Summary
Contribution du facteur de remodelage de la chromatine ACF à la mort cellulaire induite par E4orf4 a été mesurée. Le protocole comprend la sélection de clones cellulaires dans lesquelles le traitement doxycycline induit knockdown conditionnelle de sous-unités ACF du Acf1 et SNF2h, et l'utilisation du test DAPI pour mesurer la mort cellulaire induite par E4orf4 dans les lignées cellulaires inductibles.
Abstract
Inactivation fonctionnelle de l'expression des gènes dans les cellules de mammifères est essentielle pour l'étude de la contribution d'une protéine d'intérêt à 1,2 voies différentes. Toutefois, démontable conditionnelle de l'expression du gène est nécessaire dans les cas où knockdown constitutif n'est pas tolérée par les cellules pour une longue période de temps 3-5. Nous décrivons ici un protocole de préparation de lignées cellulaires permettant knockdown conditionnelle de sous-unités du facteur de remodelage de la chromatine ACF. Ces lignées de cellules de faciliter la détermination de la contribution de ACF à induction de la mort cellulaire par la protéine E4orf4 d'adénovirus 6. Des séquences codant pour les ARN en épingle à cheveux courts pour les sous-unités et Acf1 SNF2h du facteur ACF remodelage de la chromatine ont été clonés à côté d'un promoteur inductible par la doxycycline dans un plasmide contenant un gène également pour le gène de résistance à la néomycine. Clones de cellules résistantes à la néomycine ont été sélectionnées en présence de G418 et isolées. Les lignées de cellules résultants ont été induite partraitement par la doxycycline, et une fois Acf1 ou les niveaux d'expression SNF2h ont été réduits, les cellules ont été transfectées avec un plasmide codant pour E4orf4 ou un vecteur vide. Pour confirmer l'effet spécifique des constructions shRNA, la teneur en protéines Acf1 ou SNF2h ont été restaurés à des niveaux WT par co-transfection avec un plasmide exprimant Acf1 ou SNF2h qui ont été rendues résistantes à l'shRNA par l'introduction de mutations silencieuses. La capacité de E4orf4 pour induire la mort des cellules dans les différents échantillons a été déterminée par un dosage DAPI, dans lequel la fréquence d'apparition des noyaux avec des morphologies apoptotiques dans la population de cellules transfectées a été mesurée 7-9.
Le protocole décrit ici peut être utilisé pour la détermination de la contribution fonctionnelle des différentes protéines à l'induction de la mort cellulaire par leurs partenaires protéiques dans les cas où knockdown constitutif peut être mortelle cellule.
Protocol
1. Génération de lignées cellulaires inductibles
- Avant l'expérience on a besoin pour trouver la concentration minimale du médicament G418 qui tue toutes les cellules utilisées pour la préparation des lignées cellulaires souhaités. A cet effet, la plaque les cellules de choix dans plusieurs plaques en double à 70% de confluence dans le milieu qui sera utilisé lors de l'expérience et d'ajouter des concentrations croissantes de G418 (0-1,000 ug par ml). Surveiller les cellules quotidiens afin de déterminer la concentration minimale G418 qui tue les cellules de façon efficace. La mort cellulaire est observée dans les 3-7 jours.
- Avant de génération de lignées cellulaires, il est recommandé de vérifier par des essais de transfection transitoire que le plasmide exprimant le shRNA peut réduire dans une certaine mesure l'expression du gène à l'étude. Cela peut être fait dans n'importe quelle lignée de cellules qui peuvent être efficacement transfectées.
- Plate T-Rex-293 cellules à une densité d'environ 5x10 6 cellules par plaque de 10 cm dans 8 ml de milieu DMEM (contenant 10% de Tet sytige FBS approuvé, 2 mM de L-glutamine, 100 unités par ml de pénicilline et de la streptomycine 0,1 mg par ml, 5 mg par ml blasticidine). Incuber les plaques pendant une nuit à 37 ° C, 5% de CO 2.
