Summary
Contribuição do factor de remodelação da cromatina ACF para E4orf4 morte celular induzida foi medida. O protocolo inclui a selecção de clones de células na qual o tratamento doxiciclina induz knockdown condicional do subunidades ACF Acf1 e SNF2h, e utilização do ensaio para medir DAPI E4orf4 morte celular induzida em linhas celulares indutíveis.
Abstract
Inactivação funcional da expressão de genes em células de mamíferos é crucial para o estudo da contribuição de uma proteína de interesse a 1,2 caminhos diversos. No entanto, knockdown condicional da expressão do gene é necessária nos casos em que knockdown constitutivo não é tolerada pelas células durante um período longo de tempo 3-5. Aqui descrevemos um protocolo para a preparação de linhas de células que permitem knockdown condicional de subunidades do factor de remodelação da cromatina ACF. Estas linhas de células de facilitar a determinação da contribuição de ACF a indução da morte celular pela proteína E4orf4 de adenovirus 6. As sequências que codificam os ARN em gancho de cabelo curto para as subunidades Acf1 SNF2h e do factor de remodelação da cromatina ACF foram clonados ao lado de um promotor induzível por doxiciclina num plasmídeo que também contém um gene para o gene de resistência à neomicina. Clones de células resistentes à neomicina foram seleccionadas na presença de G418 e isolado. As linhas celulares resultantes foram induzidas pelatratamento doxiciclina, e uma vez que os níveis de expressão ou Acf1 SNF2h foram reduzidos, as células foram transfectadas com um plasmídeo codificando E4orf4 ou um vector vazio. Para confirmar o efeito específico dos construtos shRNA, os níveis de proteínas ou Acf1 SNF2h foram restaurados para os níveis WT por co-transfecção com um plasmídeo que expressa ou Acf1 SNF2h que foram tornadas resistentes ao shRNA pela introdução de mutações silenciosas. A capacidade de E4orf4 para induzir a morte das células nas diferentes amostras foi determinada por um ensaio de DAPI, em que a frequência de aparecimento de núcleos apoptóticos com morfologias, na população de células transfectadas foi medida 7-9.
O protocolo aqui descrito pode ser utilizado para a determinação da contribuição funcional de várias proteínas para a indução da morte celular pelos seus parceiros de proteína nos casos em que pode ser constitutiva knockdown célula letal.
Protocol
1. Geração de linhas celulares indutíveis
- Antes da experiência é necessário para obter a concentração mínima do fármaco G418 que mata todas as células utilizadas para a preparação das linhas de células desejados. Para este efeito, a placa de células de escolha em várias placas em duplicado a 70% de confluência no meio que será utilizado durante a experiência e adicionar concentrações crescentes de G418 (0-1.000 mg por ml). Monitorizar as células diários para determinar a concentração mínima G418 que mata as células de forma eficiente. A morte celular foi observada dentro de 3-7 dias.
- Antes de geração de linhas de células, é recomendado verificar através de ensaios de transfecção transiente de que o plasmídeo que expressa o shRNA podem reduzir em certa medida a expressão do gene em estudo. Isto pode ser feito em qualquer linha de células que podem ser transfectadas de forma eficiente.
- Placa T-REx-293 células a uma densidade de cerca de 5x10 6 células por placa de 10 cm em 8 ml de meio DMEM (contendo 10% de Tet syhaste aprovado FBS, 2 mM de L-glutamina, 100 unidades por ml de penicilina e 0,1 mg por ml de estreptomicina, 5 ug por ml de blasticidina). Incubar as placas durante a noite a 37 ° C, 5% CO 2.
- No dia seguinte, o meio de mudar a 8 ml de meio fresco antes da transfecção.
- Transfectar as células, utilizando 10 ug de plasmídeo pSuperior.neo + GFP (Figura 1) que codifica Acf1 ou shRNA SNF2h conduzido por um promotor induzível por tetraciclina H1, bem como o gene de resistência à neomicina fundido a GFP e conduzido por um promotor PGK constitutiva. Adicionar o DNA de 500 ul de 150 mM de NaCl. Adicionar o reagente de jetPIE a outra aliquota de 500 ul de 150 mM de NaCl a 2 ul por ug de ADN. Adicionar a solução jetPIE ao DNA e misturar bem em vórtice. Incubar durante 15 min à temperatura ambiente. Pipetar suavemente complexos de ADN para as placas de 10 cm, contendo 70-80% de células confluentes. Regressar as placas ao incubador.
