Summary
Análise da anatomia cerebrovascular roedor desempenha um papel importante na investigação do acidente vascular cerebral experimental. Neste contexto, a perfusão intravascular com látex corado tem sido considerada como um instrumento padrão para vários anos. No entanto, esta técnica implica limitações técnicas distintas, que minam a sua reprodutibilidade. Aqui, nós descrevemos um método simples para visualizar os vasos cerebrais, de uma forma reprodutível. A injecção de uma mistura de duas tintas pretas de carbono disponíveis comercialmente, através dos resultados do ventrículo esquerdo do miocárdio, em enchimento adequado de vasos cerebrais com visualização de alto contraste. Nós temos aplicado com sucesso esta técnica para identificar os pontos de anastomose entre territórios vasculares cerebrais de ratos com diferentes origens genéticas. Finalmente dar provas de que este método novo e simples para a coloração de navio podem ser combinados com cloreto de trifeniltetrazólio (TTC) de coloração - uma ferramenta amplamente utilizada para observar e analisar volumes do enfarte em ratos.
Abstract
A estrutura anatômica dos vasos cerebrais é um factor determinante para a hemodinâmica do cérebro, bem como a gravidade da lesão após lesões isquémicas. A vasculatura cerebral dinamicamente responde a diversos estados patofisiológicos e exibe diferenças consideráveis entre estirpes e em condições de manipulações genéticas. Essencialmente, uma técnica adequada para a coloração de vasos intracranianos é essencial, a fim de estudar a patogénese da isquemia cerebral. Até recentemente, a um conjunto de diferentes técnicas tem sido utilizada para visualizar a vasculatura cerebral, incluindo a injecção de resina de baixa viscosidade, araldite F, gelatina misturada com diversos corantes 1 (isto é, vermelho carmim, India tinta) ou de látex, com 2 ou 3, sem carbono negro. Perfusão de composto de látex branco através da aorta ascendente foi primeiramente relatada por Coyle e Jokelainen 3. Maeda et al. 2 ter modificado o protocolo, acrescentando carbon tinta preta para o composto de látex para visualização melhor contraste dos vasos após a perfusão de solução salina do cérebro. No entanto, a perfusão ineficiente e enchimento insuficiente dos vasos são frequentemente experimentado devido à alta viscosidade do composto de látex 4. Assim, descrevemos uma técnica simples e de baixo custo, utilizando uma mistura de duas tintas de carbono disponíveis comercialmente pretas (CB1 e CB2) para visualizar o sistema vascular cerebral de um modo reprodutível 5. Nós mostrámos que a perfusão com CB1 CB2 + em ratos resulta na coloração de vasos cerebrais significativamente menores a uma densidade mais elevada em comparação com a perfusão de látex 5. Aqui, descrevemos nosso protocolo para identificar os pontos de anastomose entre o anterior (ACA) e artérias cerebrais médias (ACM) para estudar as variações dos vasos em ratos com diferentes origens genéticas. Finalmente, demonstrar a viabilidade da nossa técnica de um modelo de isquemia cerebral focal transiente em ratos através da combinação de CB1 +CB2 mediada por coloração com TTC vaso de coloração em vários graus de lesões isquémicas.
Protocol
1. Animais
- Os experimentos foram realizados de acordo com as diretrizes do NIH para o cuidado e uso de animais de laboratório e aprovado pelas autoridades locais. Para todas as experiências, C57BL6 / J ratinhos do tipo selvagem, ApolipoproteinE - / - (ApoE KO) e murganhos SV129 (12-16 semanas de idade, 26-30 g de peso corporal, 5-6 animais por grupo experimental) foram utilizados.
2. A coloração dos vasos cerebrais com látex colorido
- Prepara-se uma mistura de 25 ul de tinta de carbono preto (Herlitz, Germany) com 0,5 ml de composto de látex (Pebeo, França) numa razão de 1:20 em um tubo de PE e aquecer a mistura a 37 ° C num banho de água. Recolher a mistura em uma seringa de 2 ml com uma agulha de 28-30G antes anestesiar o animal.
- Dissolver 50 mg de pó de hidrocloreto de papavarine em 1 ml de solução salina normal estéril. Recolher a solução de uma seringa de insulina. Parta a agulha de outra seringa de insulina estéril. Coloque esta agulha no final de um c 20m tubo PE10 de comprimento. Agora anexar este tubo PE10 sobre a agulha da seringa de insulina contendo uma solução de cloridrato de papavarine a ser injectado através da veia femoral para assegurar o enchimento correcto e vasodilatação dos vasos.
