Summary
Вклад ремоделирования хроматина ACF фактор E4orf4-индуцированной гибели клеток была измерена. Протокол включает в себя отбор клеточных клонов, в которых доксициклин Лечение вызывает условную нокдаун ACF подразделений Acf1 и SNF2h и использование анализа DAPI для измерения E4orf4-индуцированной гибели клеток в линии индуцибельной клетки.
Abstract
Функциональная инактивация экспрессии генов в клетках млекопитающих имеет решающее значение для изучения вклада белков, представляющих интерес для различных 1,2 путями. Тем не менее, условное нокдаун экспрессии гена требуется в тех случаях, когда учредительные нокдаун не допускается клетками в течение длительного периода времени 3-5. Здесь мы опишем протокол для приготовления клеточных линий, позволяющих условного нокдаун подразделений реконструкции фактора ACF хроматина. Эти клеточные линии облегчения определения вклада ACF к индукции клеточной смерти аденовирус E4orf4 белка 6. Последовательности, кодирующие коротких РНК шпилькой для Acf1 и SNF2h подразделений ремоделирования хроматина фактора ACF были клонированы рядом с доксициклином индуцируемого промотора в плазмиды, содержащие также ген для гена устойчивости к неомицину. Неомицин-устойчивых клеточных клонов были отобраны в присутствии G418 и изолированным. В результате клеточных линий были вызваныдоксициклин лечение, и как только Acf1 или SNF2h уровни экспрессии были снижены, клетки трансфицировали плазмидой, кодирующей E4orf4 или пустой вектор. Для подтверждения конкретного эффекта конструкций ShRNA, уровни Acf1 или SNF2h белка были восстановлены в WT уровней котрансфекции с плазмиды выражения Acf1 или SNF2h которые были оказаны устойчивы к ShRNA путем введения молчащих мутаций. Способность E4orf4, чтобы вызвать гибель клеток в различных образцах определяли с помощью анализа DAPI, в которых частота появления ядер с апоптоза морфологией в трансфицированных популяции клеток измеряли 7-9.
Протокол, описанный здесь, может быть использована для определения функционального вклада различных белков в индукции клеточной смерти со стороны своих партнеров белка в случаях, когда учредительные нокдауна может быть клетка смертельным.
Protocol
1. Генерация линии Индуцибильные сотовых
- До начала эксперимента нужно найти минимальную концентрацию препарата G418, который убивает все клетки используют для приготовления желаемых клеточных линий. Для этого, плиты клетки выбор в нескольких дублирующих пластин при 70% слияния в среде, которая будет использоваться в ходе эксперимента и добавить повышение концентрации G418 (0-1000 мкг на мл). Мониторинг клетки ежедневно, чтобы определить минимальную концентрацию G418, который убивает клетки эффективно. Гибель клеток наблюдается в течение 3-7 дней.
- До поколению клеточных линий рекомендуется проверить, переходный анализы трансфекции, что плазмиды выражения ShRNA можете уменьшить до некоторой степени экспрессии гена в стадии изучения. Это может быть сделано в любой ячейке строки, которая может быть эффективно трансфекции.
- Пластина T-Rex-293 клеток при плотности около 5х10 6 клеток на 10 см пластины в 8 мл DMEM среде (содержащей 10% Tet систволовые утвержденных FBS, 2 мМ L-глутамина, 100 единиц на мл пенициллина и 0,1 мг на мл стрептомицина, 5 мкг на мл бластицидин). Инкубируйте пластины течение ночи при 37 ° C, 5% CO 2.
- На следующий день, изменить среду до 8 мл свежей среды до трансфекции.