- No dia seguinte, substituir o meio com um meio selectivo (meio DMEM comodescrito acima, contendo um adicional de 500 ug por ml de G418).
- Para as duas semanas seguintes monitorizar as células e substituir o meio selectivo com um produto semelhante fresco a cada 3-4 dias até as colónias aparecem e podem ser visualizados sem um microscópio.
- Antes do isolamento de colónias, preparar placas de 24 poços com meio selectivo.
- Identificar colónias por olho, e marca a sua localização na parte inferior da placa utilizando um marcador colorido. Verificar ao microscópio que as colónias são bem separados.
- Na capa estéril, aspirar o meio a partir da placa, com cuidado, lavar com PBS morno e aspirar todo o líquido remanescente bem. Adiciona-se 3 uL de 0,25% de tripsina / EDTA a uma colónia na placa. Pipetar a tripsina repetidamente até que as células de separar e adicione-os a um dos poços da placa de 24 poços. Repetir este para várias outras colónias na placa.
- Cultivar as células a 37 ° C, 5% CO 2, até que preencha a bem. Em seguida, dividir as células derivadascada uma das colónias originais em três poços, cada um em uma placa de 12 poços separada, e incubar durante a noite.
- No dia seguinte, substituir o meio de uma placa com meio contendo 1 ng por ml de doxiciclina a partir de uma solução stock preparada em água bidestilada (1-5 mg por ml). Substituir o meio de uma placa de controlo com meio sem doxiciclina. Incubar as células durante 72 horas a 37 ° C, 5% CO 2.
- As células a partir de uma colheita tratadas e não tratadas um poço de cada clone de células para a preparação de extractos de proteína e análise de Western blot para determinar a eficiência de Acf1 ou knockdown SNF2h. Use anticorpos para Acf1 ou SNF2h bem como anticorpos para alfa-tubulina, que serve como um controlo de carregamento. Usar as células no terceiro poço, não tratada, para a expansão de clones de células seleccionadas na qual além doxiciclina levou a pelo menos 50% de redução no nível da proteína em estudo. Congelar alíquotas destas células em 90% de FBS DMSO, 10% para utilização posterior.
- As células da placa em que o meio selectivo em placas de 10 cm. Adicionar doxiciclina a 1 ug por ml de meio e incubar as placas a 37 ° C, 5% CO 2 durante 48-72 h (ver Figura 4).
- Após 48-72 h, Tripsinizar as células de cada grupo de células, contá-los, e placa de 1.5x10 6 células por placa de 6 cm no mesmo meio, com ou sem doxiciclina. Incubar as células a 37 ° C CO, 5% 2 durante a noite. Plano, de modo que cada grupo de placas de secção 2.1 proporcionará as células por 12 placas de 6 cm, incluindo duas repetições para o ensaio DAPI para cada ponto, bem como uma chapa para a análise de transferência de Western de cada amostra (ver Figura 4).
- No dia seguinte transfectar as células em placas de 6 cm com as seguintes combinações de plasmídeos: 1 | ig de plasmídeo de um vazio ou uma quantidade idêntica de plasmídeo codificando E4orf4, em conjunto com 4 ug de um vectorexpressando Acf1-GFP ou SNF2h-GFP rendido resistente à shRNA nos clones celulares por introdução de mutações silenciosas, ou 3 ng do vector correspondente vazia e 1 | ig de plasmídeo expressando GFP (Figura 4). Utilizar o reagente jetPIE como descrito acima (10 ul por 5 ug de ADN) para preparar a mistura de transfecção. Para cada amostra, preparar uma mistura de transfecção de três placas.
- Após uma incubação de 15 min de ADN com o reagente de jetPIE à temperatura ambiente, suavemente pipetar quantidades iguais dos complexos de DNA a partir de cada mistura de transfecção para três placas de 6 cm e incubadas a 37 ° C CO, 5% 2 durante a noite.
3. DAPI Ensaio em células transfectadas
- No dia seguinte, extrair proteínas a partir de uma chapa por exemplo por Western blot para determinar se ou Acf1 SNF2h foram eficientemente derrubado e que E4orf4 era expressa igualmente nas diferentes amostras.
