Summary
Visualizando as células individuais em tecidos densamente compactados, tais como as células de Schwann terminais (SCs) em junções neuromusculares (NMJs), é um desafio. "Sequential foto-branqueamento" permite delinear SCs terminais individuais, por exemplo, no explante triangularis músculo Sterni, uma preparação conveniente nervo-músculo, onde sequencial de branqueamento podem ser combinados com o lapso de tempo de imagem e
Abstract
Sequencial de foto-branqueamento fornece uma maneira não-invasiva para rotular SCs individuais no NMJ. O NMJ é a maior sinapse do sistema nervoso de mamíferos e serviu como guia modelo para estudar a estrutura e função sináptica. No rato NMJs terminais do motor axônio formar locais pretzel, como contato com as fibras musculares. O axônio motor e seu terminal são revestidos por SCs. Ao longo das últimas décadas, vários ratinhos transgénicos que foram gerados para visualizar os neurónios motores e SCS, por exemplo Thy1-XFP 1 e Plp-GFP ratos 2, respectivamente.
Junto axônios motores, myelinating SCs axonais são dispostos em não sobrepostos entrenós, separados por nós de Ranvier, para permitir a propagação saltatória potencial de ação. Em contraste, a SCS terminais na sinapse são especializados células gliais, que monitoram e promover a neurotransmissão, digerir os detritos e os axônios guia de regeneração. NMJs estão bem cobertos em até meia dúzia de não-mielinating SCs terminais - estes, no entanto, não podem ser resolvidas individualmente por microscopia de luz, uma vez que estão em contacto directo membrana 3.
Diversas abordagens existem para visualizar individualmente SCs terminais. Nenhum destes são impecáveis, embora. Por exemplo, o corante de enchimento, em que as células individuais são empalado com um microeléctrodo de corante-cheia, requer a destruição de uma célula marcada antes do enchimento de um segundo. Esta não é compatível com subseqüentes lapso de tempo gravações 3. Multi-espectral "Brainbow" rotulagem de SCs foi conseguido usando a expressão combinatória de proteínas fluorescentes 4. No entanto, esta técnica requer que combina diversos transgenes e está limitado por o padrão de expressão dos promotores utilizados. No futuro, a expressão de "photo-comutável" proteínas em SC pode ser ainda mais 5 alternativa. Aqui apresenta-se foto-branqueamento sequencial, em que as células individuais são branqueados, e sua imagem obtida por subtracção. Acreditamosque esta abordagem - devido à sua facilidade e versatilidade - representa uma adição duradoura para a paleta neurocientista da tecnologia, especialmente no que pode ser utilizado in vivo e transferido para outros tipos de células, os locais anatómicos e espécies 6.
No protocolo a seguir, detalhes que a aplicação de branqueamento e seqüencial subseqüente microscopia confocal lapso de tempo para SCs terminais em explantes musculares triangularis Sterni. Esta fina, superficial e facilmente dissecados preparação nervo-músculo 7,8 tem se mostrado útil para estudos de NMJ desenvolvimento, fisiologia e patologia 9. Finalmente, vamos explicar como o músculo Sterni triangularis está preparado para executar após a fixação correlacionada de alta resolução de imagem confocal, imunohistoquímica ou exames ultra-estruturais.
Protocol
1. Triangularis Sterni explante (Figura 1)
Cronograma: 15 min.
- Prepare instrumentos cirúrgicos: 2 pares de fórceps, um par de tesouras, 1 par de tesouras de primavera, um prato de cultura de tecido (10 cm). Previamente borbulhado (mínimo de 15 min) arrefecida (4 ° C) solução de Ringer com 5% CO 2/95% O 2. Preencha 15 cm prato de cultura de tecidos com gelo e cubra-o com placa de metal. Prepare microscópio de dissecção e colocar o prato de 15 cm com gelo sob o escopo de dissecação, de modo a arrefecer o explante durante o esvaziamento.
- Letalmente anestesiar o rato por overdose de isoflurano (ou qualquer outro método aprovado de sacrifício). Pulverizar o rato com etanol a 70% para evitar a contaminação da pele do explante. SC para branqueamento, é usado Plp-GFP ratos, que podem ser atravessados para Thy1-OFP3 ou Thy1-Membow13 para a visualização simultânea do axon.