- Трансфекции клеток с использованием 10 мкг pSuperior.neo + GFP плазмиды (рис. 1) кодирование Acf1 или SNF2h ShRNA обусловлено тетрациклин-индуцируемых H1 промоутера, а также неомицин ген устойчивости, слитый с GFP и управляется конститутивный промотор PGK. Добавить ДНК в 500 мкл 150 мМ NaCl. Добавить jetPIE реагента в другой аликвоты 500 мкл 150 мМ NaCl в 2 мкл на мкг ДНК. Добавить jetPIE решение ДНК и хорошо перемешать встряхиванием. Инкубировать в течение 15 мин при комнатной температуре. Аккуратно пипетки комплексов ДНК на 10 см пластин, содержащих 70-80% вырожденная клеток. Вернуться пластин в инкубатор.
- На следующий день заменить среде с селективной среде (DMEM среде,описанные выше содержащий дополнительные 500 мкг на мл G418).
- В течение следующих двух недель следить за клетками и заменить селективной среде с аналогичным свежую среду каждые 3-4 дня до колонии появляются и могут быть визуализированы без микроскопа.
- До выделения колоний, подготовить 24-луночные планшеты с селективной средой.
- Определить колонии на глаз, и отметьте их расположение в нижней части панели с помощью цветных маркеров. Проверка под микроскопом, что колонии хорошо разделены.
- В стерильных капот, аспирации среды от плиты, аккуратно смойте теплой PBS и аспирации а все остальные жидкости. Добавить 3 мкл 0,25% трипсин / ЭДТА в одной колонии на тарелку. Внесите трипсина, пока клетки отделяются и добавить их в одной из скважин в 24-луночный планшет. Повторите это несколько других колоний на тарелку.
- Рост клеток при 37 ° C, 5% CO 2, пока они заполняют хорошо. Затем разделить клетки, полученные изКаждый из первых колоний в трех скважин, каждая в отдельном 12-луночный планшет, и инкубировать в течение ночи.
- На следующий день, замените носитель в одной пластине с среде, содержащей 1 мкг на мл доксициклина из маточного раствора, подготовленный в дважды дистиллированной воде (1-5 мг на мл). Замените среду в контрольной чашке со средними без доксициклина. Инкубируйте клетки в течение 72 ч при температуре 37 ° C, 5% CO 2.
- Урожай клеток от одного рассматривать и одного необработанного и каждой клетки клона для приготовления протеиновых экстрактов и Вестерн-блоттинга для определения эффективности Acf1 или SNF2h нокдаун. Использование антител к Acf1 или SNF2h, а также антител к альфа-тубулина, выступающей в качестве управления загрузкой. Используйте клеток в третьей скважины, лечить, для расширения выбранного клеточных клонов, в которых доксициклин Кроме привело, по меньшей мере, 50% снижение уровня белка в стадии изучения. Замораживание аликвоты этих клеток в 90% FBS, 10% DMSO для дальнейшего использования.
- Пластина клеток в селективной среде в 10 см пластин. Добавить доксициклин в дозе 1 мкг на мл до половины пластины и инкубировать при 37 ° C, 5% CO 2 в течение 48-72 ч (см. Рисунок 4).
- Через 48-72 ч, trypsinize клеток из каждой группы клеток, сосчитать их, и пластины 1.5x10 6 клеток на 6 см пластины в той же среде, с или без доксициклина. Инкубируйте клетки при 37 ° C, 5% CO 2 в течение ночи. План таким образом, чтобы каждая группа плит из раздела 2.1 обеспечит клетки в течение двенадцати 6 см пластины, в том числе двух экземплярах для анализа DAPI для каждой точки, а также одна пластина для вестерн-блот анализ каждого образца (см. рисунок 4).
- На следующий день трансфекции клеток в 6 пластин см со следующей комбинации плазмид: 1 мкг пустой плазмиды или одинаковое количество плазмиды, кодирующей E4orf4, вместе с 4 мкг векторавыражающий Acf1-GFP или SNF2h-GFP оказанных устойчивы к ShRNA в клеточных клонов путем введения молчащих мутаций, или 3 мкг соответствующий пустой вектор и 1 мкг плазмиды выражения GFP (рис. 4). Используйте jetPIE реагента, как описано выше (10 мкл на 5 мкг ДНК), чтобы подготовить трансфекции смесь. Для каждого образца, готовить смесь для трансфекции трех пластин.