- Aspirar o meio das placas destinadas ao DAPIensaio, lava-se as placas cuidadosamente com PBS e adicionar 1 ml de paraformaldeído a 4% em PBS preparado para cobrir as células. Preparação da solução de paraformaldeído e o tratamento das células com este produto químico deve ser efectuada numa câmara de química. Incubar durante 15 min, à temperatura ambiente sem agitação.
- Aspirar o paraformaldeído e lavar três vezes com PBS, agitando à temperatura ambiente durante 5 min de cada vez. Adicionar etanol a 80%, mantida a -20 ° C e incuba-se à temperatura de -20 ° C durante pelo menos 1 hr. As placas podem ser mantidas sob etanol a -20 ° C durante vários dias, enquanto eles estão bem fechadas para evitar a evaporação do etanol e secagem.
- Aspirar o etanol e lavar as células duas vezes com PBS e uma vez com PBS-BT (PBS contendo BSA a 0,5% e 0,05% de Tween-20), agitando à temperatura ambiente durante 5 min de cada vez.
- Para impedir a ligação não específica de anticorpos, bloquear as células em 1 ml de tampão PBS-BT, contendo soro de cabra a 10% durante 20 minutos, enquanto agitando à temperatura ambiente. Em seguida, lave tele as células duas vezes em PBS-BT, 5 min cada lavagem.
- Incubar as células com o anticorpo primário (um anticorpo específico de E4orf4 em nosso caso) em 1 ml de PBS-BT, durante 1 hora enquanto agitando à temperatura ambiente. Em seguida, lavar duas vezes em PBS-BT e uma vez em PBS contendo 0,1% BSA, 5 min cada lavagem.
- Incubar as células em 1 ml de PBS-BSA a 0,1% contendo o anticorpo secundário marcado com fluorescência apropriado e 0,5 ug por ml de concentração final de DAPI durante 40 min, enquanto agitando à temperatura ambiente no escuro. Em seguida, lava-se com PBS durante 5 min, secar bem por aspiração e manter as placas de cabeça para baixo durante uma hora adicional a durante a noite para atingir a secagem completa. Em seguida, montar as lâminas de cobertura sobre as células, utilizando Fluoromount-G solução. Manter as placas a 4 ° C no escuro até estar pronto para contar os núcleos apoptóticos.
- Peça a um colega para identificar as várias placas com números novos, assim contando núcleos apoptóticos nas várias amostras pode ser feito de uma maneira imparcial.
- Visualizar as células sob um umicroscópio fluorescente pright com uma ampliação de 400X (no ar) ou 630X (em óleo de imersão). Identificar células transfectadas que são coradas para as várias proteínas expressas em cada amostra, e contar o número de núcleos de condensação fragmentada ou visualizados por coloração com DAPI dentro da população de células transfectadas. Monitorizar vários campos e contar um total de pelo menos 200 células transfectadas.
- Calcula-se a percentagem de núcleos com morfologia apoptótica no interior da população de células transfectadas. Repita a experiência, com duplicados, de 2-3 vezes para calcular a significância estatística das mudanças entre as diferentes amostras.
4. Resultados representativos
A eficiência de obtenção de colónias nos quais knockdown condicional da expressão de genes tem sido bem sucedida é variável, dependendo do gene envolvido. Em nossas mãos, obtivemos sete colônias de sucesso de 12 testados para Acf1 e 6 de 18 para SNF2h. Figura 2 shows uma placa representativa de clones de células seleccionadas (fig. 2A), bem como uma colónia única (Figura 2B). A Figura 3 mostra um blot representativo preparado com proteínas extraídas a partir de células de vários clones cultivados na presença ou ausência de doxiciclina durante 72 h. A membrana foi corada com anticorpos anti-SNF2h e à alfa-tubulina, que serve como um controlo de carregamento. Dois dos clones (número 4 e 5) apresentaram uma forte redução nos níveis de SNF2h sobre indução doxiciclina. Deve-se notar que, embora a GFP + pSuperior.neo plasmídeo (Figura 1) usado para a geração de linhas celulares codifica uma proteína de fusão GFP-neo, a fluorescência verde em linhas de células estáveis foi muito baixa e de expressão de proteínas de fusão com GFP outros introduzido transientemente em estas células podem ser facilmente detectados acima do fundo de fluorescência verde.