- Utilizando o par de tesouras grandes, fazer uma incisão na linha média doda pele sobre o esterno e duas incisões paralelas à aresta inferior da caixa torácica.
- Utilizando o par de tesouras grandes, remover a pele, abre a parede abdominal e fazer incisões paralela à caixa torácica todo o caminho de volta para a coluna vertebral. Então dissecar fora os músculos peitorais, fazendo incisões próximas à inserção do músculo no esterno.
- Corte o diafragma aberto logo abaixo da cartilagem xifóide e dissecar fora do diafragma ao longo de suas inserções costais.
- Segurando a caixa torácica pelo processo xifóide com um conjunto de pinças, iniciar o corte das nervuras da coluna vertebral, tão próximo quanto possível das suas inserções. Os cortes de esquerda e direita devem convergir acima do coração em direção ao manúbrio. Tente evitar o corte de grandes vasos sanguíneos (especialmente as veias subclávia). Melhor visibilidade é conseguida levantando com cuidado a preparação ao sustentar o processo xifóide com uma pinça.
- Fazer um corte transversal imediatamente abaixo da manúbrioe transferir o explante no prato de 10 cm com 5% de CO refrigerado 2/95% O 2-borbulhado solução de Ringer. Coloque o recipiente de 10 cm sobre a placa de metal cobrindo a 15 cm de placa de cultura de tecido cheio de gelo. Todas as outras etapas deve ser feita sob o microscópio de dissecação.
- Com uma tesoura pequena mola remover os restos do timo, pleura, diafragma (dentro) e músculos peitorais (fora; Figura 1B-D).
- Para ajustar o explante para o prato de 3,5 cm, dissecar fora todas as costelas que não inserir o esterno. Isto é feito melhor com uma tesoura pequena mola e cortando o tecido entre as costelas (Figura 1E).
- Pin o triangularis Sterni explante nervo-músculo no Sylgard revestido prato de cultura de 3,5 cm tecido utilizando pinos minutien (abreviado para <4 mm; Figura 1G). Dois pinos deve passar por cartilaginosos (branco) partes do esterno. Inserir, pelo menos, dois pinos através das nervuras, tanto do lado esquerdo e direito do thexplante e apontando para as partes mais suaves e cartilaginosos, evitando as costelas sob ou perto do músculo triangularis. Os mais pinos são utilizados, o melhor (que usam tipicamente 8-10). Como você fechar a preparação, certifique-se de que as costelas são um tanto espalhado, a fixação do músculo em uma posição um pouco esticado.
- Opcional: Visualize sítios sinápticos que contêm receptores de acetilcolina através da adição bungarotoxina acoplados a corantes Alexa (concentração de 0,8 ug / ml em 5% CO 2/95% O 2-borbulhado solução de Ringer). Incubar explante fixado em Sylgard prato revestido por 15-20 minutos à temperatura ambiente, em seguida, lavar várias vezes com 5% CO 2/95% O 2-borbulhado solução de Ringer.
2. SCs branquear e Microscopia Time-lapse Opcional (Figura 2)
Cronometragem: 30 - 45 min + opcional 1-5 horas, para a lapso de tempo.
- Transferência de 3,5 cm prato Sylgard revestido de uma sagacidade microscópio confocal equipadoh um laser de argônio (488 nm) e objectivos de água de imersão (4x, 0,13 NA; 20x, e 100x NA 0,5, 1,0 NA ou 60x, 0,9 NA).
- Opcional para lapso de tempo de microscopia: Inserção de 3,5 cm Sylgard revestido prato em anel de aquecimento, instalar o sistema superfusão e sonda de temperatura (Figura 2A). Certifique-se de que nenhum deles tocar o explante, a borda do prato ou do revestimento Sylgard. A amostra é aquecida a 33-35 ° C. Para SC branqueamento sem lapso de tempo, a temperatura ambiente é melhor, como células mostram uma dinâmica menos entre as etapas de branqueamento.
- Com um ar de 4x objetivo observar o padrão de inervação do músculo Sterni triangularis e encontrar banda placa motora triangularis Sterni. Mudar para 20x objetivo mergulhando de cone e começar a olhar para regiões superficiais dentro da banda de placa motora (costelas áreas sobrepostas são bons candidatos). Alterar objetivo de 100x ou 60x objetivo mergulhando-cone para verificar NMJs individuais. Ideal é um JNM que é coberto por vários SCs e está localizado muito superficially (Figura 2B). Se você executar lapso de tempo de imagem após o clareamento, selecionar até três NMJs que estão relativamente próximos entre si para aumentar o rendimento.