- Preparar outras duas seringas de insulina de 1 ml cada de solução salina contendo. Seringas de insulina permitir a entrega suave do fluido injectado a uma localização precisa. No entanto, devido à alta viscosidade do látex, alternativa seringas de 1 ml com agulhas removíveis mais largas devem ser usados.
- Tomar todas as seringas e instrumentos esterilizados dissecando próximas à fase operacional. Espalhe uma folha draper cirúrgica em torno da fase de operação. A fase de operação devem ser suficientemente iluminada e um microscópio de operação pode ser utilizado, se necessário.
- Agora medir o peso do corpo de um rato C57BL6 / J e, em seguida, induzir a anestesia com isoflurano a 5% vaporizado em 70% de N 2 O e 30% de O 2. Continuar a anestesia com 1% de isoflurano vaporizado. Após POSICIONAM adequadag do mouse em sua parte traseira e fixação dos membros, avaliar a profundidade da anestesia. Em seguida, corte a pele sobre a veia femoral esquerda e localizar a veia. Introduzir a ponta afiada da agulha colocado no tubo PE10 e injecte lentamente uma solução de cloridrato papavarine a uma taxa de 100 ul por minuto (50 peso corporal mg / kg).
- Após a injecção, a cavidade abdominal cortar e perfurar o diafragma. Corte as costelas para expor o coração, sem danificar ou nódoas negras-lo. Clipe da aorta torácica descendente com uma pinça de artérias. Faça um corte afiado sobre o átrio direito para permitir que o sangue venoso drenado. Injectar 2 ml de solução salina no ventrículo esquerdo, seguida de injecção do látex colorido manualmente com uma ligeira pressão sobre 18-20 seg. Usar as seringas pré-cheias, uma após a outra. Evite injetar bolhas.
- Após a injecção de látex, deixam o animal, durante 5 min. Decapitar o animal e retire cuidadosamente todo o cérebro. Cuide bem para não ferir a arquitetura do vaso e cortex, removendo o osso do crânio e meninges. Coloque o cérebro em um prato de 60 milímetros de cultura de células contendo 6-8 ml de PFA 4% para tirar uma foto. Coloque uma régua de medição debaixo do prato transparente. Tire fotos com uma ampliação de 25x da dorsal e da superfície ventral do cérebro com uma câmera acoplada ao microscópio cirúrgico. Fotografias devem ser tomadas em ângulo de 90 ° entre a placa de Petri e a objetiva do microscópio a fim de quantificar a distância original.
- Repetir o processo em outros animais 4-5.
3. A coloração dos vasos cerebrais com Mistura de Tintas Carbon Black
- Para comparar os resultados da coloração de látex baseado vascular cerebral com nosso protocolo, preparar uma mistura de 100 ul de Herlitz Stempelfarbe tinta (CB1) com 900 ul de tinta Pelican Scribtol Schwarz (CB2), em um tubo de 1,5 ml EP. Preparar dois tubos de PE para fazer um volume total de 2 ml de mistura de CB1 e CB2 na proporção 1:9. Recolher a mistura de duas seringas de insulina separadas (1ml de cada). Tapar as seringas e coloque-os num banho de água a aquecer até 37 ° C. Recolha de 2 ml de soro fisiológico em mais duas seringas de insulina, e coloque-os num banho de água também.
- Anestesiar o animal e repita o mesmo procedimento como descrito acima, excepto por injecção de cloridrato de papavarine. Após a injecção de 2 ml salaine para o ventrículo esquerdo, injectar uma mistura de 2 ml de tinta de negro de fumo, em vez do látex colorido. Execute as injeções à mão com uma ligeira pressão sobre 18-20 seg por ml. Clipe da aorta torácica descendente antes das injeções.
- Sacrificar o animal, remover o cérebro e tirar fotos.
- Para preservação a longo prazo do cérebro, o cérebro colocar em PFA a 4% durante a noite, seguido de incubação com sacarose com uma concentração gradualmente crescente até que o cérebro flutuante submerge totalmente (5% seguido de 15% e, em seguida, 30%). Os cérebros dos animais foram perfundidas com o látex colorido pode também ser mantida na mesma forma.