Uma representação esquemática das experiências efectuadas em clones de células para medirse que o efeito do knockdown SNF2h Acf1 ou E4orf4 em morte celular induzida é mostrada na fig. 4. O tempo necessário para knockdown da expressão do gene por meio de tratamento de doxiciclina pode variar de acordo com a estabilidade da proteína, cujo nível deve ser reduzido. Para Acf1 e SNF2h, um tratamento de 72 horas foi necessária para knockdown eficiente ao nível da proteína.
A Figura 5 mostra um exemplo de células que expressam E4orf4 e GFP e submetidos a morte de células manifesta pelo aparecimento de DAPI manchado de núcleos com uma morfologia condensado ou fragmentado. Figura 6 mostra os resultados de uma experiência representativa que demonstra que a doxiciclina induzida knockdown Acf1 levou a um aumento da E4orf4 estimulada a morte celular (Figura 6A). Este aumento não resultou de um aumento da E4orf4 níveis (Figura 6B). Além disso, a restauração da Acf1 para as células induzidas a doxiciclina diminuiu o aumento da E4orf4 toxicidade aos níveis observado em células não induzidas (Fig. 6).
Figura 1. Mapa do plasmídeo + pSuperior.neo GFP. O mapa mostra o promotor induzível por tetraciclina H1 condução shRNA expressão e a expressão do promotor PGK de condução de uma proteína de fusão GFP-neo. O mapa foi adaptado a partir do manual pSuperior OligoEngine.
Figura 2. Identificação de colónias resistentes à neomicina. Imagens de uma placa contendo colónias (A) e de uma única colónia (B) são mostrados. As colónias foram obtidas por cultura das células durante 14 dias num meio selectivo contendo neomicina.
Figura 3. Exame da eficiência knockdown em colónias seleccionadas. Células de várias colónias seleccionadas na presença de neomicina foram plaqueadas em poços em duplicado. Um poço de cada uma das amostras foi induzida pela doxiciclina (+) e um poço foi deixada sem tratamento (-). As proteínas foram extraídas de 72 horas pós-indução e submetido a cromatografia em SDS-PAGE. O Western blot foi corado com anticorpos para sucessivamente SNF2h e à alfa-tubulina (que serve como um controlo de carga), e mostra os níveis de SNF2h em células induzidas e de controlo.
Figura 4. Planear uma experiência de ensaio típico knockdown-DAPI. Etapas sucessivas da experiência são apresentados, incluindo o tratamento de doxiciclina para alcançar Acf1 ou knockdown SNF2h, a transfecção para restaurar ou Acf1 SNF2h expressão ou a introdução de uma empty vector e a introdução de E4orf4, ou o seu correspondente vector vazio para dentro das células, e análise dos resultados. Doxiciclina tratados com placas são mostrados em vermelho (Dox) e placas de controlo são marcados em azul. Clique aqui para ver maior figura .
Figura 5. Detecção de E4orf4 a morte celular induzida pelo ensaio de DAPI. Células que sofreram diferentes tratamentos descritos na Figura 4 foram fixadas e coradas com anticorpos específicos para E4orf4 e DAPI para visualizar os núcleos de células transfectadas. Esta fotografia foi tirada específico a partir de uma amostra contendo E4orf4 e a proteína GFP controlo. (A) da GFP. (B) E4orf4. (C) DAPI. (D) imagens fundidas. As setas brancas marca GFP-E4orf4 e células transfectadas contendo núcleos com morfologias apoptóticas. As setas vermelhasmarcar núcleos com formas irregulares, que não são contadas como núcleos apoptóticos. Asteriscos núcleos mitótica marca ou núcleos que acabou dividido.
Figura 6. Acf1 knockdown E4orf4 aumenta a morte celular induzida. (A) As células da linha de células T-REx-293-derived expressando Acf1-shRNA partir de um promotor induzível por tetraciclina foram induzidos com doxiciclina (Dox +) ou deixada sem tratamento (-Dox). Três dias mais tarde, as células foram transfectadas com plasmídeos expressando E4orf4 (+ E4orf4) ou um vector vazio (-E4orf4), juntamente com um vector vazio ou uma Acf1 plasmídeo expressando GFP-tagged, que foi tornado resistente ao shRNA pela introdução do silencioso mutações. As células foram fixadas 24 horas após a transfecção e coradas com anticorpos para E4orf4 e com DAPI. A indução da morte celular foi medida através do ensaio descrito acima e DAPI a percentagem of células transfectadas com núcleos condensados ou fragmentados foi determinado. Uma experiência representativa com três repetições é mostrado, e as barras de erro representam o desvio padrão. (B) As células de placas paralelas foram colhidas para análise de Western blot. A membrana foi corada com anticorpos anti-E4orf4, GFP, e Acf1. O Acf1 endógeno e Acf1-GFP estão apresentados em dois painéis separados.
