Summary
Visualisera enskilda celler i tätt packade vävnader såsom terminal Schwann celler (SCS) vid neuromuskulär korsningar (NMJs), är en utmaning. "Sekventiell fotoblekningsreaktion" tillåter avgränsar enda terminal SCS, till exempel i triangularis sterni muskel explantation, en bekväm nerv-muskel preparat, där sekventiell blekning kan kombineras med time-lapse avbildning och
Abstract
Sekventiell fotoblekningsreaktion ger en icke-invasiv metod för att märka enskilda kaster på NMJ. Den NMJ är den största synapsen av nervsystemet hos däggdjur och har fungerat som vägledande modell för att studera synaptisk struktur och funktion. I mus NMJs motor axon terminaler bildar kringla-liknande kontakt webbplatser med muskelfibrer. Motorn axon och dess terminal mantlade av SC. Under de senaste decennierna har flera transgena möss genererats att visualisera motoriska nervceller och SCS, till exempel Thy1-XFP 1 och PLP-GFP möss 2, respektive.
Längs motor axoner är myeliniserande axonala kaster arrangerade i icke-överlappande internoder, åtskilda av noder av Ranvier att möjliggöra saltatorisk förökning aktionspotential. Däremot terminal kaster i synapsen är specialiserade gliaceller, som övervakar och främjar neurotransmission, smälta skräp och guide regenererande axoner. NMJs är tätt täckt av upp till ett halvdussin icke-LFöPLsprung terminal SCS - dessa kan dock inte vara individuellt lösas genom ljusmikroskop, som de är i direkt membran kontakt 3.
Flera tillvägagångssätt existerar för att individuellt visualisera terminala SC. Ingen av dessa är felfri, dock. Till exempel kräver färg fyllning där enskilda celler spetsad med ett färgämne fylld mikroelektrod, förstöra en märkt cell innan du fyller en andra. Detta är inte förenligt med efterföljande tid-lapse inspelning 3. Multispektralt "Brainbow" märkning av SCS har uppnåtts genom att använda kombinatorisk expression av fluorescerande proteiner 4. Emellertid kräver denna teknik att kombinera flera transgener och begränsas av uttrycksmönstret av de använda promotorerna. I framtiden kan uttryck av "foto-omkopplingsbar" proteiner i kaster vara ytterligare ett alternativ 5. Här presenterar vi sekventiell fotoblekningsreaktion där enskilda celler bleks och deras image som erhålls genom subtraktion. Vi troratt detta tillvägagångssätt - på grund av dess lätthet och mångsidighet - representerar en varaktig tillägg till neuroscientist teknik palett, särskilt som det kan användas in vivo och överförs till andra celltyper, anatomiska platser eller arter 6.
I följande protokoll, detalj vi tillämpningen av sekventiella blekning och efterföljande konfokal tidsförlopp mikroskopi till plint kaster i triangularis sterni muskel explantat. Denna tunna, ytliga och lätt dissekeras nerv-muskel preparat 7,8 har visat sig användbar för studier av NMJ utveckling, fysiologi och patologi 9. Slutligen förklarar vi hur den triangularis sterni muskeln är beredd efter fixering att utföra korrelerade med hög upplösning konfokal avbildning, immunohistokemi eller ultrastrukturella undersökningar.
Protocol
1. Triangularis Sterni explantation (figur 1)
Timing: 15 min.
- Förbered kirurgiska instrument: 2 par av tång, 1 sax, 1 par våren sax, 1 vävnadsodlingsplatta (10-cm). Pre-bubblades (minimum för 15 minuter) kyld (4 ° C) Ringers lösning med 5% CO 2/95% O 2. Fyll 15-cm skål vävnadskultur med is och täck den med metallplatta. Förbered dissekering mikroskop och placera 15-cm skål med is under dissektion omfattning för att kyla explantatet under dissektion.
- Dödligt söva musen genom isofluran överdos (eller någon annan godkänd metod för offer). Spraya musen med 70% etanol för att förhindra päls kontaminering av explantatet. För SC blekning använde vi PLP-GFP möss, som kan korsas till Thy1-OFP3 eller Thy1-Membow13 för samtidig visualisering av axonet.
- Använda par stora saxar, göra en mittlinjeincision avhuden över bröstbenet och två snitt parallellt till den nedre kanten av bröstkorgen.
- Använda par stora saxar, ta bort huden, öppna bukväggen och göra snitt parallellt med bröstkorgen hela vägen tillbaka till ryggraden. Sedan dissekera utanför bröstmusklerna genom att snitt nära muskeln insättning på bröstbenet.
- Skär membranet öppen nedanför xiphoid brosk och dissekera bort membranet längs kustområden infogningar.