- Le lendemain, changer le milieu à 8 ml de milieu frais avant la transfection.
- Transfecter les cellules en utilisant 10 mg de plasmide GFP + pSuperior.neo Acf1 (figure 1) de codage ou SNF2h shRNA dirigée par un promoteur inductible par la tétracycline H1, ainsi que le gène de résistance à la néomycine fusionnée à la GFP et entraîné par un promoteur constitutif PGK. Ajouter l'ADN à 500 ul de 150 mM de NaCl. Ajouter le réactif jetPIE à une autre partie aliquote de 500 pl de 150 mM de NaCl à 2 l par ug d'ADN. Ajouter la solution jetPIE à l'ADN et bien mélanger au vortex. Incuber pendant 15 min à température ambiante. Pipeter doucement complexes ADN sur les plaques de 10 cm contenant 70-80% des cellules confluentes. Remettre les plaques dans l'incubateur.
- Le lendemain, remplacer le milieu avec un milieu sélectif (milieu DMEM quedécrit ci-dessus contenant un supplément de 500 ug par ml de G418).
- Pour les deux prochaines semaines surveiller les cellules et remplacer le milieu sélectif d'une matière similaire frais tous les 3-4 jours jusqu'à ce que les colonies apparaissent et peuvent être visualisées sans microscope.
- Avant d'isolement de colonies, de préparer des plaques 24 puits avec un milieu sélectif.
- Identifier les colonies de l'oeil, et marquer leur emplacement dans le bas de la plaque à l'aide d'un marqueur de couleur. Vérifiez sous le microscope que les colonies sont bien séparés.
- Dans la hotte stérile, aspirer le support de la plaque, les rincer doucement avec du PBS chaud et aspirer ainsi tout le liquide restant. Ajouter 3 pi de 0,25% de trypsine / EDTA à une colonie sur la plaque. Pipeter la trypsine à plusieurs reprises jusqu'à ce que les cellules se détacher et de les ajouter à l'un des puits de la plaque 24-puits. Répétez cette opération pour plusieurs autres colonies sur la plaque.
- Cultiver les cellules à 37 ° C, 5% CO 2 jusqu'à remplir le puits. Puis diviser les cellules dérivées dechacune des colonies d'origine dans trois puits, chacun dans un document distinct plaque de 12 puits et incuber pendant la nuit.
- Le jour suivant, remplacez le support dans une plaque avec un milieu contenant 1 ug par ml de doxycycline à partir d'une solution mère préparée dans de l'eau bidistillée (1-5 mg par ml). Remplacer le milieu dans une plaque de commande avec un milieu sans doxycycline. Incuber les cellules pendant 72 heures à 37 ° C, 5% de CO 2.
- Récolte des cellules de l'une traitée et l'autre non traité et de chaque clone de cellules pour la préparation des extraits protéiques et l'analyse Western blot pour déterminer l'efficacité de Acf1 ou knockdown SNF2h. Utiliser des anticorps à Acf1 ou SNF2h ainsi que des anticorps contre l'alpha-tubuline, servant de témoin de charge. Utiliser les cellules dans le troisième puits, elle n'est pas traitée, pour l'expansion de clones de cellules sélectionnées dans laquelle la doxycycline outre conduit à au moins 50% de réduction dans le niveau de la protéine étudiée. Congeler des aliquotes de ces cellules dans 90% de FBS, 10% de DMSO pour une utilisation ultérieure.
- Cellules de la plaque dans le milieu sélectif dans des plaques de 10 cm. Ajouter la doxycycline à 1 ug par ml de la moitié des plaques et incuber à 37 ° C, 5% CO 2 pendant 48-72 heures (voir Figure 4).
