Summary
可视化的单个细胞密集的组织，如终端雪旺氏细胞（SC）的神经肌肉接头（NMJs），是具有挑战性的。 “连续光漂白”可以划定单一的终端南海，例如在的三角sterni肌肉外植体，方便神经肌肉准备，连续的漂白可以结合时间推移成像
Abstract
顺序光漂白在NMJ标记个别SC的，提供了一种非侵入性的方式。 NMJ是世界上最大的哺乳动物神经系统的突触，并担任指导模式研究突触的结构和功能。电机轴突在鼠标NMJs的终端形成与肌纤维的椒盐卷饼般的接触位点。公务员事务局局长电机轴突和终端的护套。在过去的几十年里，转基因小鼠已产生运动神经元和SC可视化，例如大鼠Thy1-XFP和PLP-GFP小鼠，分别。
沿着运动神经元轴突，髓鞘轴索SC的配置在非重叠的节间，分离由节点朗维埃，启用跳跃动作电位传播。相比之下，公务员事务局局长的突触终端是专门的神经胶质细胞，监督和促进神经传导，消化碎片和引导轴突再生。的NMJs盖好了半打非MYELinating端子SC的- ，但是，这些不能被单独用光学显微镜解决，因为它们是在直接膜接触3。
有几种方法可以单独可视化终端种姓。这些都不是完美的，虽然。例如，染料填充，单细胞染料填充微刺穿，需要摧毁了标记的细胞，然后再填充第二个。与随后的时间推移录音3，这是一个不兼容。多光谱“Brainbow”标签的判已经实现，通过使用组合的荧光蛋白的表达4。然而，该技术需要结合几个转基因和限制使用的启动子的表达模式。在未来，“照片切换的”蛋白质在SC的表达可能会对又一替代5。在这里，我们提出了连续的光漂白，漂白单细胞，和自己的形象得到减法。我们相信，这种方法-由于其易用性和多功能性-代表持久除了神经学家的技术调色板，特别是因为它可以在体内使用，转移到其他类型的细胞，解剖部位或物种6。
在下面的协议，我们详细的应用顺序漂白时间的推移和随后的共聚焦显微镜终端公务员事务局局长的三角sterni肌肉植。这本薄薄的，肤浅的，容易解剖神经肌肉准备7,8证明是有益的研究NMJ发展，生理和病理9。最后，我们解释了如何的三角sterni肌肉固定后准备执行相关的高解析度激光共聚焦成像，免疫组化或超微结构检查。
Protocol
1。三角Sterni外植体（ 图1）
定时：15分钟。
- 准备手术器械：2双钳，剪刀，春风似剪刀1对，1个组织培养皿中（10厘米）。预鼓泡（至少15分钟）冷却的（4°C）的林格氏溶液，5％CO 2/95％O 2。填充15厘米的冰和组织培养皿中与金属板覆盖。准备解剖显微镜下的清扫范围内，放置在15-cm培养皿中，用冰冷为了冷却剥离时的外植体。
- 致死麻醉小鼠的异氟醚过量（或任何其他批准的方法牺牲）。鼠标喷用70％乙醇，以防止毛皮的外植体的污染。用于SC漂白中，我们使用PLP-GFP小鼠，这可以划线，同时可视化的轴突Thy1肾炎大鼠 -OFP3或大鼠Thy1系-Membow13。
- 对大剪刀，正中切开胸骨上方的皮肤和两个平行的肋条笼形件的下边缘的切口。
- 对使用大剪刀，去除皮肤，打开腹壁，使切口平行的肋骨，脊柱回来的路上。然后解剖胸肌的肌肉插入胸骨切口密切。
- 光阑开剑突软骨下切，沿右肋插入解剖隔膜。
- 的肋笼由剑突过程与镊子一套，开始关闭脊柱切割肋，尽可能地接近其插入。左，右削减收敛高于柄sterni的心脏，对。尽量避免减少大血管（尤其是锁骨下静脉）。剑突上的准备，而用钳子轻轻抬起来实现更好的可视性。
- 做一个横向切的正下方胸骨柄sterni和10-cm培养皿中，将外植体转移到冷却的5％CO 2/95％O 2鼓泡的林格氏溶液。将10-cm培养皿中，在金属板覆盖15厘米的组织培养皿中，用冰冷填充。解剖显微镜下，所有进一步的步骤应该做的。
- 使用小弹簧剪刀除去残存的胸腺，胸膜，膈肌（内部）和胸肌（外图1B-D）。
- 为了适应不同的外植体，以3.5厘米的菜，剖析不插入到胸骨的肋骨。最好的做法是使用小春风似剪刀，切割组织之间的肋骨（ 图1E）。
- 引脚的的三角sterni神经-肌肉植到Sylgard的涂层3.5 cm的组织培养皿中使用minutien引脚（缩短至4毫米; 图1G）。两个引脚应该通过胸骨软骨部分（白色）。通过插入至少两个引脚的肋上的左和右侧的第Ê外植体，旨在为较软软骨份和避免下肋或接近三角肌肉。使用更多的引脚，（我们通常使用8-10）。正如你所牵制的准备，确保肋骨有点蔓延，固定的肌肉稍微伸展的位置。
