Summary
Contributo del fattore ACF rimodellamento della cromatina per E4orf4 morte cellulare indotta è stata misurata. Il protocollo include la selezione di cloni di cellule in cui il trattamento doxiciclina induce knockdown condizionale della subunità ACF ACF1 e SNF2h, e l'uso del test per misurare DAPI E4orf4 morte cellulare indotta in linee cellulari inducibili.
Abstract
Inattivazione funzionale di espressione genica in cellule di mammiferi è fondamentale per lo studio del contributo di una proteina di interesse per varie vie 1,2. Tuttavia, knockdown condizionale dell'espressione genica è necessaria nei casi in cui knockdown costitutiva non è tollerata dalle cellule per un lungo periodo di tempo 3-5. Qui si descrive un protocollo per la preparazione di linee cellulari che permettono knockdown condizionale della subunità del fattore ACF rimodellamento della cromatina. Queste linee cellulari facilitare la determinazione del contributo di ACF ad induzione di morte cellulare per la proteina adenovirus E4orf4 6. Sequenze codificanti short hairpin RNA per le subunità ACF1 SNF2h e del fattore di ACF rimodellamento della cromatina sono stati clonati accanto a un doxiciclina promotore inducibile in un plasmide contenente un gene anche per il gene di resistenza alla neomicina. Neomicina resistenti cloni sono stati selezionati in presenza di G418 e isolata. Le linee cellulari risultanti sono state indottetrattamento doxiciclina, e una volta ACF1 o livelli di espressione SNF2h stati ridotti, le cellule sono state transfettate con un plasmide codificante E4orf4 o un vettore vuoto. Per confermare l'effetto specifico dei costrutti shRNA, i livelli di proteina ACF1 o SNF2h sono stati ripristinati ai livelli WT da coinfezione con un plasmide che esprime ACF1 o SNF2h cui erano stati resi resistenti al shRNA con l'introduzione di mutazioni silenti. La capacità di E4orf4 di indurre la morte cellulare nei vari campioni è stata determinata mediante un saggio DAPI, in cui è stata misurata la frequenza della comparsa di nuclei con morfologie apoptotici nella popolazione di cellule transfettate 7-9.
Il protocollo qui descritto può essere utilizzato per la determinazione del contributo funzionale di varie proteine di induzione della morte cellulare dai loro partner proteici nei casi in cui knockdown costitutiva può essere letale cellula.
Protocol
1. Generazione di linee cellulari inducibili
- Prima dell'esperimento si ha la necessità di trovare la concentrazione minima del G418 farmaco che uccide le cellule utilizzate per la preparazione delle linee cellulari desiderati. A questo scopo, le cellule piastra di scelta in più piastre duplicati a 70% di confluenza in mezzo che verrà utilizzato durante l'esperimento e aggiungere concentrazioni crescenti di G418 (0-1000 mg per ml). Monitorare le cellule giornalieri per determinare la concentrazione minima G418 che uccide le cellule in modo efficiente. La morte cellulare si osserva entro 3-7 giorni.
- Prima generazione di linee cellulari, si raccomanda di verificare mediante saggi di trasfezione transiente del plasmide che esprime la shRNA può ridurre in qualche misura l'espressione del gene in esame. Questo può essere fatto in qualsiasi linea cellulare che può essere efficacemente trasfettate.
- Piastra T-REX-293 cellule ad una densità di circa 5x10 6 cellule per piastra di 10 cm in 8 ml di terreno DMEM (contenente il 10% Tet sygambo FBS omologato, 2 mM L-glutammina, 100 unità per ml di penicillina e 0,1 mg per ml streptomicina, 5 pg per ml blasticidina). Incubare le piastre per una notte a 37 ° C, 5% di CO 2.
- Il giorno seguente, cambiare il supporto a 8 ml di mezzo fresco prima della trasfezione.
- Trasfettare le cellule con 10 pg di plasmide pSuperior.neo GFP + (Figura 1) o codifica ACF1 SNF2h shRNA guidata da un promotore inducibile da tetraciclina H1, nonché il gene di resistenza a neomicina fusa alla GFP e guidata da un promotore PGK costitutivo. Aggiungere il DNA a 500 pl di 150 mM NaCl. Aggiungere il reagente jetPIE ad un'altra aliquota di 500 microlitri di NaCl 150 mM a 2 ml per DNA pg. Aggiungere la soluzione jetPIE al DNA e mescolare bene nel vortex. Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. Pipettare delicatamente complessi DNA sui 10 piatti cm contenente il 70-80% delle cellule confluenti. Riportare le piastre per l'incubatore.