- Après 48-72 heures, trypsiniser les cellules de chaque groupe de cellules, les compter, et plaque 1.5x10 6 cellules par plaque de 6 cm dans le même milieu, avec ou sans doxycycline. Incuber les cellules à 37 ° C, 5% CO 2 pendant la nuit. Plan de telle sorte que chaque groupe de plaques de la section 2.1 fournit les cellules pendant douze plaques 6 cm, dont deux doubles pour le dosage DAPI pour chaque point ainsi que d'une plaque pour analyse par Western blot de chaque échantillon (voir figure 4).
- Le jour suivant la transfection des cellules dans des plaques 6 cm avec les combinaisons suivantes de plasmides: 1 pg d'un plasmide vide ou une quantité identique de l'plasmide codant pour E4orf4, avec 4 pg d'un vecteurexprimant la GFP ou Acf1-SNF2h-GFP rendues résistantes à la shRNA dans les clones cellulaires par introduction de mutations silencieuses, ou 3 pg du vecteur correspondant vide et 1 ug plasmide exprimant la GFP (figure 4). Utilisez le réactif jetPIE comme décrit plus haut (10 pi par 5 pg d'ADN) pour préparer le mélange de transfection. Pour chaque échantillon, préparer un mélange de transfection pour trois plaques.
- Après une incubation de 15 min de l'ADN avec le réactif jetPIE à la température ambiante, doucement pipeter des quantités égales de complexes d'ADN de chaque mélange de transfection sur trois plaques 6 cm et incuber à 37 ° C, 5% CO 2 pendant la nuit.
3. Essai DAPI dans les cellules transfectées
- Le lendemain, extraire des protéines d'une plaque par échantillon pour analyse par Western blot pour déterminer que Acf1 ou SNF2h ont été efficacement renversé et que E4orf4 a été exprimée également dans les différents échantillons.
- Aspirer le fluide à partir des plaques destinées à la DAPItest, lavez délicatement les plaques avec du PBS et ajouter 1 ml de paraformaldéhyde 4% préparée dans du PBS pour couvrir les cellules. Préparation de la solution de paraformaldéhyde et le traitement des cellules avec ce produit chimique doit être effectuée sous une hotte chimique. Incuber pendant 15 min à température ambiante sans agitation.
- Aspirer le paraformaldéhyde et laver trois fois avec du PBS, se balançant à la température ambiante pendant 5 min à chaque fois. Ajouter l'éthanol à 80% conservé à -20 ° C et incuber à 20 ° C pendant au moins 1 heure. Les plaques peuvent être maintenus sous l'éthanol à -20 ° C pendant plusieurs jours dans la mesure où ils sont bien scellé pour empêcher l'évaporation d'éthanol et séchage.
- Aspirer l'éthanol et laver les cellules deux fois avec du PBS et une fois avec du PBS-BT (PBS contenant 0,5% de BSA et 0,05% de Tween-20), se balançant à la température ambiante pendant 5 minutes à chaque fois.
- Pour empêcher la liaison d'anticorps non spécifique, les cellules bloquer dans 1 ml de PBS-BT tampon contenant du sérum de chèvre à 10% pendant 20 min tout en basculant à température ambiante. Puis, lavez til cellules deux fois dans du PBS-BT, à 5 min à chaque lavage.
- Incuber les cellules avec l'anticorps primaire (un anticorps spécifique E4orf4 dans notre cas) dans 1 ml de PBS-BT pendant 1 heure tout en balançant à la température ambiante. Puis laver deux fois dans du PBS-BT et une fois dans du PBS contenant 0,1% de BSA, 5 min pour chaque lavage.
- Incuber les cellules dans 1 ml de PBS-BSA 0,1% contenant le cas échéant d'anticorps secondaire marqué par fluorescence et 0,5 ug par ml concentration finale de DAPI à 40 min tout en basculant à température ambiante dans l'obscurité. Ensuite laver avec du PBS pendant 5 min, bien sécher par aspiration et maintenir les plaques à l'envers pendant une heure supplémentaire ou toute la nuit pour obtenir un séchage complet. Ensuite, montez diapositives couverture sur les cellules, en utilisant Fluoromount-G solution. Conserver les plaques à 4 ° C dans l'obscurité jusqu'au moment de compter les noyaux apoptotiques.