- После 15 мин инкубации ДНК с jetPIE реагентов при комнатной температуре, осторожно пипеткой равное количество комплексов ДНК от каждой трансфекции смесь на три 6 пластин см и инкубируют при 37 ° C, 5% CO 2 в течение ночи.
3. DAPI анализа в трансфицированных клетках
- На следующий день, извлечения белков из одной пластины на пробы для анализа блот Западной определить, что Acf1 или SNF2h были эффективно сбили с ног и, что E4orf4 было выражено одинаково в разных образцов.
- Аспирируйте среды от плиты предназначены для DAPIАнализ, мыть пластины осторожно PBS и добавьте 1 мл 4% параформальдегида подготовлен в PBS, чтобы покрыть клеток. Приготовление раствора формальдегида и лечение клетки с этого химического вещества должна осуществляться в химической капот. Инкубировать в течение 15 мин при комнатной температуре без встряхивания.
- Аспирируйте параформальдегида и вымыть три раза с PBS, раскачиваясь при комнатной температуре в течение 5 минут каждый раз. Добавить 80% этанола храниться при температуре -20 ° C и инкубировать при температуре -20 ° C в течение не менее 1 часа. Пластины можно держать под этанола при -20 ° C в течение нескольких дней, пока они запечатаны также для предотвращения испарения этанола и сушки.
- Аспирируйте этанола и промыть клетки дважды с PBS и один раз PBS-BT (PBS, содержащем 0,5% БСА и 0,05% твин-20), раскачиваясь при комнатной температуре в течение 5 минут каждый раз.
- Для предотвращения неспецифического связывания антител, блокировать клеток в 1 мл PBS-BT буфера, содержащего 10% козьей сыворотки в течение 20 мин при качалки при комнатной температуре. Затем промыть тОн клетки дважды в PBS-BT, 5 мин каждого мытья.
- Инкубируйте клетки с первичными антителами (E4orf4-специфических антител в нашем случае) в 1 мл PBS-BT в течение 1 часа при качалки при комнатной температуре. Затем промыть дважды в PBS-BT и один раз в PBS, содержащем 0,1% БСА, 5 мин каждого мытья.
- Инкубируйте клеток в 1 мл PBS-0.1% BSA содержащий соответствующие вторичные флуоресцентно-меченые антитела и 0,5 мкг на мл конечная концентрация DAPI в течение 40 мин при качалки при комнатной температуре в темноте. Затем промыть водой с PBS в течение 5 мин, высушить и стремлением сохранить и пластины с ног на голову в течение дополнительного часа ночи, чтобы достичь полного высыхания. Затем установите крышку слайды на клетки, используя Fluoromount-G решений. Храните пластины при температуре 4 ° С в темноте до готовности рассчитывать апоптоза ядер.
- Попросите коллегу для идентификации различных пластин нового номера, поэтому подсчет апоптоза ядер в различных образцах может быть сделано в непредвзято.
- Визуализируйте клеток при Upright флуоресцентный микроскоп с увеличением 400X (в воздухе) или 630X (в иммерсионного масла). Определить трансфицированных клеток, которые окрашиваются в различные белки, выраженные в каждом образце, и подсчитать количество конденсированных или фрагментированных ядер визуализировали окрашиванием DAPI в трансфицированных клеточной популяции. Мониторинг нескольких полей и рассчитывать в общей сложности не менее 200 трансфицированных клеток.
- Рассчитать процент ядер с апоптоза морфологией в трансфицированных клеточной популяции. Повторите эксперимент с дубликатами, 2-3 раза для расчета статистической значимости различий между различными образцами.
