in S. erhalten sanguinis außer vier Gen-ORFs, die vollständig innerhalb anderen ORFs in S. sanguinis SK36 und 218 potentielle essentiellen Gene. Die Technik zur Erstellung von Gen-Deletion Konstrukte ist mit hohem Durchsatz und könnte leicht in genomweiten Gen Löschungen für alle transformable Bakterien verwenden.

Protocol

Ein. Primer Design Grundierungen werden unter Verwendung im Haus der Script basiert auf der S. sanguinis SK36 Genomsequenz. Drei Sätze von Primern, F1/R1, F2/R2 und F3/R3 sind zur Amplifikation des 1-kb stromaufwärts Sequenz des Ziel-Gens, das aphA-3 kodierenden Gens Kanamycinresistenz (Km r) Protein 3 und der 1 ausgelegt -kb stromabwärts Sequenz des Zielgens, bzw. (Abbildung 1). Unter dieser Primer sind F1 und R3 entwickelt mit ePrimer3 im EMBOSS Su…

Representative Results

Nach der PCR-Amplifikation unter Verwendung der Primer und R1 F1 und F3 und R3, etwa 1-kb stromaufwärts und stromabwärts jeder S. sanguinis Gen wurden in 96-Well-Format bzw. (2A) erhalten. Unter unserer PCR-Bedingungen und mit entworfenen Primern wurde ein bestimmtes Produkt aus S. verstärkt sanguinis genomischen DNA in jeder PCR-Reaktion. Dieses Ergebnis zeigt die Primer waren sehr spezifisch für die Ziele der S. sanguinis. Durch PCR-Amplifikation mit erneute Pri…

Discussion

Um die möglichen polaren Effekte der Ersatz eines Zielgens mit exogenen Antibiotika-Gen auf benachbarten Genen zu minimieren, sind zwei Schritte gemacht, während erste Primer entwerfen. Für die meisten der Gene gelöscht werden der Primer R1 und F3 entworfen, um die codierende Region von 6 bp nach dem Startcodon und 30 bp vor dem Stopcodon löschen. Die letzten 30 Basenpaare zurückgehalten werden, um potenzielle ribosomale Bindungsstelle durch das benachbarte, nachgeschaltete Gen verwendet schützen. Das verbliebene…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse R01DE018138 von den National Institutes of Health (PX) und zum Teil unterstützt durch Virginia Commonwealth University Presidential Forschung Incentive Program (PRIP) 144602-3 (PX). Wir danken Drs. Lei Chen, Yuetan Dou und Xiaojing Wang für die Unterstützung mit dem Bau der genomweiten Mutanten. Wir danken auch dem DNA Core Facility an der Virginia Commonwealth University für die DNA-Sequenzierung.

Materials

Names Company Catalog# Comments (optional)
Primer F2 Integrated DNA Technologies TGACTAACTAGGAGGAATAAATG
GCTAAAATGAGAATAT
Primer R2 ibid CATTATTCCCTCCAGGTACTAAAA
CAATTCATCCAGT
Primer F2p ibid GATAAACCCAGCGAACCATTTGA
Primer P1 ibid GCTTATATACCTTAGCAGGAGACA
Primer P2 ibid GTATGACATTGCCTTCTGCGTCC
Primer 5′ end_R1_seq ibid GCCATTTATTCCTCCTAGTTAGTCA
Primer 5′ end_F3_seq ibid GTTTTAGTACCTGGAGGGAATAATG
Primer 5′ end_R1p_seq ibid CCTCAAATGGTTCGCTGGGTTTATC
CSP Synprep Sequence:NH2-DLRGVPNPWGWIFGR-COOH
DNA Polymerase Invitrogen 11304-102 Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity
EcoRI New England Biolabs Inc R0101S Restriction enzyme
Agar American Bioanalytical AB01185
Agarose Promega V3125
BHI BD Biosciences 237500 Brain Heart Infusion
Horse serum Fisher Scientific SH3007403 Horse serum
Km Fisher Scientific BP906-5 Kanamycin
TH broth BD Biosciences 249240 Todd Hewitt broth
PureLink 96 Invitrogen K310096 PureLink 96 PCR purification kit
QIAquick Qiagen 28106 QIAquick PCR purification kit
Filter Corning 431117 0.22 μm polystyrene filter
Anoxomat System Mart Microbiology b.v. Anoxomat Mark II
Benchtop centrifuge Thermo Scientific 75004377 Sorvall Legend RT Plus microplate rotor
Gel Documentation UVP LLC BioDoc-It 210
Incubator Fisher Scientific 11-690-625D Isotemp
Labnet’s Gel XL Labnet E0160 Labnet’s Gel XL
Microcentrifuge Eppendorf 22621408 Microcentrifuge 5415 R
Multichannel pipettes Thermo Scientfic 4661040, 4661020 Finnpipette F1
Thermal Cycler Applied Biosystems Inc. N805-0200 GeneAmp PCR system 9700

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Cite This Article
Ge, X., Xu, P. Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR. J. Vis. Exp. (69), e4356, doi:10.3791/4356 (2012).

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