שיטה יעילה הגנום בודדה גן מוטציה כבר נקבעה באמצעות<em> סטרפטוקוקוס sanguinis</em> כאורגניזם מודל. שיטה זו השיגה דרך PCRs גבוה התפוקה רקומביננטי ותמורות.
Transposon mutagenesis ומחיקה של גן היחיד הם שתי שיטות שיושמו בנוקאאוט גן גנום רחב ב1,2 חיידקים. למרות mutagenesis transposon הוא פחות זמן רב, יקר פחות, ואינו דורש מידע הגנום הושלם, יש שתי חולשות בשיטה זו: (1) האפשרות של מוטציות שונות בספריית המוטציה המעורבת שנגד בוחרת מוטנטים עם תחרות ירד; ו (2) האפשרות של איון גן החלקי לפיו גנים לא לגמרי מאבדת את תפקודם לאחר החדרת transposon. ניתוח מחיקה של הגן יחיד עשוי לפצות על חסרונות הקשורים mutagenesis transposon. כדי לשפר את היעילות של מחיקה הגנום בודדה גן, אנו מנסים להקים טכניקת תפוקה גבוהה למחיקת גן יחידה הגנום באמצעות sanguinis Streptococcus כאורגניזם מודל. כל מחיקת גן לבנות בס sanguinis הגנום נועד מהווה 1-KB זרם של הגן הממוקד, גן APHA-3, חלבון התנגדות kanamycin קידוד, או במורד 1-KB של הגן הממוקד. שלושה זוגות של פריימרים F1/R1, F2/R2, וF3/R3, בהתאמה, מתוכננים ומסונתזים בפורמט צלחת 96-גם ל- amplifications PCR של שלושה המרכיבים האלה של כל מחיקה להקים. Primers R1 ו F3 מכילים רצפי 25-BP שמשלימים לאזורים של-3 APHA הגן בקצה 5 'שלהם. הגברת PCR קנה מידה גדולה של-3 APHA הגן מתבצעת פעם אחת ליצירה כל מבני המחיקה בגן בודד. האמרגן של גן APHA-3 בתחילה הוצא כדי למזער את ההשפעה הפוטנציאלית של קוטב קלטת kanamycin. כדי ליצור מבני מחיקת הגן, הגברת תפוקה גבוהה PCR וטיהור מבוצעות בפורמט צלחת 96-כן. Amplicon PCR רקומביננטי יניארית לכל מחיקת גן יהיה מורכב באמצעות ארבע תגובות PCR באמצעות DNA פולימראז באיכות גבוהה. Expon הראשונישלב הצמיחה ential של ס ' sanguinis תרבית בטוד יואיט מרק בתוספת 2.5% סרום סוס מומת משמש כדי להגדיל את היכולת של שינוי מבני PCR-רקומביננטי. תחת תנאי זה, עד 20% של ס ' תאי sanguinis ניתן להפוך באמצעות ~ 50 ng של DNA. בהתבסס על גישה זו, 2048 מוטנטים עם מחיקת גן יחיד סופו של דבר התקבלו מ2270 הגנים בס sanguinis למעט 4 ORFs גנים כלולים כולו בתוך ORFs האחר בס sanguinis SK36 ו218 גנים חיוניים פוטנציאליים. הטכניקה ביצירת מבני מחיקת גן היא תפוקה גבוהה ויכולה להיות קל לשימוש במחיקות גן יחידות הגנום לכל חיידקי transformable.
כדי למזער את ההשפעות האפשריות של קוטב החלפת הגן ממוקד אחד עם אנטיביוטיקת גן אקסוגני בגנים סמוכים, שני צעדים נלקחים תוך פריימר הראשוני בעיצוב. עבור רוב הגנים שנמחקו, פריימרים R1 ו F3 נועדו למחוק את אזור קידוד מ6 נ"ב לאחר קודון התחילה ועד 30 נ"ב לפני קודון העצירה. את 30 ז…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי מענקי R01DE018138 מהמכונים הלאומיים לבריאות (PX), ובחלקו, על ידי תכנית אוניברסיטת וירג'יניה הנשיאותית מחקר תמריץ (PRIP) 144602-3 (PX). אנו מודים לבני זוג. ליי חן, Yuetan Dou וXiaojing ואנג לסיוע בבנייה של מוטציות רחבות הגנום. אנו מודים גם למתקן ליבת ה-DNA באוניברסיטת וירג'יניה לרצפי DNA.
Names | Company | Catalog# | Comments (optional) |
Primer F2 | Integrated DNA Technologies | TGACTAACTAGGAGGAATAAATG GCTAAAATGAGAATAT |
|
Primer R2 | ibid | CATTATTCCCTCCAGGTACTAAAA CAATTCATCCAGT |
|
Primer F2p | ibid | GATAAACCCAGCGAACCATTTGA | |
Primer P1 | ibid | GCTTATATACCTTAGCAGGAGACA | |
Primer P2 | ibid | GTATGACATTGCCTTCTGCGTCC | |
Primer 5′ end_R1_seq | ibid | GCCATTTATTCCTCCTAGTTAGTCA | |
Primer 5′ end_F3_seq | ibid | GTTTTAGTACCTGGAGGGAATAATG | |
Primer 5′ end_R1p_seq | ibid | CCTCAAATGGTTCGCTGGGTTTATC | |
CSP | Synprep | Sequence:NH2-DLRGVPNPWGWIFGR-COOH | |
DNA Polymerase | Invitrogen | 11304-102 | Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity |
EcoRI | New England Biolabs Inc | R0101S | Restriction enzyme |
Agar | American Bioanalytical | AB01185 | |
Agarose | Promega | V3125 | |
BHI | BD Biosciences | 237500 | Brain Heart Infusion |
Horse serum | Fisher Scientific | SH3007403 | Horse serum |
Km | Fisher Scientific | BP906-5 | Kanamycin |
TH broth | BD Biosciences | 249240 | Todd Hewitt broth |
PureLink 96 | Invitrogen | K310096 | PureLink 96 PCR purification kit |
QIAquick | Qiagen | 28106 | QIAquick PCR purification kit |
Filter | Corning | 431117 | 0.22 μm polystyrene filter |
Anoxomat System | Mart Microbiology b.v. | Anoxomat Mark II | |
Benchtop centrifuge | Thermo Scientific | 75004377 | Sorvall Legend RT Plus microplate rotor |
Gel Documentation | UVP LLC | BioDoc-It 210 | |
Incubator | Fisher Scientific | 11-690-625D | Isotemp |
Labnet’s Gel XL | Labnet | E0160 | Labnet’s Gel XL |
Microcentrifuge | Eppendorf | 22621408 | Microcentrifuge 5415 R |
Multichannel pipettes | Thermo Scientfic | 4661040, 4661020 | Finnpipette F1 |
Thermal Cycler | Applied Biosystems Inc. | N805-0200 | GeneAmp PCR system 9700 |