Summary
Визуализация отдельных клеток в плотно упакованных тканей, таких как терминал шванновских клеток (СК) в нервно-мышечных соединениях (NMJs), является сложной задачей. "Последовательное фото-отбеливание» позволяет разграничения одного КА терминала, например, в трицепс мышцы грудины эксплантов, удобный нервно-мышечного препарата, где последовательного отбеливания могут быть объединены с покадровой обработки изображений и
Protocol
1. Triangularis Стэрни эксплантов (рис. 1)
Хронометраж: 15 мин.
- Подготовка хирургического инструмента: 2 пары щипцов, 1 ножницы, 1 пара ножниц весны, 1 ткань культуры блюдо (10-см). Предварительно пропускают (минимум 15 минут) охлажденного (4 ° C) раствор Рингера с 5% CO 2/95% O 2. Заполнить 15-см ткань культуры блюдо со льдом и покрыть ее металлической пластиной. Подготовка рассечение микроскопом и поместите 15-см блюдо со льдом при вскрытии рамки для того, чтобы охладить эксплантов во время вскрытия.
- Смертельно анестезию мыши, изофлурана передозировки (или любые другие проверенные методы жертвоприношения). Спрей мышь с 70% этанола для предотвращения загрязнения меха эксплантов. Для SC отбеливания, мы использовали Plp-GFP мышей, которые могут быть пересечены в Thy1-OFP3 или Thy1-Membow13 для одновременной визуализации аксонов.
- Используя пару больших ножниц, сделать срединный разрезкожу над грудиной и два разреза параллельно нижнему краю грудной клетки.
- Используя пару больших ножниц, снять кожу, откройте брюшной стенки, и делать разрезы параллельно грудной клетке все пути назад к позвоночнику. Затем рассекают от грудных мышц, сделав надрезы близкий к мышце вставки на грудину.
- Разрежьте диафрагму открытой чуть ниже мечевидного хряща и рассекают от диафрагмы вдоль реберной вставками.
- Проведение грудную клетку от мечевидного отростка с набором щипцов, начинают бросать ребра от позвоночника, как можно ближе к их вставки. Левая и правая сокращения должны сходиться над сердцем к рукояткой грудины. Старайтесь избегать резки крупных кровеносных сосудов (особенно подключичной вены). Лучшая видимость достигается за счет осторожно приподнимая подготовки, держась мечевидного отростка щипцами.
- Сделайте поперечный разрез чуть ниже рукоятки грудиныи передать эксплантов в 10-см блюдо с охлаждением 5% CO 2/95% O 2-пропускали раствор Рингера. Поместите 10-см антенну на металлическую пластину, закрывающую 15-см ткань культуры блюдо со льдом. Все дальнейшие шаги следует сделать при вскрытии микроскопом.
- Используя маленькие ножницы весной удалить остатки вилочковой железы, плевры, диафрагмы (внутренней) и грудных мышц (за пределами; рис. 1б-D).
- Для установки эксплантов к 3,5-см тарелку, рассекают с себя все ребра, которые не вставляют к грудине. Это лучше всего сделать с помощью небольших ножниц весной и резки тканей между ребрами (рис. 1E).
- Pin трицепс грудины нервно-мышечного эксплантов в Sylgard покрытием 3,5-см ткань культуры блюдо minutien использованием штифтов (сокращено до <4 мм; Рисунок 1G). Два вывода должны пройти через хрящевую (белые) части грудины. Вставьте по крайней мере, два вывода через ребра как на левой и правой стороне йэлектронной эксплантов стремится к более мягкой хрящевой части и избегать ребра под или рядом с трицепс мышцы. Чем больше контактов используется, тем лучше (мы обычно используем 8-10). Как вы придавить подготовки, убедитесь, что ребра несколько распространился, фиксируя мышцы в чуть вытянутом положении.