- Demandez à un collègue afin d'identifier les différentes plaques par de nouveaux numéros, comptant noyaux apoptotiques dans les différents échantillons peut être fait d'une manière impartiale.
- Visualisez les cellules sous un upright microscope à fluorescence à un grossissement de 400X (dans l'air) ou 630X (dans de l'huile d'immersion). Identifier les cellules transfectées qui sont colorées pour les différentes protéines exprimées dans chaque échantillon, et de compter le nombre de noyaux condensés ou fragmentés visualisés par coloration DAPI à l'intérieur de la population de cellules transfectées. Surveiller plusieurs domaines et compter un total d'au moins 200 cellules transfectées.
- Calculer le pourcentage de noyaux avec une morphologie apoptotique au sein de la population de cellules transfectées. Répétez l'expérience, avec des doublons, 2-3 fois pour calculer la signification statistique des changements entre les différents échantillons.
4. Les résultats représentatifs
L'efficacité des colonies dans lesquelles l'obtention knockdown conditionnelle de l'expression du gène a été couronnée de succès est variable, en fonction du gène impliqué. Dans nos mains, nous avons obtenu 7 colonies succès sur 12 testées pour Acf1 et 6 sur 18 pour SNF2h. Figure 2 shux une plaque représentant des clones de cellules sélectionnées (Figure 2A), ainsi que d'une colonie unique (figure 2B). Figure 3 montre un transfert représentant préparés avec des protéines extraites de cellules de différents clones cultivés en présence ou en l'absence de la doxycycline pendant 72 heures. Le transfert a été colorées avec des anticorps à SNF2h et à l'alpha-tubuline, servant de témoin de charge. Deux des clones (n ° 4 et 5) ont montré une forte diminution des niveaux d'induction SNF2h sur la doxycycline. Il est à noter que bien que le plasmide GFP + pSuperior.neo (figure 1) utilisé pour la production de lignées cellulaires code pour une protéine de fusion GFP-néo, la fluorescence verte dans les lignées cellulaires stables était très faible et l'expression d'autres protéines de fusion GFP introduit de façon transitoire dans ces cellules pourrait être facilement détectée au-dessus de la fluorescence verte de fond.
Une représentation schématique des expériences menées dans les clones cellulaires pour mesurerque l'effet de Acf1 ou knockdown SNF2h sur la mort cellulaire induite par E4orf4 est montré dans la Fig. 4. Le temps nécessaire pour abattre l'expression des gènes par la doxycycline peut varier en fonction de la stabilité de la protéine dont les niveaux devraient être réduits. Pour Acf1 et SNF2h, un traitement 72 heures a été nécessaire pour abattre efficace au niveau protéique.
La figure 5 montre un exemple de cellules exprimant la GFP et E4orf4 et subissant une mort cellulaire se manifeste par l'apparition de DAPI-noyaux colorés avec une morphologie condensé ou fragmenté. La figure 6 montre les résultats d'une expérience représentative démontrant que la doxycycline induite Acf1 knockdown conduit à une augmentation de E4orf4 stimulée par la mort cellulaire (figure 6A). Cette augmentation ne résulte pas d'une augmentation des niveaux de E4orf4 (figure 6B). Par ailleurs, la restauration de Acf1 aux cellules induites par la doxycycline réduit l'augmentation de la toxicité E4orf4 aux niveaux observée dans les cellules non induites (Figure 6).
Figure 1. Carte du plasmide GFP + pSuperior.neo. La carte montre le promoteur H1 inductible par la tétracycline entraîner l'expression shRNA et l'expression promoteur PGK de conduite d'une protéine de fusion GFP-néo. La carte a été adapté à partir du manuel OligoEngine pSuperior.