- 可选：可视化含有通过加入与Alexa染料（0.8微克/毫升的浓度在5％CO 2/95％O 2 -鼓泡林格氏溶液）耦合到银环蛇毒素的乙酰胆碱受体的突触网站。孵育中：Sylgard的涂布盘为15-20分钟，在室温下的固定的外植体，然后，用5％的CO 2/95％O 2 -鼓泡林格氏溶液洗几次。
2。漂白SC和可选的时间推移显微镜（ 图2）
定时：30 - 45分钟+可选1 - 5小时为时间间隔。
- 转让3.5厘米Sylgard的涂层菜，激光共聚焦显微镜配备机智H的氩激光（488nm的波长）和水浸泡的目标（4倍，0.13 NA，20倍，0.5 NA和100x，1.0 NA或60倍，0.9 NA）。
- 可选时间的推移显微镜 ：插入3.5厘米的菜到Sylgard的涂层加热圈，安装灌流系统和温度探头（ 图2A）。确保他们没有接触外植体，边缘的菜或SYLGARD的涂层。样品加热至33-35°C。对于SC漂白没有时间推移，室温下是更好的，随着细胞的显示漂白步骤之间的动态关系。
- 观察了4倍的空中目标模式的三角sterni的肌肉神经支配和找到三角sterni终板带。切换到20倍浸泡锥客观和开始寻找终板带表面的区域内（区域覆盖的肋骨是很好的候选人）。更改目标100倍或60倍的的浸渍锥目标检查个人NMJs。理想是NMJ所涵盖的几个种姓，位于会阴ially（ 图2B）。如果执行时间推移成像漂白后，选择到3 NMJs，是比较密切的合作，以增加产量。
- 采集之前的NMJ光漂白个别SC的（ 图2B）的共焦图像。 （对于全分辨率的成像， 例如在Olympus FV1000显微镜，使用100倍，1.0 NA物镜和2.5放大，这会导致在〜0.1μm的每个像素的奈奎斯特采样有限。）
- “公园”的488 nm激光束集中在细胞核内的SC采用最大功率为5秒（或者可以使用高效的扫描模式，在一个小区域的利益，如“龙卷风扫描”功能的奥林巴斯显微镜上;为我们所用激光共聚焦显微镜，激光被聚焦到的图像共轭平面，因此，在488nm处用客观1.0 NA，<0.5微米的直径）。重新聚焦于细胞和法官漂白结果。如果有必要，请重复漂白工序，直到GFP水平减少d，来接近背景水平。采集漂白后的图像（ 图2C）。这是至关重要的，使确保漂白区域以外的两个单元之间的任何重叠 - 如果出现重叠，漂白的第二小区中是显而易见的。
- 重复上述步骤，直到所有，但一个SC漂白（ 图2D-E）。最后的“漂白的”SC适合共聚焦时间的推移显微镜。单细胞重建图像的减法， 如使用Photoshop软件，划定单一的SC形态和领土（ 图2F）。要知道，减去两个法师都会增加噪声（ 例如通过导入他们连续在Photoshop中的“层”，然后在下拉菜单中的“ 差异化 ”的频道选项卡上方的顶部通道），。这可以规避使用“ 散斑 ”功能之前减法的渠道和种植，显然不是来自任何背景漂白细胞。为了优化对比度，也可以是需要调整的两个通道中的“ 水平 ”窗口的亮度。漂白细胞所得到的图像是叠加在原始图像上的突触，在一个独特的色调的伪彩色，透明的，着色的漂白细胞领土中的原始图像（从这样做可用于所有漂白和最后棉纱细胞图2F中的结果）所示的图像。
- 可选：启动时间的推移显微镜共聚焦后漂白，但一个SCS。在固定的时间间隔（例如每5至10分钟），拍摄图像。使用尽可能少的激光功率。可拍摄最多3个NMJs，在同一届会议。
- 在100x通过拍摄图像无变焦，则该区域的图像，使用20倍和4倍的目标（ 图2G-I）在地图上的时间推移NMJs的。这种“映射”需要找到一个固定的肌肉免疫组化后的NMJs。
- 对于图像处理，转换成个人最大强度的预测，并保存为TIFF格式的图像。将所有Z-投影成叠的时间点在XY和调整， 例如在斐济（包的基础上的开源软件ImageJ的美国国立卫生研究院）使用“stackreg的”插件10。
3。固定和免疫组化（ 图3）
定时：过夜。
- 外植体转移到一个50毫升的反应管含有至少15毫升4％PFA通过仔细除去标签。修复后的前胸壁1小时上冰的的三角sterni肌肉。冲洗固定的组织与在PBS中的0.1M甘氨酸（淬灭残留的固定剂，从而减少背景）至少10分钟。样品可以被存储在这一点上，和购买处理。