- Realize oprocedimento em outros animais 4-5. Para comparar a diferença na anatomia vascular cerebral devido às características genéticas ou cepas diferentes, repita o protocolo em igual número de ApoE KO e SV129 ratos, respectivamente.
- Para estudar a anatomia vascular sob condições isquémicas, induzir isquemia focal cerebral transitória durante 45 min ou 90 min de acordo com um protocolo padrão de oclusão intraluminal da MCA, sob anestesia profunda (uma descrição detalhada da cirurgia está para além do âmbito deste artigo, o leitor é remetido para Doeppner et al., 2010). No final do período de reperfusão planeado (1 dia e 5 dias), realizar a coloração vascular com CB1 CB2 + tintas únicas e manchar todo o cérebro, com 2% de solução de TTC a 37 ° C durante 5-10 minutos para identificar o volume do enfarte . TTC é reduzido a formazano colorido vermelho pelas enzimas mitocondriais (desidrogenase particularmente succinato). Após a coloração TTC, as manchas de tecido metabolicamente ativos vermelho escuro, enquanto o tecido infartado permanece unstaiNed e aparece em branco devido a disfuncional e desnaturado enzima mitocondrial. Recolher imagens da mesma maneira como descrito acima.
4. Estudo da Cerebral territórios vasculares
- Para analisar a anatomia dos vasos cerebrais, imagens da superfície dorsal do cérebro ou manchado com látex colorido ou CB1 CB2 + tintas podem ser analisados com software ImageJ (um software Java de domínio baseado público utilizado para o processamento e análise de imagens). Cérebros perfundidos com látex colorido pode mostrar graus variáveis de coloração embarcação localizada na superfície dorsal, enquanto CB1 CB2 + perfusão irá manchar todos os vasos em ambas as superfícies ventrais e dorsais.
- Abrir um arquivo de imagem com o software ImageJ. Identificar todos os pontos de anastomose entre o ACA e da MCA. Um ponto de anastomose é definido como o local onde o diâmetro do vaso é o mais estreito ou a meia distância entre os pontos mais próximos que ramificam da ACA e da MCA os ramos, respectivamente 2.
- Defina a escala em mm. Medir a distância entre a linha de anastomose e da linha média, 4 mm caudal ao poste frontal do cérebro, utilizando a ferramenta de desenho em linha recta e "medida" da ferramenta. Fazer o mesmo caudal de 6 mm a partir do pólo frontal. Analisar as imagens de 3-4 por animal e calcular o valor médio. Comparar os valores entre os grupos diferentes de animais para identificar a variação da anatomia cerebrovascular. Em C57BL6 / J animais, a linha de anastomose entre o ACA e da MCA pode ser rastreada mais perto da linha média, 4 mm de 6 mm de caudal do pólo frontal. Camundongos ApoE KO vai apresentar nenhuma diferença significativa a este respeito. Pelo contrário, em SV129 ratos da linha anastomótica mentirei mm mais e paralelamente à linha mediana ambos a 4 mm e 6 caudalmente do pólo frontal.
- Para analisar a anatomia vascular in condições de isquemia, os mesmos cálculos acima mencionados. Identificar a fronteira infarto como a margem de tecido vermelho e branca representando tecido metabolicamente ativo e tecido sem manchas necróticas, respectivamente. Medir a distância da borda enfarte da linha média, 4 mm, 6 mm e caudal do pólo frontal do cérebro. Recolher o valor médio a partir de imagens 3-4 por animal. Comparar os resultados entre isquemia diferente e períodos de reperfusão.