4. Представитель Результаты
Эффективность получения колоний, в которых условные нокдаун экспрессии генов был успешным является переменной величиной, в зависимости от гена, вовлеченного. В наших руках, мы получили 7 успешных колоний из 12-тестирование на Acf1 и 6 из 18 для SNF2h. Рис. 2 шРМО представитель пластины отдельных клеточных клонов (рис. 2A), а также одной колонии (рис. 2В). рисунке 3 показана представитель пятно подготовлен с белками извлечены из клеток различных клонов, выращенных в присутствии или отсутствии доксициклина в течение 72 часов. Пятно окрашивали антителами к SNF2h и альфа-тубулина, выступающей в качестве управления загрузкой. Два из клонов (№ 4 и 5) показал сильное снижение уровня SNF2h на доксициклин индукции. Следует отметить, что, хотя pSuperior.neo + GFP плазмиды (рис. 1) используется для генерации клеточных линий, кодирующий GFP нео-гибридного белка, зеленая флуоресценция в стабильных клеточных линий была очень низкой и экспрессии других белков слияния GFP введены временно в эти клетки могут быть легко обнаружены над флуоресценции зеленом фоне.
Схематическое изображение экспериментов, проведенных в клеточных клонов для измеренияУбедитесь, что эффект Acf1 или SNF2h нокдаун на E4orf4-индуцированной гибели клеток показано на рис. 4. Время, необходимое для нокдаун экспрессии генов лечения доксициклином может варьироваться в зависимости от стабильности белков, уровни которых должна быть уменьшена. Для Acf1 и SNF2h, 72 часа лечение было необходимо для эффективной нокдаун на уровне белка.
Рисунок 5 показывает пример клеток, экспрессирующих GFP и E4orf4 и проходит гибели клеток проявляется в появлении DAPI-окрашенных ядер с конденсированной или фрагментарной морфологии. Рисунке 6 показан результат представителя эксперимент демонстрирует, что доксициклин вызванных Acf1 нокдаун привело к увеличение E4orf4-стимулированной клеточной гибели (рис. 6а). Это увеличение не в результате увеличения E4orf4 уровней (рис. 6В). Кроме того, восстановление Acf1 на доксициклин клетках в уменьшил увеличение E4orf4 токсичность по отношению к уровням наблюдался в неиндуцированных клетки (рис. 6).
Рисунок 1. Карта pSuperior.neo + GFP плазмиды. На карте показаны тетрациклин-индуцируемых H1 промоутер вождения ShRNA выражения и промотор PGK вождения выражением нео-гибридный белок GFP. Карта была адаптирована из руководства OligoEngine pSuperior.
Рисунок 2. Определение неомицин-устойчивых колоний. Изображения пластину, содержащую колонии (А) и одну колонию (B) показаны. В колониях были получены путем культивирования клеток в течение 14 дней в селективной среде, содержащей неомицин.
Рисунок 3. Экспертиза нокдаун эффективности в отдельных колониях. Клетки несколько колоний выбран в присутствии неомицин высевают в двух экземплярах скважин. Один хорошо каждого образца было вызвано доксициклин (+) и одна скважина осталась необработанной (-). Белки были извлечены 72 часа после индукции и хроматографируют на SDS-PAGE. Вестерн-блот был запятнан последовательно с антителами к SNF2h и альфа-тубулина (выступающей в качестве управления загрузкой) и показывает SNF2h уровней в индуцированной и контрольными клетками.
Рисунок 4. Планирование типичный нокдаун-DAPI анализа эксперимента. Последовательные этапы эксперимента показали, в том числе доксициклин лечение для достижения Acf1 или SNF2h нокдаун, трансфекции для восстановления Acf1 или SNF2h выражения или ввести EMPти вектора и ввести E4orf4 или его соответствующей пустого вектора в клетки, и анализ результатов. Доксициклин обработанные пластины показаны красным (DOX) и контроля пластин отмечены синим цветом. Нажмите, чтобы увеличить показатель .