- 固定植转移到10厘米SYLGARD涂层的组织培养皿中充满了0.01 M PBS。切出一个梯形的形状与一个Si的平行胸骨和其他通过的骨软骨过渡 - 这包含在其表面的三角肌肉。去除低肋的水平（ 即反式胸骨）切割成使得其可以自由访问的三角肌肉的尾端（ 图3A-D）。
- 作为梯形的上部（ 图3E）的销进入插入一个皮下注射针头。使用一个皮下注射针头连接到一个1毫升的注射器和镊子除去三角肌肉的表面上，通过轻轻地保持到尾角的肌肉，和使用针作为微型手术刀。确保削减胸壁的平面平行。被释放后尾部分的肌肉，插入另一个皮下注射针一针下面通过胸壁的肌肉-这固定的编制，并允许使用产钳（ 图3F）对肌肉产生一个温柔的拉。当你在切割结缔组织TISSUE插入“剥离”了从胸部的肌肉。春风似剪刀剪下最后的尾附件。除去脂肪和血管残余，使用产钳。要小心，不要撕裂了的神经。 注意：使用两套独立的工具和餐具现场和固定的组织工作。
- 启动免疫组织化学（使用一个标准的协议）的组织样品转移到封闭溶液，在室温下1小时，在振荡器上。染色的最小可能的体积为200微升，使用96孔板中。
- 应用在封闭溶液，200微升每孔，过夜，4℃下在振荡器上稀释的第一抗体。
- 在0.01M的PBS清洗3次洗涤10分钟。
- 用合适的二级抗体，为1-2小时，在室温下在封闭溶液稀释。
- 在0.01M的PBS清洗3次洗涤10分钟。
- 安装在抗衰落的介质（ 如 Vectashield）和盖玻片。
- 磁性金属板，将磁铁在上面的广场上滑行的样品在4℃下的几个小时或过夜弄平密封指甲油。
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Representative Results
一个准备好成像菜的的三角sterni外植体的一个例子是在图1G所示。此外植体是特别适合用于成像NMJs 体外作为三角的肌肉仅由数层的肌肉纤维。这允许获得高清晰度的图像，从外植体来源于转基因小鼠系，亮点要么判（PLP-GFP 2）和/或轴突（Thy1肾炎大鼠 -XFP 1）。高品质成像的关键因素包括：（i）避免接触三角肌肉外植体的制备过程中，以防止肌肉纤维损伤;（2）选择的肤浅和平面突触减少与深度相关的像差，（iii）不因过热而受损的样品（> 37 °C），并保持样品的氧化，（四）可能停止灌流在成像过程中，减少漂移或振动;（V）小心地将灌流管和温度探测器，以避免接触样品，以及Keeping底部的菜干，以防止漂移;（六）全面漂白“抵押品”的信号损失，避免脱靶SC的最大化对比度平衡。肌肉抽搐和轴突碎片的经常观察到的现象，如果外植体损坏和不健康的。准备在模糊的的共聚焦栈的预测结果的不稳定性。然而，一旦所描述的顺序光漂白技术的工作原理，它揭示了形态单一的终端SC相当详细（ 图2F）。单个终端SC的显示形态的可以是相当令人惊讶的，未漂白前容易地预测。此外，SC蠕动内NMJ程度可以不被揭示不标记单个细胞。
活显微镜，可以的三角sterni外植体固定和染色的任何感兴趣的标记（ 图3）。对于这一点，住成像细胞可以追溯到地图CREA特德预先（ 图2G-I），并在固定的组织的高分辨率扫描。可以使用通常是标准的方法进行免疫组化 - 1这里需要说明的是抗体渗透可以相当有限，有髓神经轴突，需要很长的抗体孵育时间的事实。再次，选择浅表NMJs和固定的肌肉（不巧取豪夺神经）以及去除脂肪残留物，有助于避免这一缺陷。
图1。三角sterni外植体的准备。（A）编写的三角神经肌肉外植体，它是必要的解剖完整的前胸壁鼠标（鼠标上的示意性地叠加）。 （B）前胸壁只是经过解剖。 （
s/ftp_upload/4460/4460fig3.jpg“/>
图3。剖析的固定三角sterni的肌肉和形象的固定NMJ。（A）的固定三角sterni外植体在细胞培养皿中的PBS涂用Sylgard。 （BD）剪切，进行春风似剪刀隔离三角sterni肌肉的。 （EG）钉植片的三角sterni肌肉，消除肌肉表面。 （H，I）固定在图2中，成像非常NMJ视图。乙酰胆碱受体与银环蛇，Alexa的647（红色）和抗突触素抗体（白色）的突触小泡与染色。 点击此处查看大图 。
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Discussion