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Representative Results
O protocolo aqui descrito supera as limitações técnicas de visualização de látex convencional com base da vasculatura cerebral roedor. Figura 1A mostra que a perfusão seguinte do látex corado, apenas os vasos grandes na superfície ventral são corados, deixando toda a superfície dorsal imaculada. O resultado é também altamente variável. Apenas um animal de cada seis mostra coloração parcial da ACA e da MCA visível na superfície dorsal do cérebro (dados não apresentados). Por outro lado, CB1 CB2 + resultados de perfusão em enchimento suficiente de embarcações pequenas e grandes de uma forma igual (Figura 1B). A coloração é estável até 7 dias sem qualquer alteração da qualidade. Utilizando o programa ImageJ, temos quantificada a distância dos pontos de anastomose entre o ACA e da MCA da linha média no tipo selvagem C57BL6 / mice J (Figura 1C). Compararmos esses valores com camundongos ApoE KO para observar ou não a genética MODIFICAÇÃno teve qualquer efeito sobre a anatomia regional vascular (Figura 1D). Apesar de bater para fora de ApoE não afetou a estrutura anatômica dos vasos cerebrais em C57BL6 / J ratos, uma diferença significativa foi observada entre C57Bl/6J e SV129 cepas (Figura 1E, F). Assim, somos capazes de mostrar a viabilidade deste protocolo de coloração para avaliar as diferenças anatômicas da vasculatura cerebral devido a diferenças genéticas ou tensão em camundongos.
Em modelos experimentais de acidente vascular cerebral em roedores, coloração TTC é amplamente utilizado para observar o volume do enfarte. Visualização simultânea dos vasos cerebrais eo volume infarto nos dar a oportunidade de analisar as alterações morfológicas após isquemia-reperfusão. Por conseguinte, temos verificado que não CB1 CB2 + coloração vascular mediada era estável com coloração TTC em vários graus de lesões de reperfusão-isquémica (Figura 2A-C). Temos ainda analisada a anastomose pontos entre a ACA e da MCA, após 45 min ou 90 min de isquemia, quer combinados com um dia ou 5 dias períodos de reperfusão (Figura I, J). Como esperado, a distância média entre a linha média e os pontos anastomóticos não mostrou diferença significativa entre os grupos (Figura 2I, J) e foi na mesma gama, com os animais não isquémicos (Figura 1F). No entanto, a distância a partir da linha média para a fronteira enfarte diferiram significativamente, o que reflecte o volume de enfarte do aumento com maior grau de isquemia-reperfusão (Figura 2K, L). Estes dados mostram que CB1 CB2 + coloração pode ser reproduzido nos animais submetidos a vários graus de isquemia-reperfusão e a estabilidade da coloração, quando combinado com a coloração de TTC.
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Figura 1. A observação da anatomia vascular cerebral em ratos com diferenças genéticas e tensão. Figura 1A mostra que a perfusão endovenosa de látex coloridas manchas únicas grandes vasos na superfície ventral, enquanto que a superfície dorsal permanece imaculada. Por outro lado, CB1 CB2 + resultados de perfusão na coloração permanente de ambas as pequenas e grandes vasos no ventral e as superfícies dorsais do cérebro (Figura 1B). Quantificação da distância dos pontos de anastomose entre a artéria cerebral anterior (ACA) e da artéria cerebral média (MCA) da linha média em ratinhos de tipo selvagem C57BL6 / J (Figura 1C), não mostram qualquer diferença com os seus homólogos geneticamente mutantes ApoE KO (Fig. 1D). No entanto, diferença significativa é observada entre C57BL6 / J e SV129 cepas (Figura 1E, F). Scale bar = 2mm. * Significativamente diferente tanto do tipo selvagem C57BL6 / J e ratinhos ApoE KO a 4mm, p p <0,01.
Figura 2. Análise da anatomia vascular no cérebro isquémico. Figura 2A imagens mostram-H das superfícies ventrais e dorsais dos cérebros submetidos a 45 min de isquemia e 90 min, seguido por um dia ou 5 tempo de reperfusão dias. O painel esquerdo mostra CB1 CB2 + coloração vascular mediada, enquanto que o painel direito mostra combinação de ambos a coloração vascular e coloração com TTC, indicando a estabilidade da coloração vascular em vários graus de lesões de reperfusão-isquémica (Figura 2A-C). A análise dos pontos anastomose entre a artéria cerebral anterior (ACA) e da artéria cerebral média (MCA), após 45 min ou 90 min de isquemia, quer combinados com o período de reperfusão de 1 dia ou 5 dias depictos não houve diferença significativa entre os grupos (Figura 2I, J). No entanto, a diferença significativa pode ser observado a distância a partir da linha média para a borda do miocárdio, indicando o aumento de volume do enfarte, com maior grau de isquemia-reperfusão (Figura 2K, L). Barra de escala = 2 mm. * Significativamente diferente da isquemia de 45 minutos de reperfusão com 1 dia, p <0,05, ** reperfusão e 5 dias, p <0,01. para ver figura maior .