- Il giorno successivo sostituire il mezzo con un terreno selettivo (DMEM comedescritto sopra contenente un ulteriore 500 pg per ml G418).
- Per le due settimane successive monitorare le cellule e sostituire il terreno selettivo un fluido simile fresco ogni 3-4 giorni fino colonie appaiono e possono essere visualizzati senza un microscopio.
- Prima di isolamento di colonie, preparare piastre da 24 pozzetti con terreno selettivo.
- Identificare colonie a occhio, e contrassegnare la loro posizione sul fondo della piastra con un pennarello colorato. Verificare che sotto il microscopio che le colonie sono ben separati.
- Nella cappa sterile, aspirare il terreno dalla piastra, risciacquare delicatamente con caldo PBS e aspirare bene tutto il liquido rimanente. Aggiungere 3 ml di 0,25% tripsina / EDTA ad una colonia sulla piastra. Pipettare la tripsina finché le cellule staccare e aggiungerli uno dei pozzi in 24 pozzetti. Ripetere questa operazione per diverse altre colonie sulla piastra.
- Crescere le cellule a 37 ° C, 5% di CO 2 fino a riempire il pozzo. Poi dividere le cellule derivate daciascuna delle colonie originali in tre pozzi, ognuno in un separato di 12 pozzetti e incubare una notte.
- Il giorno seguente, sostituire il mezzo in una piastra con terreno contenente 1 pg per ml di doxiciclina da una soluzione madre preparata in acqua bidistillata (1-5 mg per ml). Sostituire il mezzo in una piastra di controllo con il mezzo senza doxiciclina. Incubare le cellule per 72 ore a 37 ° C, 5% di CO 2.
- Cellule raccolta da uno trattato ed uno non trattato bene di ogni clone cellulare per la preparazione di estratti proteici e analisi Western blot per determinare l'efficienza di ACF1 o knockdown SNF2h. Utilizzare anticorpi ACF1 o SNF2h nonché anticorpi alfa-tubulina, che serve come controllo di caricamento. Utilizzare le cellule nel terzo pozzo, non trattata, per l'espansione di cloni di cellule selezionato in cui oltre doxiciclina portato ad almeno il 50% di riduzione del livello della proteina in esame. Congelare aliquote di queste cellule in 90% FBS, 10% DMSO per ulteriore uso.
- Cellule piastra nel terreno selettivo in 10 piatti cm. Aggiungere doxiciclina a 1 pg per ml di mezzo le piastre e incubare a 37 ° C, 5% di CO 2 per 48-72 h (vedere Figura 4).
- Dopo 48-72 ore, Tripsinizzare le celle da ciascun gruppo di cellule, contarli, e piatto 1.5x10 6 cellule per 6 Piastra cm nel terreno stesso, con o senza doxiciclina. Incubare le cellule a 37 ° C, 5% di CO 2 durante la notte. Piano in modo che ciascun gruppo di piastre di sezione 2,1 fornirà le cellule per dodici piastre 6 cm, di cui due duplicati per il saggio DAPI per ogni punto, nonché una piastra per analisi Western blot di ciascun campione (vedi figura 4).
- Il giorno seguente trasfettare le cellule in piastre da 6 centimetri con le seguenti combinazioni di plasmidi: 1 ug di un plasmide vuoto o una quantità identica di plasmide codificante E4orf4, insieme con 4 mg di un vettoreesprimendo ACF1-GFP o GFP-SNF2h reso resistente alla shRNA nei cloni cellulari mediante introduzione di mutazioni silenti, o 3 mg del vettore corrispondente vuota e 1 mg plasmide esprimente GFP (Figura 4). Utilizzare il reagente jetPIE come descritto sopra (10 microlitri per 5 pg di DNA) per preparare la miscela di trasfezione. Per ogni campione, preparare una miscela di trasfezione per tre piatti.
- A seguito di una incubazione di 15 min DNA con il reagente jetPIE a temperatura ambiente, lentamente pipettare quantità uguali di complessi DNA da ogni miscela di trasfezione su tre piastre 6 centimetri e incubare a 37 ° C, 5% di CO 2 durante la notte.
3. Assay DAPI in cellule trasfettate
- Il giorno successivo, estrarre proteine da un piatto per campione per analisi Western blot per determinare che ACF1 o SNF2h sono stati efficacemente abbattuto e che E4orf4 stata espressa ugualmente nei diversi campioni.