- Adquirir uma imagem confocal do NMJ antes de foto-branqueamento SCs individuais (Figura 2B). (Para imagem de resolução completa, por exemplo, em um microscópio Olympus FV1000, usar um 100x, 1,0 e 2,5 NA objectiva zoom, o que resulta em Nyquist de amostragem limitada de ~ 0,1 mM por pixel.)
- "Park" a 488 nm do laser de feixe centralmente sobre o núcleo de um SC usando potência máxima durante 5 segundos (em alternativa, um padrão de pesquisa eficiente de uma pequena região de interesse pode ser utilizado, tal como o "tornado scan" função em um microscópio Olympus; quando usamos um microscópio confocal, o laser é focado para os planos de imagem conjugadas-e, portanto, a 488 nm, com um objectivo de 1,0 NA, <0,5 um de diâmetro). Mude o foco na célula e juiz de branqueamento resultado. Se necessário, repita branqueamento etapa novamente até que os níveis GFP são reduzird para fundo níveis próximos. Adquira uma imagem após o clareamento (Figura 2C). É crítico para certificar-se que a região é branqueada fora de qualquer sobreposição entre as duas células - se há uma sobreposição, branqueamento em uma segunda célula serão óbvias.
- Repetir o passo anterior até que todas menos uma SC são branqueadas (Figura 2D-E). A última "crus" SC é adequado para microscopia confocal lapso de tempo. Reconstruir células individuais, por subtracção de imagens, por exemplo, utilizando software Photoshop, para delinear a morfologia única e SC território (Figura 2F). Esteja ciente de que subtraindo dois magos acrescenta ruído (por exemplo, importando-os no consecutivos "camadas" no Photoshop e, em seguida, definir o canal de cima para "diferença" no menu drop-down no topo da guia canais). Isso pode ser contornado usando o "despeckle" função nos canais antes de subtração e corte fora qualquer fundo que, obviamente, não se origina a partir dacélula branqueada. Para optimizar o contraste, pode ser necessário ajustar o brilho dos dois canais na "níveis" janela. A imagem resultante da célula branqueada é sobreposta na imagem original de uma sinapse, pseudo-colorida num tom único e tornada transparente para colorir o território da célula branqueada na imagem original (de fazer isto para todos branqueada e a última , células não branqueado a imagem mostrada na Figura 2F resultados).
- Opcional: Iniciar microscopia confocal lapso de tempo após o clareamento todos, mas uma SCs. Pegue uma imagem em intervalos fixos (por exemplo, a cada 5 minutos a 10). Uso como potência de laser pequeno quanto possível. Até 3 NMJs podem ser visualizados na mesma sessão.
- Faça um mapa dos NMJs tempo decorrido, tendo uma imagem em 100 vezes sem zoom, em seguida, imagens da região usando 20x e objetivos 4x (Figura 2G-I). Este "mapa" é necessário para encontrar NMJs seguintes imunohistoquímica de um músculo fixa.
- Para a imagemprocessamento, converter imagens individuais em projeções de intensidade máxima e salvar em formato TIFF. Misture todos os z-projetadas tempo de pontos em uma pilha e alinhar em xy, por exemplo, usando o plugin "stackreg" 10 em Fiji (um pacote com base no software livre ImageJ; Institutos Nacionais de Saúde).
3. Fixação e imuno-histoquímica (Figura 3)
Timing: Overnight.
- Transferir o explante num tubo de reacção de 50 ml contendo, pelo menos, 15 ml de 4% PFA removendo cuidadosamente os pinos. Pós-fixar a parede torácica anterior, contendo o músculo Sterni triangularis durante 1 hora em gelo. Enxaguar tecido fixado com glicina 0,1 M em PBS (para extinguir fixador residual e, consequentemente, reduzir o fundo) durante pelo menos 10 min. As amostras podem ser armazenadas a este ponto e processada mais tarde.