- Håll bröstkorgen genom xiphoid process med en uppsättning tång, börja skära revbenen från ryggraden, så nära som möjligt till sina infogningar. Vänster och höger nedskärningar bör konvergera ovanför hjärtat mot manubrium sterni. Försök att undvika att skära stora blodkärl (särskilt subclavia venerna). Bättre sikt uppnås genom att försiktigt lyfta beredningen medan du håller på xiphoid processen med pincett.
- Gör en tvärgående snitt strax under manubrium sternioch överföra explantatet i 10-cm skål med kyld 5% koldioxid 2/95% O 2-bubblades Ringers lösning. Placera 10-cm skål på metallplattan täcker 15-cm skål vävnadskultur fylld med is. Alla ytterligare åtgärder bör göras under dissektion mikroskop.
- Med små våren sax bort resterna av tymus, lungsäcken, membranet (inuti) och bröstmusklerna (utanför, figur 1B-D).
- Att passa explantatet till 3,5-cm skål, dissekera av alla revbenen som inte inlägget i bröstbenet. Detta görs bäst med små våren sax och skära vävnaden i mellan ribborna (figur 1E).
- Nåla fast triangularis sterni nerv-muskel explantat i Sylgard belagda 3,5-cm vävnadsodlingsplatta med minutien stift (förkortas till <4 mm, figur 1G). Två stift ska gå igenom brosk (vit) delar av bröstbenet. Infoga minst två stift genom revbenen både på vänster och höger sida av the explantation siktar på de mjukare broskartade delarna och undvika revbenen under eller nära triangularis muskeln. Ju fler stift används, desto bättre (vi vanligtvis använder 8-10). När du sätta fingret beredningen, se till att revbenen är något spridda, fastställande av muskeln i en något utsträckt läge.
- Valfritt: Visualisera synaptiska platser innehållande acetylkolinreceptorer genom att lägga bungarotoxin kopplad till Alexa-färgämnen (koncentration av 0,8 pg / ml i 5% CO 2/95% O 2-bubblades Ringers lösning). Inkubera nålas explantat i Sylgard belagd skål i 15-20 min vid rumstemperatur och tvätta därefter flera gånger med 5% CO 2/95% O 2-bubblades Ringers lösning.
2. Blekning SC och tillval Time-lapse mikroskopi (Figur 2)
Timing: 30 - 45 min + extra 1 till 5 h för tidsförloppet.
- Överför 3,5-cm Sylgard-belagd maträtt till en konfokalmikroskop utrustad with en argonlaser (488 nm våglängd) och vatten mål nedsänkning (4x, 0,13 NA, 20x, 0,5 NA och 100x, 1,0 NA eller 60x, 0,9 NA).
- Valfri för time-lapse mikroskopi: Sätt 3,5-cm Sylgard-belagd maträtt till värme ring, installera superfusion system och temperatursond (Figur 2A). Se till att ingen av dem röra explantatet, kanten av skålen eller Sylgard beläggningen. Upphetta provet till 33-35 ° C. För SC blekning utan tidsförlopp, är rumstemperatur bättre, eftersom cellerna visa färre dynamik mellan blekningssteg.
- Med en 4x luft mål observera innervation mönster av triangularis sterni muskler och hitta triangularis sterni gavel bandet. Växla till 20x doppa kon mål och börja leta efter ytliga regioner inom ändskivans bandet (områden överliggande revben är bra kandidater). Ändra mål till 100x eller 60x doppa kon målet att kontrollera enskilda NMJs. Ideal är en NMJ som omfattas av flera kaster och ligger mycket superficially (Figur 2B). Om du utför time-lapse avbildning efter blekning, välja upp till 3 NMJs som är relativt nära varandra för att öka avkastningen.
- Skaffa en konfokal bild av NMJ före fotoblekningsreaktion enskilda SCS (Figur 2B). (För fullständig upplösning avbildning, t.ex. på en Olympus FV1000 mikroskop, använd en 100x, 1,0 NA objektiv och 2,5 zoom, vilket resulterar i Nyquist-begränsad provtagning av ~ 0,1 nm per pixel.)
- "Park" den 488 nm laserstrålen centralt på kärnan av ett SC använder maximal effekt under 5 sekunder (alternativt en effektiv avsökningsmönster i en liten region av intresse kan användas, såsom "tornado scan"-funktion på ett Olympus mikroskop; som vi använder ett konfokalt mikroskop, är lasern fokuseras in i bild-konjugatet plan och därmed vid 488 nm med ett mål av 1,0 NA, <0,5 | im i diameter). Rikta in sig på cellen och domare blekning resultat. Om nödvändigt upprepa blekningssteg igen tills GFP nivåer minskard till nästan bakgrundsnivåerna. Förvärva en bild efter blekning (figur 2C). Det är viktigt att se till att den blekta regionen är utanför någon överlappning mellan två celler - om det finns överlappning, kommer blekning i en andra cell vara uppenbart.