- Aspirare il terreno dalle piastre destinate alla DAPIdosaggio, lavare i piatti delicatamente con PBS e aggiungere 1 ml di paraformaldeide al 4% preparato in PBS per coprire le cellule. Preparazione della soluzione di paraformaldeide e trattamento delle cellule con la sostanza chimica deve essere effettuata in una cappa chimica. Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente senza agitazione.
- Aspirare il paraformaldeide e lavare tre volte con PBS, dondolo a temperatura ambiente per 5 minuti ogni volta. Aggiungere 80% etanolo tenuta a -20 ° C ed incubare a -20 ° C per almeno 1 ora. Le piastre possono essere tenuti sotto etanolo a -20 ° C per diversi giorni finché sono ben sigillati per impedire l'evaporazione dell'etanolo e asciugatura.
- Aspirare l'etanolo e lavare le cellule due volte con PBS ed una volta con PBS-BT (PBS contenente 0,5% di BSA e 0,05% Tween-20), dondolo a temperatura ambiente per 5 minuti ogni volta.
- Per prevenire il legame non specifico degli anticorpi, bloccare le cellule in 1 ml di PBS-BT tampone contenente siero di capra 10% per 20 min mentre a dondolo a temperatura ambiente. Quindi lavare tegli le cellule due volte in PBS-BT, 5 minuti ogni lavaggio.
- Incubare le cellule con l'anticorpo primario (E4orf4 un anticorpo specifico nel nostro caso) in 1 ml di PBS-BT per 1 ora mentre a dondolo a temperatura ambiente. Poi lavare due volte in PBS-BT e una volta in PBS contenente 0,1% BSA, 5 min ogni lavaggio.
- Incubare le cellule in 1 ml di PBS-BSA 0,1% contenente l'appropriato anticorpo secondario marcato con fluorescenza e 0,5 pg per ml concentrazione finale di DAPI per 40 min mentre a dondolo a temperatura ambiente al buio. Poi lavare con PBS per 5 minuti, asciugare bene per aspirazione e mantenere le piastre capovolte per un'ora aggiuntiva a notte per ottenere la completa essiccazione. Quindi montare vetrini di copertura sulle cellule, utilizzando Fluoromount-G soluzione. Conservare le piastre a 4 ° C al buio fino al momento di contare i nuclei apoptotici.
- Fai un collega per identificare le varie piastre di nuovi numeri, in modo da contare nuclei apoptotici nei diversi campioni può essere fatto in modo imparziale.
- Visualizza le cellule nel quadro di un upright microscopio a fluorescenza ad un ingrandimento di 400x (in aria) o 630x (immersione in olio). Identificare cellule trasfettate che sono colorate per le varie proteine espresse in ciascun campione, e contare il numero di nuclei condensati o frammentati visualizzati tramite colorazione DAPI all'interno della popolazione di cellule transfettate. Monitorare diversi campi e contare un totale di almeno 200 cellule trasfettate.
- Calcolare la percentuale di nuclei con morfologia apoptotica all'interno della popolazione di cellule transfettate. Ripetere l'esperimento, con duplicati, 2-3 volte per calcolare la significatività statistica delle variazioni tra i vari campioni.
4. Risultati rappresentativi
L'efficienza di colonie ottenendo in cui knockdown condizionale dell'espressione genica ha avuto successo è variabile, a seconda del gene coinvolto. Nelle nostre mani, abbiamo ottenuto sette colonie di successo su 12 testati per ACF1 e 6 su 18 per SNF2h. Figura 2 shows un piatto rappresentativo di cloni di cellule selezionate (Figura 2A), così come una singola colonia (Figura 2B). Figura 3 mostra un blot rappresentativo preparato con proteine estratte da cellule di vari cloni coltivati in presenza o assenza di doxiciclina per 72 ore. Il blot è stato colorato con anticorpi SNF2h e-tubulina, che serve come controllo di caricamento. Due dei cloni (numero 4 e 5) ha mostrato una forte riduzione dei livelli SNF2h dopo induzione doxiciclina. Occorre notare che, sebbene la pSuperior.neo + plasmide GFP (Figura 1) utilizzato per la generazione di linee cellulari neo-codifica una proteina di fusione GFP, la fluorescenza verde nelle linee cellulari stabili era molto bassa e l'espressione di altre proteine di fusione GFP introdotto transitoriamente in queste cellule potrebbe essere facilmente individuata sopra la fluorescenza verde sfondo.