- Дополнительно: визуализировать синаптическую сайтов, содержащих рецепторы ацетилхолина, добавив bungarotoxin связан с Alexa красителей (концентрации 0,8 мкг / мл в 5% CO 2/95% O 2-пропускали раствор Рингера). Инкубируйте возлагали эксплантов в Sylgard покрытием блюдо в течение 15-20 мин при комнатной температуре, затем промыть несколько раз с 5% CO 2/95% O 2-пропускали раствор Рингера.
2. Отбеливание ПК и дополнительно замедленной микроскопии (рис. 2)
Сроки: 30 - 45 мин + дополнительно 1 - 5 ч в течение промежутка времени.
- Передача 3,5-см Sylgard покрытием блюдо конфокальной микроскопии оборудованы остроумиеч аргонового лазера (488 нм) и погружение в воду цели (4x, 0,13 NA; 20x, 0,5 НС и 100x, 1,0 НС или 60x, 0,9 NA).
- Дополнительно для покадровой микроскопии: Insert 3,5-см Sylgard покрытием блюдо в кольце отопления, установка системы superfusion и датчик температуры (рис. 2A). Убедитесь, что ни один из них касаются эксплантов, край тарелки или покрытия Sylgard. Нагрева образца до 33-35 ° C. Для SC отбеливания без покадровой, комнатной температуры лучше, как клетки показать меньше динамики между отбеливания шаги.
- С целью 4x воздуха наблюдается иннервации картина трицепс мышцы грудины и найти трицепс концевой пластинки грудины группы. Переключить на 20x погружения конуса цель и начать искать поверхностные регионов в концевой пластинки группы (ребра областей вышележащих являются хорошими кандидатами). Изменение целью 100x 60x или погружением конуса целью проверки на отдельных NMJs. Идеально является NMJ, которая покрыта несколькими ПК и расположен очень superficially (рис. 2В). Если вы выполняете покадровой визуализации после отбеливания, выбрать до 3 NMJs, которые относительно близко друг к другу для повышения урожайности.
- Приобретать конфокальной изображения NMJ перед фото-отбеливание отдельных СЭ (рис. 2В). (Для полного изображения разрешение, например, на Olympus FV1000 микроскопом, использовать 100x, 1,0 NA цель и 2,5 масштаба, в результате чего Найквиста ограниченной выборки ~ 0,1 мкм на пиксель).
- «Парк» 488 нм лазерный луч по центру ядра SC использованием максимальной мощности в течение 5 секунд (по выбору эффективной структуры сканирования в небольшой области интереса могут быть использованы, например, "Торнадо сканирования" функции на микроскопе Olympus; как мы используем в конфокальный микроскоп, лазер фокусируется в образ-сопряженных плоскостей и, следовательно, при 488 нм с целью 1,0 Н.А., <0,5 мкм в диаметре). Повторно сосредоточиться на клетку и судья отбеливания результат. При необходимости повторите шаг отбеливания снова, пока GFP уровни сниженияг почти до фонового уровня. Получить изображение после отбеливания (рис. 2С). Очень важно, чтобы убедиться, что беленой регион находится за пределами какого-либо дублирования между двумя ячейками - если есть перекрытие, отбеливание во второй ячейке будет очевидным.
- Повторите шаг выше, пока все, кроме одного SC отбеливаются (рис. 2D-E). Последний "небеленой" SC подходит для конфокальной покадровой микроскопии. Реконструкция одной клетки путем вычитания изображений, например, с помощью Photoshop программного обеспечения, чтобы очертить одним морфологии SC и территории (рис. 2F). Помните, что вычитания двух магов добавляет шум (например, путем их импорта в последовательных "слои" в Photoshop, а затем установив верхний канал "разница" в выпадающем меню в верхней части вкладки каналов). Это можно обойти, используя "Удаление пятен" функции на каналах перед вычитанием и обрезки от любой фон, который, очевидно, не происходят избеленой клетки. Для оптимизации Напротив, это может быть необходимо отрегулировать яркость двух каналов в "уровнях" окна. В результате изображение беленой ячейки накладывается на исходное изображение синапса, псевдо-окрашен в уникальный цвет и сделать более прозрачными, чтобы покрасить на территории беленой ячейки в исходное изображение (от делаю это для всех беленой и последний , небеленой клеток изображение, показанное на рис результаты 2F).