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Discussion
Knockdown da expressão do gene específico é uma abordagem importante para a investigação da contribuição de uma proteína de vias reguladoras. Desde knockdown constitutivo de expressão de genes essenciais afeta negativamente a proliferação de células, o estudo pode exigir a introdução ou transitória de siRNAs ou aplicação de sistemas estáveis knockdown condicionais. A geração de linhagens de células estáveis com a capacidade para a expressão induzida por fármacos de shRNAs aqui descritas, proporciona uma vantagem sobre as transfecções transientes que podem não ser eficiente em linhas celulares de muitas, e sobre a utilização de vírus que requerem preparação repetida e, por vezes, um adicional de curta no curto prazo. As linhas de células, uma vez gerado, não exigem a preparação adicional. Além disso, nas nossas mãos, transfecções transientes de construções shRNA foram muito menos eficiente em derrubar a expressão do gene em comparação com a indução da expressão de shRNA nas linhas de células seleccionadas. É recomendáveled, no entanto, verificar que, em cada experiência o knockdown induzida pela droga permaneceu eficiente. Uma potencial desvantagem da utilização de linhas de células estáveis para knockdown condicional da expressão do gene é a de que eles podem ter adquirido alterações adicionais durante o processo de selecção, que poderia, potencialmente, afectar o resultado de experiências. No entanto, para superar este problema, pode-se realizar a experiência de duas linhas de células paralelas ou inverter o efeito do knockdown pela introdução de um plasmídeo que expressa uma proteína resistente shRNA-WT. Se a proteína WT elimina o efeito da shRNA, então um efeito clonal pode ser descartada.
Clássico, apoptose dependente de caspase, pode ser testada por vários métodos, incluindo a detecção de caspase activação, anexina-V de coloração, coloração do túnel, a detecção de uma população de células sub-G1 por FACS, etc 10. No entanto, E4orf4 induz uma não clássica, a morte celular independente de caspase em muitas linhas celulares e métodos de váriaspara detecção de apoptose, não são aplicáveis para a detecção deste modo único de morte celular 6,7,11,12. Foi previamente demonstrado que as morfologias mais típicos associados com E4orf4 morte celular induzida por incluir blebbing membrana, condensação nuclear ou a fragmentação e desprendimento de células 13. Por isso, normalmente medem E4orf4 morte celular induzida pelo teste de condensação nuclear e fragmentação, ou perda de células.
Quando utilizando o ensaio DAPI, deve-se prestar especial atenção aos seguintes pontos: 1) Para manter a objetividade ideal do teste, é altamente recomendável que o ensaio será realizado em uma "forma cega", de modo que a pessoa que conta o número de células contendo núcleos apoptóticos com morfologias não estará ciente da identidade de amostra. 2) Recomenda-se manter a critérios rigorosos para identificar morfologias nucleares apoptóticas que não deve ser confundido com núcleos mitótica ou núcleos com unevmorfologias PT (ver Figura 5). Os ensaios de morte celular adicionais podem também ser utilizadas como uma leitura de uma experiência, tal como ensaios de células clonogénicas sobrevivência 8.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado (em parte) pela ciência ISRAEL FUNDAÇÃO (Grant 399/11), pelo Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) no âmbito do Projeto de Cooperação O alemão-israelense (DIP), e pelo Instituto da Família Rappaport de Investigação em de Ciências Médicas.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High glucose DMEM | Gibco | 41965 | |
| Tet system approved FBS | Clontech | 631106 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200 | |
| T-REx-293 cells | Invitrogen | R710-07 | |
| G418 | Sigma | A1720 | |
| blasticidin | Invitrogen | R210-01 | |
| pSuperior.neo+GFP plasmid | OligoEngine | VEC-PBS-0007/0008 | |
| jetPIE | Polyplus transfection | 101-40 | |
| doxycycline | Sigma | D9891 | |
| paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma | D9542 | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 |
References
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