Una rappresentazione schematica degli esperimenti effettuati nei cloni cellulari per misurareche l'effetto di ACF1 o knockdown SNF2h E4orf4 sulla morte cellulare indotta è mostrato in fig. 4. Il tempo richiesto per knockdown dell'espressione genica mediante trattamento doxiciclina può variare a seconda della stabilità della proteina i cui livelli devono essere ridotti. Per ACF1 e SNF2h, un trattamento di 72 ore è richiesto per knockdown efficiente a livello proteico.
La figura 5 mostra un esempio di cellule esprimenti GFP e E4orf4 e subendo morte cellulare manifesta con la comparsa di DAPI-tinto nuclei con una morfologia condensato o frammentato. Figura 6 mostra i risultati di un esperimento rappresentativo che dimostra che doxiciclina indotta ACF1 knockdown portato ad un aumento E4orf4-stimolata morte cellulare (Figura 6A). Questo aumento non è stato determinato da un aumento dei livelli E4orf4 (Figura 6B). Inoltre, il ripristino delle ACF1 alle doxiciclina indotte cellule diminuito l'aumento della tossicità E4orf4 ai livelli osservata in cellule uninduced (Figura 6).
Figura 1. Mappa del + pSuperior.neo plasmide GFP. La mappa mostra la tetraciclina-inducibile promotore H1 guida shRNA espressione e l'espressione promotore PGK di guida di un neo-proteina di fusione GFP. La mappa è stato adattato dal manuale OligoEngine pSuperior.
Figura 2. Immagini di identificazione di colonie resistenti alla neomicina. Di una piastra contenente colonie (A) e di una singola colonia (B) sono mostrati. Le colonie sono stati ottenuti coltivando le cellule per 14 giorni in un mezzo selettivo contenente neomicina.
Figura 3. Cellule esame di efficienza knockdown in colonie selezionate. Di numerose colonie selezionati in presenza di neomicina sono state piastrate in pozzetti in duplicato. Un pozzetto di ciascun campione è stata indotta da doxiciclina (+) ed un pozzetto stata lasciata non trattata (-). Le proteine sono state estratte 72 ore post-induzione e cromatografato su SDS-PAGE. Il Western blot è stata colorata successivamente con anticorpi SNF2h e di alfa-tubulina (che funge da controllo del carico) e mostra i livelli di SNF2h nelle cellule indotte e di controllo.
Figura 4. Progettando un tipico esperimento knockdown-DAPI dosaggio. Successive fasi dell'esperimento sono mostrati, compreso il trattamento doxiciclina raggiungere ACF1 o knockdown SNF2h, una trasfezione per ripristinare ACF1 o SNF2h espressione o di introdurre una empty vettore e di introdurre E4orf4 o suo corrispondente vettore vuoto nelle cellule, e analisi dei risultati. Doxycycline trattati con piastre vengono visualizzati in rosso (Dox) e le piastre di controllo sono contrassegnati in blu. Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 5. Celle di rivelazione di E4orf4 morte cellulare indotta dal test DAPI. Sottoposti alle vari trattamenti descritti nella figura 4 sono state fissate e colorate con anticorpi specifici E4orf4 e DAPI per visualizzare i nuclei delle cellule trasfettate. Questa foto è stata scattata specifico da un campione contenente E4orf4 e la proteina GFP controllo. (A) GFP. (B) E4orf4. (C) DAPI. (D) le immagini unite. Le frecce bianche mark-GFP e E4orf4-trasfettate cellule contenenti nuclei con morfologie apoptotici. Le frecce rossemarcare i nuclei con forme irregolari che non sono contati come nuclei apoptotici. Asterischi marchio nuclei mitotico o nuclei che si sono appena divisi.
Figura 6. ACF1 knockdown migliora E4orf4 morte cellulare indotta. (A) Le cellule del T-rex-293 derivato da linea cellulare che esprime ACF1-shRNA da un promotore inducibile tetraciclina sono state indotte con doxiciclina (Dox +) o non trattata (-Dox). Tre giorni dopo, le cellule sono state trasfettate con plasmidi esprimenti E4orf4 (+ E4orf4) o un vettore vuoto (-E4orf4) insieme con un vettore vuoto o un plasmide che esprime GFP-tagged ACF1, che è stato reso resistente alla shRNA dall'introduzione di silenzio mutazioni. Le cellule sono state fissate 24 ore dopo la trasfezione e colorate con anticorpi per E4orf4 e con DAPI. Induzione della morte cellulare è stata misurata con il test sopra descritto DAPI e la percentuale of cellule trasfettate con nuclei condensati o frammentati è stata determinata. Un esperimento rappresentativo di tre repliche è indicata, e le barre di errore rappresentano la deviazione standard. (B) Le cellule di piastre parallele sono state raccolte per l'analisi Western blot. Il blot è stato macchiato con anticorpi E4orf4, GFP, e ACF1. Il endogena ACF1 e ACF1-GFP sono presenti in due pannelli separati.