- Дополнительно: Начало конфокальной покадровой микроскопии после отбеливания все, кроме одного КА. Возьмите изображений через определенные промежутки времени (например, каждые 5 до 10 минут). Использование в качестве мало энергии лазерного насколько это возможно. До 3 NMJs может быть отображена на той же сессии.
- Сделать карту временем истек NMJs, взяв изображение в 100 раз без зума, то образы регионе с помощью 20x и 4x целей (рис. 2G-I). Эта «карта» необходимо найти NMJs после иммуногистохимии фиксированной мышцы.
- Для изображенияобработки, преобразования отдельных изображений в максимальной интенсивностью прогнозы и сохранить в формате TIFF. Смешайте все Z-прогнозируемых временных точках в стек и привести в ху, например, с помощью "stackreg" плагин 10 в Фиджи (пакет на основе открытого программного обеспечения ImageJ; Национальные Институты Здоровья).
3. Фиксация и иммуногистохимии (рис. 3)
Сроки: Ночь в отеле.
- Передача эксплантов в 50-мл реакционную трубку содержащий по меньшей мере 15 мл 4% PFA тщательно удаляя булавки. Сообщение, исправить передней грудной стенки содержащие трицепс мышцы грудины в течение 1 часа на льду. Промыть фиксированной ткани с 0,1 М глицина в PBS (чтобы утолить остаточной фиксатор и, следовательно, уменьшить фоновый), по крайней мере, 10 мин. Образцы могут храниться в этой точке и последующей обработки.
- Передача фиксированной эксплантов на 10-см Sylgard покрытием блюдо культуры ткани заполнены 0,01 М PBS. Вырежьте форму трапеции с одной сиде параллельно грудины и другой через кости с хрящом переходов - содержит трицепс мышцы на его поверхности. Удалите нижние ребра с горизонтальной (т.е. транс-грудины), разрезанный так, что хвостовой конец трицепс мышцы могут быть свободно доступны (рис. 3А-D).
- Вставьте иглу для подкожных инъекций, как штифт в верхнюю часть трапеции (Рис. 3E). С помощью иглы для подкожных инъекций прикреплены к 1 мл шприц и щипцы для удаления трицепс мышцы на поверхность, аккуратно держа на хвостовом углу мышц и с помощью иглы микро-скальпель. Убедитесь в том, что сокращения производятся параллельно плоскости грудной стенки. После хвостовой части мышцы освобожден, вставить другую иглу для подкожных инъекций, как контактный под мышцу через грудной стенки - это удерживает подготовки и позволяет оказывать нежно тянуть на мышцы с помощью пинцета (рис. 3F). Как вы резки соединительной Tissие вставки, "корка" от мышцы грудной клетки. Вырезать последних хвостовых вложения с весны ножницы. Удалите жир и остатки кровеносных сосудов с помощью пинцета. Будьте осторожны, чтобы не сорвать от нервов. Примечание: Используйте отдельные наборы инструментов и посуды для работы с живыми и фиксированной ткани.
- Начало иммуногистохимии (с использованием стандартного протокола) путем перечисления образцов тканей в блокирующем растворе в течение 1 ч на качалке при комнатной температуре. Наименьший возможный объем для окрашивания 200 мкл использованием 96-луночный планшет.
- Применить первичных антител разводят в блокирующем растворе, 200 мкл на лунку, в течение ночи при 4 ° С на качалке.
- Стирать в 0,01 М PBS три раза в течение 10 мин.
- Нанесите подходящий вторичными антителами в течение 1-2 часов при комнатной температуре разводят в блокировании решения.
- Стирать в 0,01 М PBS три раза в течение 10 мин.
- Установите в борьбе с замирание среды (например Vectashield) и покровное.