- Transferir para um explante fixo de 10 cm de placa de cultura de tecido revestido Sylgard cheio com 0,01 M de PBS. Cortar uma forma trapezoidal com uma side paralelo para o esterno e o outro através das transições osso-cartilagem - este contém o músculo triangularis na sua superfície. Remover costelas inferiores com uma horizontal (ou seja, trans-esternal) cortado, de modo que a extremidade caudal do músculo triangularis pode ser acessado livremente (Figura 3A-D).
- Inserir uma agulha hipodérmica como um pino para a parte superior do trapézio (Figura 3E). Use uma agulha hipodérmica ligada a uma seringa de 1 ml e uma pinça para remover o músculo triangularis na superfície suavemente agarrar um canto caudal do músculo e usando a agulha como um micro-escalpelo. Certifique-se de que os cortes são feitos paralelos ao plano da parede torácica. Uma vez que a parte caudal do músculo é libertado, se inserir uma nova agulha hipodérmica como um pino inferior ao músculo através da parede torácica - isto imobiliza a preparação e permite exercer um puxão suave sobre o músculo usando fórceps (Figura 3F). Como você está cortando tiss conjuntivoinserções ue, "casca" de distância do músculo do tórax. Corte anexo caudal última com uma tesoura de mola. Remover restos de navios de gordura e sangue, usando uma pinça. Tenha cuidado para não rasgar os nervos Nota:. Use diferentes conjuntos de ferramentas e pratos para trabalhar com tecido vivo e fixo.
- Iniciar imunohistoquímica (utilizando um protocolo normalizado), transferindo as amostras de tecido em solução de bloqueio durante 1 hora num agitador à temperatura ambiente. Menor volume possível de coloração é de 200 ul usando uma placa de 96 poços.
- Aplicar o anticorpo primário diluído em solução de bloqueio, 200 ul por poço, durante a noite a 4 ° C num agitador.
- Lavar com PBS 0,01 M, três vezes, durante 10 min.
- Aplicar o anticorpo secundário adequado durante 1-2 horas à temperatura ambiente, diluiu-se em solução de bloqueio.
- Lavar com PBS 0,01 M, três vezes, durante 10 min.
- Montar em anti-desbotamento meio (por exemplo Vectashield) e lamela.
- Colocar a lâmina na placa de metal magnético, ímã lugar no topoda amostra para achatar por algumas horas ou durante a noite a 4 ° C. Selo com unha polonês.
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Representative Results
Um exemplo de um explante Sterni triangularis pronto para o prato de imagem é mostrado na Figura 1G. Este explante é particularmente adequada para a imagiologia ex vivo NMJs como o músculo triangularis consiste apenas de algumas camadas de fibras musculares. Isto permite a obtenção de imagens de alta resolução a partir de explantes derivados de linhas de ratinhos transgénicos que realce ou SCs (PLP-GFP 2) e / ou (axónios Thy1-XFP 1). Factores críticos de imagens de alta qualidade incluem: (i) evitar tocar no músculo triangularis durante a preparação dos explantes para prevenir a lesão da fibra muscular, (ii) selecção de sinapses superficiais e plana para reduzir a profundidade associadas aberrações, (iii) não sobreaquecimento da amostra (> 37 ° C) e mantendo a amostra bem oxigenada, (iv) possivelmente parando a superfusão durante imagiologia para reduzir a dispersão ou a vibração, (v) colocando cuidadosamente tubagem de superfusão e sondas de temperatura para evitar tocar na amostra, assim como a keeping o lado inferior do prato e seco para impedir a dispersão, (vi) o equilíbrio global de branqueamento com evitar "garantia", a perda de sinal de fora do alvo SCs para maximizar o contraste. Espasmos musculares e fragmentação dos axônios são freqüentemente observadas fenômenos, se o explante está danificado e insalubre. Instabilidade dos resultados de preparação em projeções desfocadas de pilhas confocal. No entanto, uma vez que o descrito seqüencial de foto-branqueamento técnica funciona bem, revela a morfologia de SC único terminal em detalhe considerável (Figura 2F). A morfologia revelada de SCs único terminal pode ser bastante surpreendente e não é facilmente previsível antes de branqueamento. Além disso, o grau de mobilidade dentro da SC NMJ não pode ser revelada sem marcação das células individuais.