- Upprepa steg ovan tills alla utom en SC bleks (figur 2D-E). Den sista "oblekta" SC är lämplig för konfokal time-lapse mikroskopi. Rekonstruera enstaka celler genom subtraktion av bilder, t.ex. med Photoshop programvara, att avgränsa enda SC-morfologi och territorium (figur 2F). Var medveten om att subtrahera två magiker ger buller (t.ex. genom att importera dem i rad "lager" i Photoshop och sedan sätta den övre kanal "skillnad" i rullgardinsmenyn längst upp i kanaler fliken). Detta kan kringgås genom att använda "Ta bort fläckar" funktionen på kanalerna innan subtraktion och beskärning bort någon bakgrund som uppenbarligen inte kommer frånblekt cellen. För att optimera kontrast, kan det vara nödvändigt att justera ljusstyrkan av de två kanalerna i "nivåer" fönstret. Den resulterande bilden av den blekta cellen är den överlagrade på den ursprungliga bilden av en synaps, pseudo-färgat i en unik färgton och gjort transparent för färga territorium blekt cellen i den ursprungliga bilden (från att göra detta för alla blekt och den sista , oblekta celler bilden som visas i figur 2F resultat).
- Tillval: Start konfokal time-lapse mikroskopi efter blekning alla utom en SCS. Ta en bild med fasta intervall (till exempel var 5 till 10 minuter). Använda så lite lasereffekt som möjligt. Upp till 3 NMJs kan avbildas på samma session.
- Gör en karta över tid löpt NMJs genom att ta en bild med 100x utan zoom, så bilderna i regionen med hjälp av 20x och 4x mål (figur 2G-I). Detta "karta" behövs för att hitta NMJs efter immunohistokemi av en fast muskel.
- För bildbearbetning, konvertera enskilda bilder till maximal intensitet prognoser och spara i TIFF-format. Kombinera alla z-beräknade tidpunkter i en stapel och rikta in xy, t.ex. med hjälp av "stackreg" plugin 10 i Fiji (ett paket baserad på öppen källkod ImageJ, National Institutes of Health).
3. Fixering och Immunohistokemi (figur 3)
Timing: Övernattning.
- Överför explantatet i en 50-ml reaktionsrör innehållande minst 15 ml 4% PFA genom att försiktigt avlägsna stiften. Efter positionsbestämningen den främre bröstkorg vägg innehåller triangularis sterni muskeln för 1 timme på is. Skölj fast vävnad med 0,1 M glycin i PBS (för att släcka resterande fixativ och därmed minska bakgrunden) i minst 10 minuter. Prover kan lagras vid denna punkt och behandlas senare.
- Överför fast explantat till en 10-cm Sylgard belagd vävnadsodlingsskål fylld med 0,01 M PBS. Skär ut en trapetsoid form med en side parallellt med bröstbenet och andra genom benet till brosk övergångar - det innehåller triangularis muskeln på dess yta. Ta nedre revbenen med en horisontell (dvs trans-sternala) klippas så att den kaudala änden av triangularis muskeln fritt kan nås (Figur 3A-D).
- Sätt i en hypodermisk nål som en tapp i den övre delen av trapetsoiden (figur 3E). Använd en injektionsnål fäst vid en 1 ml spruta och pincett för att avlägsna triangularis muskeln på ytan genom att försiktigt hålla på en kaudal hörn av muskeln och använda nålen som en mikro-skalpell. Kontrollera att snitt görs parallellt med planet av bröst väggen. När kaudala delen av muskeln släpps in ytterligare injektionsnål som ett stift under muskeln genom bröstkorg väggen - detta immobiliserar beredningen och tillåter utövar en mild dragning i muskeln med pincett (Figur 3F). När du skär bindväv Tissue infogningar, "skal" bort muskeln från bröstkorgen. Skär Senast caudal infästning med våren sax. Ta bort fett och blodkärl rester med pincett. Var noga med att inte slita bort nerverna Anmärkning:. Använd separata uppsättningar av verktyg och rätter för att arbeta med levande och fast vävnad.
- Starta immunohistokemi (användning av ett standardprotokoll) genom att överföra vävnadsprover till blockeringslösning under 1 timme på en skakapparat vid rumstemperatur. Minsta möjliga volym för färgning är 200 pl med användning av en 96-brunnars platta.
- Applicera primär antikropp utspädd i blockeringslösning, 200 | il per brunn, över natten vid 4 ° C på en skakapparat.
- Tvätta i 0,01 M PBS tre gånger under 10 min.
- Applicera lämplig sekundär antikropp under 1-2 timmar vid rumstemperatur utspädd i blockeringslösning.