- Место слайдов на магнитной металлической пластины, место магнит на вершинеобразца для выравнивания в течение нескольких часов или в течение ночи при 4 ° C. Печать с лаком для ногтей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Пример трицепс эксплантов грудины готовы для работы с изображениями блюдо показано на рисунке 1G. Это эксплантов особенно подходит для визуализации естественных NMJs бывших, как трицепс мышцы состоит только из нескольких слоев мышечных волокон. Это позволяет получать изображения с высоким разрешением из эксплантов, полученные из трансгенных линий мышей, которые подчеркивают Ваш SCs (ПЛП-GFP 2) и / или аксонов (Thy1-XFP 1). Критические факторы высокое качество изображений включают в себя: (I), избегая прикосновения трицепс мышцы во время подготовки эксплантов, чтобы предотвратить повреждение мышечных волокон; (II), выбрав поверхностные и плоские синапсов уменьшить глубину связанные аберрации, (III) Не перегрева образца (> 37 ° C) и хранение образцов и кислородом, (IV) потенциально остановки superfusion во время съемки для уменьшения дрейфа или вибрации; (V), осторожно поместив трубку superfusion и датчиков температуры, чтобы не касаться образца, а также кeeping нижней блюдо сухим для предотвращения дрейфа; (VI), балансировка всеобъемлющего отбеливания избежать "побочных" потери сигнала в офф-целевого КА максимального контраста. Мышцы дергаться и аксонов фрагментации часто наблюдаются явления, если эксплантов поврежден и нездоровой. Нестабильность результатов в подготовке размытые прогнозы конфокальной стеки. Однако, как описано последовательное фото-отбеливание техника хорошо работает, он показывает морфологию одного SC терминала достаточно подробно (рис. 2F). Выявленные морфологии одного ТЦ Терминал может быть весьма удивительно и не так легко предсказать перед отбеливанием. Кроме того, степень подвижности SC в NMJ не может быть раскрыта без маркировки отдельных клеток.
После живого микроскопии, трицепс эксплантов грудины может быть фиксировали и окрашивали для любого маркера интерес (рис. 3). Для этого жить отображаемого клеток может быть прослежен назад с помощью карты CREAТед заранее (рис. 2G-I) и отсканированы с высоким разрешением в основной ткани. Вообще стандартных методов иммуногистохимии могут быть использованы - одно предостережение здесь является то, что антитела проникновения могут быть весьма ограничены в миелиновых аксонов и требует очень длительного времени инкубации антитела. Опять же, выбирая поверхностные NMJs и удаления остатков жира с фиксированной мышцы хорошо (без срывая нервы), помогает избежать этой ловушки.
Рисунок 1. Triangularis грудины эксплантов подготовки. (A) Для приготовления трицепс нервно-мышечного эксплантов необходимо анализировать полную передней грудной стенки мыши (схематично накладывается на мышь). (B) Передняя грудная стенка сразу после вскрытия. (
s/ftp_upload/4460/4460fig3.jpg "/>
Рисунок 3. Препарирование фиксированной трицепс мышцы грудины и изображения основных NMJ. (A) Исправлена трицепс эксплантов грудины в PBS в ячейке блюдо культуры покрыты Sylgard. (BD) Вырезание производится с весны ножницы, чтобы изолировать трицепс мышцы грудины. (EG) Закрепление экспланта кусок содержащие трицепс мышцы грудины и удаления мышцы от поверхности. (H, I) Исправлена ввиду очень NMJ, который был отображаемого на рисунке 2. Окрашивание на рецепторы ацетилхолина с bungarotoxin связан с Alexa 647 (красный) и синаптических пузырьков с анти-синаптофизин антител (белый). Нажмите, чтобы увеличить показатель .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
SC метод отбеливания, представленные здесь, простой, быстрый и универсальный: (I) Оно позволяет выявить одну SC морфологии и динамики с помощью конфокальной микроскопии на основе одного трансгенного - что является существенным преимуществом при объединении подход, например, с болезнью модели, которые требуют дополнительных аллелей . (II) метод является быстрым, как от рассечения к фиксации она может быть выполнена в половину дня. (III) количество приложений широк, как это можно сочетать с другими методами, такими как сотовые абляции, изображения органелл, электрофизиологии и иммуногистохимии. Кроме того, подход, представленный здесь SCs на мышиных NMJs может быть обобщен на другие клетки, ткани или видов - один из примеров применения связанных технику у рыбок данио представлен в ссылке 6. Кроме того, другие флуоресцентные белки, кроме GFP может быть использован для отбеливания и промежуток времени микроскопии, например YFP или CFP. Хотя мы не использовали эти флуоресцентные белки в СКС, bleachiнг аксоны показывает, что менее стабильные флуоресцентного белка (например, CFP) в этой ситуации может быть выгодно. Тем не менее, компромисс между эффективностью отбеливания и стабильное изображение должно быть найдено, в зависимости от желаемого результата (например, одно изображение по сравнению с покадровой оставшихся ООН беленой клеток).