Рисунок 5. Обнаружение E4orf4-индуцированной гибели клеток с помощью анализа DAPI. Клетки, которые подверглись различные процедуры, описанные на рисунке 4 фиксировали и окрашивали с E4orf4-специфических антител и DAPI для визуализации ядер трансфицированных клеток. Данная картина была взята из образца, содержащего E4orf4 и белка GFP управления. (A) GFP. (B) E4orf4. (C) DAPI. (D) объединенного изображения. Белые стрелки знак GFP-и E4orf4-трансфицированных клеток, содержащих ядра с апоптоза морфологией. Красные стрелкиотметить ядра неправильной формы, которые не учитываются в качестве апоптоза ядер. Звездочки знак ядер митотического или ядер, которые просто разделились.
Рисунок 6. Acf1 нокдаун повышает E4orf4-индуцированной гибели клеток. (А) Клетки из T-REX-293, полученных клеточных линий выразив Acf1-ShRNA от тетрациклина индуцируемый промотор был индуцирован с доксициклином (+ Dox) или не лечить (-Dox). Три дня спустя, клетки трансфицировали плазмидами, выразив E4orf4 (+ E4orf4) или пустой вектор (-E4orf4) вместе с пустого вектора или плазмиды выражения GFP с метками Acf1, которая была оказана устойчивы к ShRNA путем введения молчать мутации. Клетки были установлены двадцать четыре часа после трансфекции и окрашивали антителами к E4orf4 и с DAPI. Индукции гибели клеток измеряли с помощью анализа DAPI описано выше, и процент выводаF трансфицированных клеток со сгущенным или фрагментированных ядер была определена. Представитель эксперимент с трех повторов показано, и погрешности представляют собой стандартное отклонение. (B) Клетки из параллельных пластин были собраны для Вестерн-блоттинга. Пятно окрашивали антителами к E4orf4, GFP, и Acf1. Эндогенных Acf1 и Acf1-GFP показано в двух отдельных панелей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Нокдаун конкретных экспрессии генов является важным подходом к изучению вклада белка регуляторные пути. С учредительных нокдаун выражение существенных генов негативно влияет на пролиферацию клеток, их изучение может потребовать либо переходного введение siRNAs или применения стабильных систем условного нокдаун. Генерация стабильных клеточных линий с мощностью лекарственно-индуцированной экспрессии shRNAs описанные здесь, обеспечивает преимущество по сравнению с переходной трансфекции, которая не может быть эффективным во многих клеточных линий, и за использование вирусов, которые требуют повторяющихся подготовки, а иногда и дополнительные короткие Термин выбор. Клеточные линии, как только создан, не требует дополнительной подготовки. Кроме того, в наших руках, переходные трансфекций конструкций ShRNA были гораздо менее эффективны в нокдаун экспрессии гена по сравнению с индукцией выражением ShRNA в выбранном клеточных линий. Это рекомендуетсяред однако установить в каждом эксперименте, что медикаментозный нокдаун остается эффективным. Потенциальный недостаток использования стабильных клеточных линий для условных нокдаун экспрессии генов является то, что они, возможно, приобрели дополнительные изменения в процессе отбора, которые потенциально могут повлиять на исход эксперимента. Однако, чтобы преодолеть эту проблему, можно провести эксперимент в двух параллельных линий клеток или отменить нокдаун эффект путем введения плазмиды выражения ShRNA устойчивые WT белка. Если WT белков устраняет эффект ShRNA, то клонального эффект может быть исключена.
Классическая музыка, каспазы-зависимого апоптоза, могут быть проанализированы многочисленные методы, в том числе обнаружение активации каспаз, аннексина-V окрашивание, окрашивание туннеля, обнаружение суб-G1 клеточной популяции по FACS, и т.д. 10. Тем не менее, E4orf4 индуцирует неклассической, каспазы-независимой клеточной смерти во многих клеточных линиях и несколькими методамидля обнаружения апоптоза, не применимы для обнаружения этого уникального способа гибели клеток 6,7,11,12. Ранее было показано, что наиболее типичной морфологией, связанные с E4orf4-индуцированной гибели клеток включают мембраны блеббинга, ядерной конденсации и фрагментации, и клетка отряда 13. Поэтому мы обычно измеряют E4orf4-индуцированной гибели клеток путем анализа ядерной конденсации и фрагментации, или потерю клеток.