SC漂白这里介绍的方法很简单，速度快，通用性：（一）它使一个单一的基因-这是一个显着的优势相结合的方法， 例如需要额外的基因与疾病模型，激光共聚焦显微镜的基础上揭示单SC形态和动态。 （ii）该方法具有快速，从解剖，以固定它可以在半天的时间。 （ⅲ）的应用程序的数目是广泛的，因为它可以与其他方法，如细胞消融，成像的细胞器，电生理学或免疫组织化学结合。此外，在这里为小鼠NMJs SC的在提出的方法可以推广到其他的细胞，组织或物种 - 参考文献6中提出了在斑马鱼中的一种相关技术的应用程序的一个例子。其他除了绿色荧光蛋白的荧光蛋白也可用于漂白和时间推移显微镜，例如YFP或CFP。虽然我们还没有使用这些荧光蛋白在南海，bleachi吴轴突显示，在此设置一个不太稳定的荧光蛋白（ 如 CFP）是有利的。然而，有效的漂白和稳定的成像之间的一种折衷有被发现，这取决于所需的结果（ 例如单个的图像随时间的推移的其它未漂白的细胞）。
该技术有很多的限制，但是。一个涉及一个取出的（并且因此视神经切断后）肌肉，这限制了成像期间使用。在以前的研究中，我们发现 - 根据正在研究的问题 - 三角sterni的外植体，可用于最多3-6小时。尽管如此，顺序可以在体内使用光漂白，克服这种限制提供样品，可充分稳定，得到可减去的图像。另外两个方面需要牢记，在分析数据时产生的顺序漂白的方法：（一）光毒性可能会改变SC活力，为k在迅速扩大，其邻居11解毒，阿莫西林终端SC结果。因此，合理性检查应包括， 例如，测量在一个稳定的突触扩张和撤消的总和。平均而言，南海成像人口不应该明显地增大或缩小。 （ii）在所有的形态，但最后一个SC得到的图像相减。这样的图像的质量取决于对所获得的漂白对比度。这通常是实现在明亮的鼠标线。例如，PLP-GFP的工作比S100-GFP 12。图片减法都会增加噪声，使南海的最后透露更多的细节比别人（尤其是还可以，作为事后成像后固定，允许使用高数值孔径油目标）。因此，只应被接受的形态特征是真实的，如果它是在“最后的”SC的，以及在漂白的可见。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
我们想感谢曼努埃拉·布达克，Ljiljana Marinkovi和克里斯蒂娜Wullimann的，为优秀的技术援助。我们感谢W.麦克林提供PLP-GFP小鼠。 TM高级研究所（慕尼黑工业大学），德意志研究联合会（DFG Sonderforschungsbereich SFB 596），亚历山大冯洪堡基金会支持，由国家提供资金的机构（的“Bundesministerium献给教化和Forschung” ）ERA-净神经元“iPSoALS”和“2 - 光子成像”中的帧的。 TM和MB支持由集成蛋白质科学中心（慕尼黑）。 PM由研究生院的慕尼黑工业大学（TUM-GS）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70% (vol/vol) ethanol solution | Roth | T913.1 | in spray bottle |
| isoflurane | Forene, Abbott | any other approved anaesthetic can be used for lethal anaesthesia | |
| transgenic mice (Plp-GFP) | to be obtained from cited sources | ||
| dissection microscope with cold-light illumination | Olympus SZ51 | equipped with Schott KL 1500 LCD | |
| forceps #2 | Fine Science Tools | 11233-20 | |
| forceps #5 | Fine Science Tools | 11295-00 | |
| scissors, large medical | Fine Science Tools | 14108-09 | |
| scissors, small angled spring | Fine Science Tools | 15033-09 | |
| in-line heater | Warner Instruments | SF-28 | |