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Discussion
Perfusão de CB1 CB2 + por injecção manual pode ser realizada com sucesso por sem treino intensivo, uma vez que não envolve qualquer dispositivo específico para implicar uma certa pressão 2,3. A heterogeneidade dos resultados de perfusão em nosso protocolo também é insignificante. Só o animal um dos 16 animais não-isquêmicas e 3 de 20 animais isquêmicos mostraram perfusão incompleto. Nesses casos, a incorporação de bolhas durante a perfusão de solução salina levando a oclusão dos vasos foi mais provavelmente o motivo do insucesso.
Embora a perfusão de látex foi originalmente efectuada através da aorta ascendente 2,3, vias alternativas de perfusão também são relatadas, incluindo o ventrículo esquerdo 7,8 ou a artéria carótida comum 9. Não foi observada diferença significativa na perfusão seguintes resultados, quer através da aorta ascendente ou do ventrículo esquerdo (dados não publicados). Como tal, este último foiescolhida devido à sua fácil acessibilidade.
Antes de escolher as tintas pretas de carbono específicos mencionados no presente estudo, foram avaliados os resultados de perfusão intravascular com uma variedade de tintas de carbono disponíveis comercialmente pretas. CB1 e CB2 são escolhidos pela sua eficiência e estabilidade de perfusão de coloração. CB1 tem uma viscosidade muito baixa (1,1 mPa / seg), contendo 2,1% de negro de fumo, enquanto CB2 - originalmente fabricado como uma tinta de caligrafia - contém 2,5% de carbono negro com uma viscosidade mais elevada (10-50 mPa / s). Aplicação individual destas tintas verificou-se ser insuficiente, tanto em termos de eficiência e estabilidade de coloração. Consequentemente, nós combinamos as tintas e titulada as proporções de combinação. Perfusão com CB1: CB2 em uma relação resultados 01:09 em coloração permanente de ambos os navios grandes e pequenos. Portanto, os pontos arteriais anastomóticos pode ser facilmente rastreada para definir a junção entre dois territórios vasculares, ou seja. a ACA e da MCA. Estes findings são consistentes com relatórios anteriores 2,10,11.
Camundongos ApoE KO apresentar 5-8 vezes maior nível de colesterol plasmático e são altamente suscetíveis ao desenvolvimento de aterosclerose quando colocar em dieta rica em colesterol 12. Se a modificação genética também afecta a anatomia dos vasos cerebrais, não foi relatado ainda. Por outro lado, os ratinhos são SV129 já relataram a apresentar maior volume de enfarte, em comparação com ratinhos C57BL6 / J, devido à sua anatomia vascular diferente 2. Verificamos nosso protocolo nestes três grupos de animais para comparar a diferença de anatomia vascular.
Para validar o protocolo de coloração nos cérebros isquêmicos, que envolveu isquemia focal cerebral transitória para incluir efeitos de reperfusão em contraste com estudos anteriores, que centram principalmente na oclusão permanente da MCA 2-4, 10,13. Como esperado, não observamos diferenças significativas no padrão da line da anastomose após diferentes períodos de isquemia e reperfusão em ratos C57BL6 / J. Sem alterações nos diâmetros dos vasos entre os hemisférios isquêmicas e não-isquêmica foram observados, provavelmente, essas mudanças ocorrem em períodos mais longos de reperfusão, isto é, 2-3 semanas pós-AVC 14. Em conclusão, o protocolo demonstrado por nós é menos complicada, a técnica de custo-eficácia, que pode ser facilmente reproduzida, em comparação com a perfusão de látex convencional com base de visualizar a vasculatura cerebral. Ele pode ser considerado como uma ferramenta eficaz para analisar a anatomia dos vasos cerebrais e territórios vasculares em diferentes condições fisiológicas e patológicas. Através da combinação com a coloração TTC esta técnica proporciona uma nova oportunidade para identificar a extensão de um insulto isquémico no contexto de zonas de abastecimento vasculares no cérebro.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer a Britta Kaltwasser por sua excelente assistência técnica e Mahesh Kumar Teli para organizar a preparação filmagens de vídeo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Scribtol Schwarz (CB2) | Pelican, Germany | 221 135 | |
| Stempelfarbe (CB1) | Herlitz PBS AG, Germany | 10417202 | |
| Gedeo Latex | Pebeo, France | 13042B |
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