Figure 2. Images d'identification de colonies résistantes à la néomycine. D'une plaque contenant des colonies (A) et d'une colonie unique (B) sont affichées. Les colonies ont été obtenues par culture des cellules pendant 14 jours dans un milieu sélectif contenant de la néomycine.
Figure 3. Les cellules d'examen de l'efficacité knockdown dans les colonies sélectionnées. Plusieurs colonies de sélection en présence de néomycine ont été étalées dans des puits en double. Un puits de chaque échantillon a été induite par la doxycycline (+) et un puits a été laissée non traitée (-). Les protéines ont été extraites 72 h après l'induction et chromatographie sur gel SDS-PAGE. Le Western blot a été coloré avec des anticorps successivement à SNF2h et à l'alpha-tubuline (servant de témoin de charge) et montre les niveaux SNF2h dans les cellules induites et de contrôle.
Figure 4. Planification d'un essai typique expérience knockdown-DAPI. Étapes successives de l'expérience sont présentés, y compris le traitement doxycycline pour atteindre Acf1 ou knockdown SNF2h, une transfection à restaurer Acf1 ou SNF2h expression ou d'introduire un empté vecteur et d'introduire E4orf4 ou son vecteur vide correspondant dans les cellules, et l'analyse des résultats. Doxycycline traités plaques sont indiqués en rouge (Dox) et les plaques de contrôle sont marqués en bleu. Cliquez ici pour agrandir la figure .
Figure 5. Les cellules de détection de la mort cellulaire induite par E4orf4 par le test DAPI. Qui ont subi divers traitements décrits dans la figure 4 ont été fixées et colorées avec des anticorps spécifiques de E4orf4 et DAPI pour visualiser les noyaux des cellules transfectées. Sur cette photo a été prise à partir d'un échantillon contenant E4orf4 et la protéine GFP contrôle. (A) la GFP. (B) E4orf4. (C) DAPI. (D) des images fusionnées. Les flèches blanches marque de GFP et E4orf4 cellules transfectées contenant des noyaux avec des morphologies apoptotiques. Les flèches rougesmarquer les noyaux avec des formes irrégulières qui ne sont pas comptés comme des noyaux apoptotiques. Les astérisques noyaux mitotiques marque ou noyaux qui viennent divisée.
Figure 6. Acf1 knockdown améliore la mort cellulaire induite par E4orf4. (A) Les cellules de la lignée cellulaire T-rex-293-dérivée exprimant Acf1-shRNA partir d'un promoteur inductible par la tétracycline ont été induites par la doxycycline (+ Dox) ou non traitée (-Dox). Trois jours plus tard, les cellules ont été transfectées avec des plasmides exprimant E4orf4 (+ E4orf4) ou un vecteur vide (-E4orf4) avec un vecteur vide ou un plasmide exprimant la GFP Acf1-étiqueté, qui a été rendu résistant à la shRNA par l'introduction de silence mutations. Les cellules ont été fixées 24 heures après la transfection et colorées avec des anticorps pour E4orf4 et au DAPI. L'induction de la mort cellulaire a été mesurée par le test DAPI décrit ci-dessus et le pourcentage of cellules transfectées avec des noyaux condensés ou fragmentés a été déterminée. Une expérience représentative de trois répétitions est affiché, et les barres d'erreur représentent la déviation standard. (B) Les cellules de plaques parallèles ont été récoltés pour analyse par Western blot. Le transfert a été colorées avec des anticorps à E4orf4, la GFP, et Acf1. Le Acf1 endogène et Acf1-GFP sont présentés dans deux panneaux distincts.