| heating ring for 3.5-cm dishes | Warner Instruments | 64-0110 DH-35 | |
| two channel temperature control system | Warner Instruments | TC-344B | |
| superfusion pump system | custom-built | ||
| 15-cm tissue culture dish | Sarstedt | 83.1803.003 | filled with ice and covered by metal plate |
| 10-cm tissue culture dish | Sarstedt | 83.1802.003 | with oxygenated Ringer's solution |
| 3.5-cm tissue culture dish | Sarstedt | 83.1800.003 | filled with Sylgard polymer |
| Sylgard polymer | Dow Corning | Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | |
| confocal microscope | Olympus | FV1000 | with argon laser |
| 50-ml reaction tube | Sarstedt | 62.547.254 PP | |
| 4% PFA in PBS | Sigma | P6148 | |
| cannula 0.5 mm x 25 mm | Neolab | E-1510 | |
| syringe 1 ml | Neolab | E-1496 | |
| synaptophysin antibody | Invitrogen | 18-0130 | rabbit |
| secondary antibody | Invitrogen | A-11012 | Alexa 594 |
| 24-well plate | Sarstedt | 83.1836 | |
| 0.01 M PBS | Sigma | P4417 | |
| 0.1 M glycine in PBS | Roth | 3790.1 | |
| coverslips | Neolab | E-4132 | |
| slides | Neolab | E-4121 | |
| Vectashield | Vector labs | H-1000 | |
| minutien pins ×10 | Fine Science Tools | 26002-20 | shortened to < 4 mm |
| α-Bungarotoxin coupled to Alexa 594 | Invitrogen (Molecular Probes) | B-13423 | |
| Blocking Solution | |||
| 0.01 M PBS | |||
| 0.2% Triton-X100 | Roth | 3051.3 | |
| 10% Normal Goat Serum | Abcam | ab7481 | |
| 1% bovine serum albumin | Sigma | A7030 | |
| Ringer bubbled with 95% O2 /5% CO2 |
|||
| 125 mM NaCl | Sigma | S7653 | |
| 2.5 mM KCl | Sigma | P9333 | |
| 1.25 mM NaH2PO4 | Sigma | S8282 | |
| 26 mM NaHCO3 | Sigma | S6297 | |
| 2 mM CaCl2 | Sigma | 21114 | |
| 1 mM MgCl2 | Sigma | 63020 | |
| 20 mM glucose | Sigma | G7528 | |
Table 1. Specific reagents and equipments. |
|||
References
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