Seguindo microscopia vivo, o explante Sterni triangularis podem ser fixadas e coradas para qualquer marcador de interesse (Figura 3). Para isso, células vivas imaginadas pode ser rastreado através do CREA mapaTed antemão (Figura 2G-I) e digitalizado em alta resolução no tecido fixo. Métodos padrão para a imuno-histoquímica em geral podem ser usados - uma advertência aqui é o facto de que a penetração do anticorpo pode ser bastante limitada em axónios mielinizados e requer tempos de incubação muito longos de anticorpos. Mais uma vez, a escolha NMJs superficiais e remoção de resíduos de gordura do músculo fixa bem (sem arrancando os nervos) ajuda a evitar esta armadilha.
Figura 1. Triangularis Sterni preparação explante. (A) Para preparar o explante nervo-músculo triangularis é necessário dissecar a parede anterior do tórax completa do mouse (esquematicamente sobreposto a um mouse). (B) a parede torácica anterior logo após dissecção. (
s/ftp_upload/4460/4460fig3.jpg "/>
Figura 3. Dissecção do músculo Sterni fixo triangularis e imagem do NMJ fixo. (A) Fixo explante Sterni triangularis em PBS em placa de cultura de células revestidas com Sylgard. (BD) Corta realizada com tesoura de mola para isolar o músculo Sterni triangularis. (EG) Fixando pedaço de explante contendo muscular Sterni triangularis e remoção de músculo de superfície. (H, I) vista fixo do NMJ muito que foi visualizado na Figura 2. A coloração para os receptores de acetilcolina com bungarotoxina acoplados a Alexa 647 (vermelho) e de vesículas sinápticas com um anticorpo anti-sinaptofisina (branco). Clique aqui para ver maior figura .
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Discussion
O método aqui apresentado SC branqueamento é simples, rápido e versátil: (i) permite revelar a morfologia única e SC dinâmica por meio de microscopia confocal baseado num único transgene - o que é uma vantagem significativa quando se combina a abordagem por exemplo, com modelos de doenças que necessitam de alelos adicionais . (Ii) O método é rápido, a partir de dissecação para a fixação pode ser realizada em meio dia. (Iii) O número de aplicações é vasto, uma vez que pode ser combinado com outros métodos, tais como a ablação de células, organelos de imagem, ou imunohistoquímicos electrofisiologia. Além disso, a abordagem aqui apresentada para SCs em NMJs murinos pode ser generalizado a outras células, tecidos ou espécies - um exemplo de uma aplicação de uma técnica relacionada no peixe-zebra é apresentada na referência 6. Além disso, além de outras proteínas fluorescentes GFP pode ser utilizado para o branqueamento e microscopia lapso de tempo, por exemplo, YFP ou PCP. Apesar de não ter usado essas proteínas fluorescentes em SCs, bleaching de axônios mostra que uma proteína menos estável fluorescente (por exemplo, CFP) nesta configuração pode ser vantajosa. No entanto, um compromisso entre a imagiologia de branqueamento eficiente e estável tem de ser encontrado, de acordo com os resultados desejados (por exemplo, contra uma única imagem de lapso de tempo dos restantes un-branqueadas células).
Há um certo número de limitações da técnica, no entanto. Um refere-se à utilização de um explantado muscular (e, portanto, sujeito a axotomia), o que limita o período de criação de imagens. Em estudos anteriores, verificou-se que - dependendo da questão em estudo - o explante Sterni triangularis pode ser utilizada para um máximo de 3-6 horas. Ainda assim, sequencial de foto-branqueamento pode ser utilizado in vivo, superar esta limitação desde que a amostra pode ser suficientemente estabilizado para obtenção de imagens que podem ser subtraídos. Dois outros aspectos precisam ser mantidos em mente, ao analisar os dados resultantes da abordagem sequencial de branqueamento: (i) Fototoxicidade poderia alterar dinamismo SC, como kIlling resultados de um terminal SC em rápida expansão de seus 11 vizinhos. Assim, verificações de plausibilidade deve ser incluído, por exemplo, medir a soma de expansões e retrações em uma sinapse estável. Em