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Discussion
Knockdown de l'expression génique spécifique est une approche importante pour l'enquête de la contribution d'une protéine de voies de régulation. Depuis knockdown de l'expression constitutive de gènes essentiels affecte négativement la prolifération cellulaire, leur étude peut exiger soit l'introduction transitoire de siRNA ou l'application de systèmes stables knockdown conditionnelles. Génération de lignées cellulaires stables avec la capacité d'origine médicamenteuse expression de shRNA décrits ici, donne un avantage par rapport à des transfections transitoires qui peuvent ne pas être efficace dans de nombreuses lignées cellulaires, et sur l'utilisation de virus qui nécessitent une préparation répétée et parfois un supplément de court- sélection terme. Les lignées cellulaires, une fois générées, ne nécessitent pas de préparation supplémentaire. En outre, dans nos mains, transfections transitoires de constructions shRNA sont beaucoup moins efficace dans renversant l'expression des gènes par rapport à l'induction de l'expression shRNA dans les lignées cellulaires sélectionnées. Il est recommandéed cependant de déterminer dans chaque expérience que l'effet de choc induite par le médicament reste efficace. Un inconvénient potentiel de l'utilisation de lignées cellulaires stables pour effet de choc conditionnelle de l'expression des gènes est qu'ils peuvent avoir acquis des modifications supplémentaires au cours du processus de sélection qui pourraient affecter les résultats des expériences. Cependant, pour remédier à ce problème, on peut réaliser l'expérience dans deux lignées cellulaires parallèles ou inverser l'effet knockdown par l'introduction d'un plasmide exprimant une protéine shRNA résistant WT. Si la protéine WT élimine l'effet de la shRNA, puis un effet clonal peut être exclue.
Classique, la caspase-dépendante l'apoptose, on peut doser par de nombreuses méthodes de détection, y compris de l'activation des caspases, annexine-V coloration, coloration tunnel, la détection d'une population de cellules sous-G1 par FACS, etc 10. Cependant, E4orf4 induit une non-classique, la mort cellulaire caspase-indépendante dans de nombreuses lignées cellulaires et plusieurs méthodespour la détection de l'apoptose ne sont pas applicables à la détection de ce mode unique de 6,7,11,12 la mort cellulaire. Il a été précédemment montré que les morphologies les plus typiques associés à la mort cellulaire induite par E4orf4 comprennent bourgeonnement de la membrane, de la condensation nucléaire ou la fragmentation, et 13 détachement cellulaire. Par conséquent, nous mesurons habituellement la mort cellulaire induite par E4orf4 par le dosage de la condensation nucléaire et la fragmentation, ou perte de cellules.
Lorsque l'on utilise le test DAPI, il faut accorder une attention particulière aux points suivants: 1) Pour maintenir l'objectivité optimale de l'essai, il est fortement recommandé que l'essai sera effectué dans un "mode aveugle» de sorte que la personne qui compte le nombre des cellules contenant des noyaux avec des morphologies apoptotiques vont pas être au courant de l'identité de l'échantillon. 2) Il est recommandé de maintenir les critères stricts pour identifier les morphologies nucléaires apoptotiques qui ne doivent pas être confondus avec les noyaux mitotiques ou des noyaux avec unevmorphologies fr (voir figure 5). D'autres tests de mort cellulaire peut également être employé en tant que de lecture de l'expérience, tels que les tests clonogéniques survie cellulaire 8.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Ce travail a été financée (en partie) par la Fondation ISRAEL SCIENCES (Grant 399/11), par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) dans le cadre de la coopération germano-israélienne Projet (DIP), et par l'Institut de la famille Rappaport pour la recherche en des sciences médicales.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| High glucose DMEM | Gibco | 41965 | |
| Tet system approved FBS | Clontech | 631106 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030 | |
| Pen Strep | Gibco | 15140 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200 | |
| T-REx-293 cells | Invitrogen | R710-07 | |
| G418 | Sigma | A1720 | |
| blasticidin | Invitrogen | R210-01 | |
| pSuperior.neo+GFP plasmid | OligoEngine | VEC-PBS-0007/0008 | |
| jetPIE | Polyplus transfection | 101-40 | |
| doxycycline | Sigma | D9891 | |
| paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma | D9542 | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 |
References
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