Есть ряд ограничений на технику, однако. Один из них касается использования эксплантированных (и, следовательно, axotomized) мышца, которая ограничивает изображений периода. В предыдущих исследованиях мы обнаружили, что - в зависимости от вопроса в рамках исследования - трицепс эксплантов грудины может быть использована в течение максимум 3-6 часа. Тем не менее, последовательное фото-отбеливание может быть использован в естественных условиях, преодоления этого ограничения условии, что образец может быть достаточно стабилизировалась для получения изображений, которые можно вычитать. Два других аспекта необходимо иметь в виду при анализе данных, полученных от последовательного отбеливания подход: (I) Фототоксичность может изменить SC динамизм, как кIlling терминала SC приводит к быстрому расширению своих соседей 11. Таким образом, проверки достоверности должны быть включены, например, измерение суммы разложения и ретракции в стабильной синапс. В среднем, население распечатанных SCs не должно существенно увеличиваться или уменьшаться. (II), морфология все, кроме последнего SC получается путем вычитания изображений. Качество такого изображения зависит от полученного отбеливания контраст. Это обычно достигается легче в ярких линий мышей. Например, ПЛП-GFP работает лучше, чем S100-GFP 12. Изображение вычитания добавляет шум, так что последний КА, как правило, проявляется в более подробно, чем другие (в частности, также, как пост-специальных изображений после фиксации позволяет использовать высокие численные цели нефти диафрагмы). Таким образом, морфологическая особенность должна быть принята только как реальные, если она видна в "последний" СКС, а также в отбеленная из них.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить Manuela Будак, Лилиана Marinkovi и Кристина Wullimann за отличную техническую помощь. Мы благодарим В. Маклин для обеспечения Plp-GFP мышей. TM при поддержке Института перспективных исследований (Technische Universität München), Немецкого Forschungsgemeinschaft (DFG; Sonderforschungsbereich SFB 596), в Александро-фон-Humboldt-фондом и Национальным агентством по финансированию («Bundesministerium für Bildung унд Forschung" ) в рамках ERA-Net Нейрон "iPSoALS" и "2-фотонных изображений". TM MB и поддерживается Центром Integrated Science белка (Мюнхен). PM при поддержке Высшей школы Technische Universität München (TUM-GS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70% (vol/vol) ethanol solution | Roth | T913.1 | in spray bottle |
| isoflurane | Forene, Abbott | any other approved anaesthetic can be used for lethal anaesthesia | |
| transgenic mice (Plp-GFP) | to be obtained from cited sources | ||
| dissection microscope with cold-light illumination | Olympus SZ51 | equipped with Schott KL 1500 LCD | |
| forceps #2 | Fine Science Tools | 11233-20 | |
| forceps #5 | Fine Science Tools | 11295-00 | |
| scissors, large medical | Fine Science Tools | 14108-09 | |
| scissors, small angled spring | Fine Science Tools | 15033-09 | |
| in-line heater | Warner Instruments | SF-28 | |
| heating ring for 3.5-cm dishes | Warner Instruments | 64-0110 DH-35 | |
| two channel temperature control system | Warner Instruments | TC-344B | |
| superfusion pump system | custom-built | ||
| 15-cm tissue culture dish | Sarstedt | 83.1803.003 | filled with ice and covered by metal plate |