média, a população de SCs imaginadas não devem crescer significativamente ou encolher. (Ii) A morfologia de todos, mas o SC última é obtida por subtracção da imagem. A qualidade de uma tal imagem depende do contraste obtido branqueamento. Isto é geralmente conseguida mais facilmente em linhas brilhantes de rato. Por exemplo, Plp-GFP funciona melhor do que a GFP S100-12. Imagem de subtração acrescenta ruído, de modo que os SCs últimos geralmente é revelada com mais detalhes do que os outros (especialmente, também, como post-hoc de imagem após a fixação permite a utilização de alta do petróleo objetivos numéricos de abertura). Assim, uma característica morfológica só deve ser aceito como verdadeiro, se é visível em "últimos" SCs, bem como aqueles em branqueada.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer a Manuela Budak, Ljiljana Marinkovi e Kristina Wullimann para assistência técnica excelente. Agradecemos W. Macklin para fornecer Plp GFP-ratos. TM é apoiada pelo Instituto de Estudos Avançados (Technische Universität München), pelo Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG; Sonderforschungsbereich SFB 596), pelo Alexander-von-Humboldt-Foundation e pela agência de fomento nacional ("für Bildung und Bundesministerium Forschung" ) no quadro da ERA-NET neurônio "iPSoALS" e "imagem dois fótons". TM e MB são suportados pelo Centro de Ciência Proteína Integrado (Munique). PM foi apoiado pela Escola de Pós-Graduação da Technische Universität München (TUM-GS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70% (vol/vol) ethanol solution | Roth | T913.1 | in spray bottle |
| isoflurane | Forene, Abbott | any other approved anaesthetic can be used for lethal anaesthesia | |
| transgenic mice (Plp-GFP) | to be obtained from cited sources | ||
| dissection microscope with cold-light illumination | Olympus SZ51 | equipped with Schott KL 1500 LCD | |
| forceps #2 | Fine Science Tools | 11233-20 | |
| forceps #5 | Fine Science Tools | 11295-00 | |
| scissors, large medical | Fine Science Tools | 14108-09 | |
| scissors, small angled spring | Fine Science Tools | 15033-09 | |
| in-line heater | Warner Instruments | SF-28 | |
| heating ring for 3.5-cm dishes | Warner Instruments | 64-0110 DH-35 | |
| two channel temperature control system | Warner Instruments | TC-344B | |
| superfusion pump system | custom-built | ||
| 15-cm tissue culture dish | Sarstedt | 83.1803.003 | filled with ice and covered by metal plate |
| 10-cm tissue culture dish | Sarstedt | 83.1802.003 | with oxygenated Ringer's solution |
| 3.5-cm tissue culture dish | Sarstedt | 83.1800.003 | filled with Sylgard polymer |
| Sylgard polymer | Dow Corning | Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | |
| confocal microscope | Olympus | FV1000 | with argon laser |
| 50-ml reaction tube | Sarstedt | 62.547.254 PP | |
| 4% PFA in PBS | Sigma | P6148 | |
| cannula 0.5 mm x 25 mm | Neolab | E-1510 | |
| syringe 1 ml | Neolab | E-1496 | |
| synaptophysin antibody | Invitrogen | 18-0130 | rabbit |
| secondary antibody | Invitrogen | A-11012 | Alexa 594 |
| 24-well plate | Sarstedt | 83.1836 | |
| 0.01 M PBS | Sigma | P4417 | |
| 0.1 M glycine in PBS | Roth | 3790.1 | |
| coverslips | Neolab | E-4132 | |
| slides | Neolab | E-4121 | |
| Vectashield | Vector labs | H-1000 | |
| minutien pins ×10 | Fine Science Tools | 26002-20 | shortened to < 4 mm |
| α-Bungarotoxin coupled to Alexa 594 | Invitrogen (Molecular Probes) | B-13423 | |
| Blocking Solution | |||
| 0.01 M PBS | |||
| 0.2% Triton-X100 | Roth | 3051.3 | |
| 10% Normal Goat Serum | Abcam | ab7481 | |
| 1% bovine serum albumin | Sigma | A7030 | |
| Ringer bubbled with 95% O2 /5% CO2 |
|||
| 125 mM NaCl | Sigma | S7653 | |
| 2.5 mM KCl | Sigma | P9333 | |
| 1.25 mM NaH2PO4 | Sigma | S8282 | |
| 26 mM NaHCO3 | Sigma | S6297 | |
| 2 mM CaCl2 | Sigma | 21114 | |
| 1 mM MgCl2 | Sigma | 63020 | |
| 20 mM glucose | Sigma | G7528 | |
Table 1. Specific reagents and equipments. |
|||
References
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