При использовании анализа DAPI, следует обратить особое внимание на следующие моменты: 1) Для поддержания оптимального объективности тестов, настоятельно рекомендуется, что анализ будет проводиться в "слепым", так что человек, который подсчитывает количество клеток, содержащих ядра с апоптоза морфологией не будет знать образца идентичности. 2) рекомендуется поддерживать строгие критерии для определения ядерной апоптоза морфологией, который не следует путать с ядрами митотического или ядер с unevан морфологии (см. Рисунок 5). Дополнительные анализы гибели клеток также может быть использован как для чтения из эксперимента, таких как клоны выживаемости клеток Анализы 8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана (в части) ИЗРАИЛЬ научного фонда (грант 399/11), в Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) в рамках германо-израильских проектов сотрудничества (DIP), и Институтом Раппапорт семьи по исследованиям в области Медицинских Наук.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High glucose DMEM | Gibco | 41965 | |
| Tet system approved FBS | Clontech | 631106 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200 | |
| T-REx-293 cells | Invitrogen | R710-07 | |
| G418 | Sigma | A1720 | |
| blasticidin | Invitrogen | R210-01 | |
| pSuperior.neo+GFP plasmid | OligoEngine | VEC-PBS-0007/0008 | |
| jetPIE | Polyplus transfection | 101-40 | |
| doxycycline | Sigma | D9891 | |
| paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma | D9542 | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 |
References
- Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells. Science (New York, N.Y). 296, 550-553 (2002).
- Brummelkamp, T. R., Bernards, R., Agami, R. Stable suppression of tumorigenicity by virus-mediated RNA interference. Cancer. 2, 243-247 (2002).
- Czauderna, F. Inducible shRNA expression for application in a prostate cancer mouse model. Nucleic acids research. 31, e127 (2003).
- Matsukura, S., Jones, P. A., Takai, D. Establishment of conditional vectors for hairpin siRNA knockdowns. Nucleic acids research. 31, e77 (2003).
- Wiznerowicz, M., Trono, D. Conditional suppression of cellular genes: lentivirus vector-mediated drug-inducible RNA interference. Journal of. 77, 8957-8961 (2003).
- Brestovitsky, A., Sharf, R., Mittelman, K., Kleinberger, T. The adenovirus E4orf4 protein targets PP2A to the ACF chromatin-remodeling factor and induces cell death through regulation of SNF2h-containing complexes. Nucleic acids research. 39, 6414-6427 (2011).
- Livne, A., Shtrichman, R., Kleinberger, T. Caspase activation by adenovirus E4orf4 protein is cell line-specific and is mediated by the death receptor pathway. J. Virol. 75, 789-798 (2001).
- Shtrichman, R., Kleinberger, T. Adenovirus type 5 E4 open reading frame 4 protein induces apoptosis in transformed cells. J. Virol. 72, 2975-2982 (1998).
- Shtrichman, R., Sharf, R., Kleinberger, T. Adenovirus E4orf4 protein interacts with both Ba and B' subunits of protein phosphatase 2A, but E4orf4-induced apoptosis is mediated only by the interaction with Ba. Oncogene. 19, 3757-3765 (2000).
- Galluzzi, L. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes. Cell death and differentiation. 16, 1093-1107 (2009).
- Lavoie, J. N., Nguyen, M., Marcellus, R. C., Branton, P. E., Shore, G. C. E4orf4, a novel adenovirus death factor that induces p53-independent apoptosis by a pathway that is not inhibited by zVAD-fmk. J. Cell Biol. 140, 637-645 (1998).
- Li, S. The adenovirus E4orf4 protein induces growth arrest and mitotic catastrophe in H1299 human lung carcinoma cells. Oncogene. 28, 390-400 (2009).
- Lavoie, J. N., Champagne, C., Gingras, M. -C., Robert, A. Adenovirus E4 open reading frame 4-induced apoptosis involves dysregulation of Src family kinases. J. Cell Biol. 150, 1037-1055 (2000).