| 10-cm tissue culture dish | Sarstedt | 83.1802.003 | with oxygenated Ringer's solution |
| 3.5-cm tissue culture dish | Sarstedt | 83.1800.003 | filled with Sylgard polymer |
| Sylgard polymer | Dow Corning | Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | |
| confocal microscope | Olympus | FV1000 | with argon laser |
| 50-ml reaction tube | Sarstedt | 62.547.254 PP | |
| 4% PFA in PBS | Sigma | P6148 | |
| cannula 0.5 mm x 25 mm | Neolab | E-1510 | |
| syringe 1 ml | Neolab | E-1496 | |
| synaptophysin antibody | Invitrogen | 18-0130 | rabbit |
| secondary antibody | Invitrogen | A-11012 | Alexa 594 |
| 24-well plate | Sarstedt | 83.1836 | |
| 0.01 M PBS | Sigma | P4417 | |
| 0.1 M glycine in PBS | Roth | 3790.1 | |
| coverslips | Neolab | E-4132 | |
| slides | Neolab | E-4121 | |
| Vectashield | Vector labs | H-1000 | |
| minutien pins ×10 | Fine Science Tools | 26002-20 | shortened to < 4 mm |
| α-Bungarotoxin coupled to Alexa 594 | Invitrogen (Molecular Probes) | B-13423 | |
| Blocking Solution | |||
| 0.01 M PBS | |||
| 0.2% Triton-X100 | Roth | 3051.3 | |
| 10% Normal Goat Serum | Abcam | ab7481 | |
| 1% bovine serum albumin | Sigma | A7030 | |
| Ringer bubbled with 95% O2 /5% CO2 |
|||
| 125 mM NaCl | Sigma | S7653 | |
| 2.5 mM KCl | Sigma | P9333 | |
| 1.25 mM NaH2PO4 | Sigma | S8282 | |
| 26 mM NaHCO3 | Sigma | S6297 | |
| 2 mM CaCl2 | Sigma | 21114 | |
| 1 mM MgCl2 | Sigma | 63020 | |
| 20 mM glucose | Sigma | G7528 | |
Table 1. Specific reagents and equipments. |
|||
References
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Mallon, B. S., Shick, H. E., Kidd, G. J., Macklin, W. B. Proteolipid promoter activity distinguishes two populations of NG2-positive cells throughout neonatal cortical development. J. Neurosci. 22, 876-885 (2002).
- Brill, M. S., Lichtman, J. W., Thompson, W., Zuo, Y., Misgeld, T. Spatial constraints dictate glial territories at murine neuromuscular junctions. The Journal of cell biology. 195, 293-305 (2011).
- Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450, 56-62 (2007).
- Thompson, W. J., et al. Transgenic mice with photoswitchable GFP in Schwann cells. Society for Neuroscience. Program 241, (2008).
- Williams, P. R., et al. In vivo development of outer retinal synapses in the absence of glial contact. J. Neurosci. 30, 11951-11961 (2010).
- Kerschensteiner, M., Reuter, M. S., Lichtman, J. W., Misgeld, T. Ex vivo imaging of motor axon dynamics in murine triangularis sterni explants. Nat. Protoc. 3, 1645-1653 (2008).
- McArdle, J. J., et al. Advantages of the triangularis sterni muscle of the mouse for investigations of synaptic phenomena. J. Neurosci. Methods. 4, 109-115 (1981).
- Marinkovi, P., et al. Axonal transport deficits and degeneration can evolve independently in mouse models of amyotrophic lateral sclerosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 4296-4301 (2012).
- Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans Image Process. 7, 27-41 (1998).
- Brill, M. S., Lichtman, J. W., Thompson, W., Zuo, Y., Misgeld, T. Spatial constraints dictate glial territories at murine neuromuscular junctions. The Journal of cell biology. 195, 293-305 (2011).
- Zuo, Y., et al. Fluorescent proteins expressed in mouse transgenic lines mark subsets of glia, neurons, macrophages, and dendritic cells for vital examination. J. Neurosci. 24, 10999-11009 (2004).