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Discussion
Knockdown di espressione del gene specifico è un approccio importante per l'indagine del contributo di una proteina a percorsi normativi. Dal momento che knockdown costitutiva di espressione dei geni essenziali influisce negativamente la proliferazione delle cellule, il loro studio hanno bisogno di un introduzione transitoria di siRNA o applicazione di stabili sistemi smontabili condizionali. Generazione di linee cellulari stabili con la capacità di farmaco-indotta espressione di shRNAs qui descritte, fornisce un vantaggio rispetto trasfezioni transienti che possono non essere efficace in molte linee cellulari, e oltre l'uso di virus che richiedono una preparazione ripetuta e talvolta un ulteriore breve Selezione termine. Le linee cellulari, una volta generati, non richiedono ulteriore preparazione. Inoltre, nelle nostre mani, trasfezioni transitorie di costrutti shRNA erano molto efficiente nelle abbattere genica rispetto induzione dell'espressione shRNA nelle linee cellulari selezionate. Si consigliaed invece di verificare, per ogni esperimento che il farmaco-indotta knockdown è rimasto efficiente. Un potenziale svantaggio dell'uso di linee cellulari stabili per knockdown condizionale dell'espressione genica è che essi possono aver acquisito ulteriori modifiche durante il processo di selezione che potrebbero influenzare l'esito di esperimenti. Tuttavia, per superare questo problema, si può effettuare l'esperimento in due linee cellulari parallele o invertire l'effetto knockdown mediante introduzione di un plasmide che esprime un shRNA resistente proteina WT. Se la proteina WT elimina l'effetto del shRNA, quindi un effetto clonale può essere escluso.
Classica, caspasi-dipendente apoptosi, possono essere analizzati con metodi diversi, inclusa l'identificazione di attivazione delle caspasi, annessina-V colorazione, colorazione Tunnel, l'individuazione di un sub-G1 popolazione cellulare mediante FACS, ecc 10. Tuttavia, induce una E4orf4 non classica, caspasi-indipendente morte cellulare in linee cellulari e molti metodi diversiper il rilevamento di apoptosi non sono applicabili per il rilevamento di questo modo unico di morte cellulare 6,7,11,12. È stato precedentemente dimostrato che le morfologie più tipici associati E4orf4 morte cellulare indotta includono blebbing membrana, condensazione nucleare o frammentazione, e distacco cella 13. Quindi di solito misuriamo E4orf4 morte cellulare indotta dal dosaggio condensazione nucleare e la frammentazione, o la perdita di cellule.
Quando si utilizza l'analisi DAPI, si dovrebbe prestare particolare attenzione ai seguenti punti: 1) Per mantenere l'obiettività ottimale del test, è altamente raccomandato che il test verrà eseguito in una "moda cieca", in modo che la persona che conta il numero di cellule contenenti nuclei con morfologie apoptotiche non sarà a conoscenza dell'identità campione. 2) Si consiglia di mantenere i criteri rigorosi per individuare nucleari morfologie apoptotici, che non devono essere confusi con nuclei mitotico o nuclei con unevmorfologie en (vedi figura 5). Ulteriori saggi morte cellulare può anche essere impiegato come read-out dell'esperimento, come saggi su cellule sopravvivenza clonogeniche 8.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato finanziato (in parte) con la Israel Science Foundation (Grant 399/11), dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), nel quadro della convenzione tedesco-israeliano di cooperazione Progetto (DIP), e dall'Istituto famiglia Rappaport per la Ricerca in le scienze mediche.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High glucose DMEM | Gibco | 41965 | |
| Tet system approved FBS | Clontech | 631106 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200 | |
| T-REx-293 cells | Invitrogen | R710-07 | |
| G418 | Sigma | A1720 | |
| blasticidin | Invitrogen | R210-01 | |
| pSuperior.neo+GFP plasmid | OligoEngine | VEC-PBS-0007/0008 | |
| jetPIE | Polyplus transfection | 101-40 | |
| doxycycline | Sigma | D9891 | |
| paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma | D9542 | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 |
References
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