- Tvätta i 0,01 M PBS tre gånger under 10 min.
- Montera i anti-fading medium (t.ex. Vectashield) och täckglas.
- Placera objektglaset på magnetisk metallplatta, placera magneten på toppenav provet att platta under några timmar eller över natten vid 4 ° C. Täta med nagellack.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ett exempel på en triangularis sterni explantat redo för avbildning skålen visas i figur 1G. Denna explantat är särskilt lämplig för avbildning NMJs ex vivo som triangularis muskeln består endast av ett fåtal skikt av muskelfibrer. Detta möjliggör erhållande högupplösta bilder från explantat härledda från transgena muslinjer som framhäver antingen SC (PLP-GFP 2) och / eller axoner (Thy1-XFP 1). Kritiska faktorer för hög bildkvalitet är: (i) att undvika att vidröra triangularis muskeln under explantat förberedelser för att förhindra skador muskelfiber, (ii) val av ytliga och platta synapser att minska djupet-associerade avvikelser, (iii) inte överhettas provet (> 37 ° C) och hålla provet syresatt väl, (iv) eventuellt stoppa superfusion under avbildning för att minska avdriften eller vibrationer, (v) försiktigt placera superfusion slangar och sonder temperatur för att undvika att röra provet, liksom keeping undersidan av skålen torka för att förhindra avdrift, (vi) balansera omfattande blekning med att undvika "säkerhet" signalförlust i off-mål kaster att maximera kontrasten. Muskelryckningar och axon fragmentering ofta observeras fenomen, om explantatet är skadad och ohälsosamt. Instabilitet av preparatet leder suddiga projektioner av konfokala stackar. Men när den beskrivna sekventiella fotoblekningsreaktion tekniken fungerar bra, visar det morfologi enda terminal SC i detalj (figur 2F). Den visade morfologi enda terminal kaster kan vara ganska överraskande och inte lätt förutses före blekning. Dessutom kan graden av SC rörlighet inom NMJ inte utlämnas utan märkning enskilda celler.
Efter levande mikroskopi kan triangularis sterni explantatet fastställas och färgas för en markör av intresse (Figur 3). För detta levande avbildade celler kan spåras tillbaka med kartan creaTed förväg (Figur 2G-I) och skannas på hög upplösning i den fasta vävnaden. Generellt standardmetoder för immunhistokemi kan användas - en varning här är det faktum att antikroppar penetrering ganska kan begränsas i myeliniserade axoner och kräver mycket långa tider antikropp inkubationstider. Återigen väljer ytliga NMJs och ta bort fett rester från den fasta muskler väl (utan rippning av nerverna) hjälper till att undvika denna fallgrop.
Figur 1. Triangularis sterni explantat beredning. (A) För att förbereda triangularis nerv-muskel explantation är det nödvändigt att dissekera hela främre bröstkorg vägg musen (schematiskt ovanpå en mus). (B) Främre bröstkorg vägg strax efter dissekering. (
s/ftp_upload/4460/4460fig3.jpg "/>
Figur 3. Dissektion av den fasta triangularis sterni muskler och bild av fast NMJ. (A) Fast triangularis sterni explantatet i PBS i cellkultur skål täckt med Sylgard. (BD) Klipper utförs med våren sax för att isolera triangularis sterni muskler. (EG) fastlåsning av explantat pjäs innehåller triangularis sterni muskler och ta bort muskler från ytan. (H, I) Fast vy av mycket NMJ som avbildades i figur 2. Färgning för acetylkolinreceptorer med bungarotoxin kopplade till Alexa 647 (röd) och för synaptiska vesiklar med en anti-synaptofysin antikropp (vit). Klicka här för att se större bild .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
SC blekning metod som presenteras här är enkel, snabb och mångsidig: (i) Det gör att avslöja enda SC morfologi och dynamik genom konfokalmikroskopi baserad på en enda transgen - vilket är en betydande fördel vid kombination av tillvägagångssätt, t.ex. med sjukdomsmodeller som kräver ytterligare alleler . (Ii) Metoden är snabb, från dissekering till fixering kan utföras i en halv dag. (Iii) Antalet ansökningar är bred, eftersom den kan kombineras med andra metoder, såsom cell ablationer, organeller bildbehandling, elektrofysiologi eller immunohistokemi. Dessutom kan metoden som presenteras här för SCS på murina NMJs generaliseras till andra celler, vävnader eller arter - ett exempel på en tillämpning av en närstående teknik i zebrafisk presenteras i referens 6. Även andra fluorescerande proteiner förutom GFP kan användas för blekning och time lapse mikroskopi, t ex YFP eller GFP. Även om vi inte har använt dessa fluorescerande proteiner i kaster, bleaching axoner visar att en mindre stabil fluorescerande protein (t.ex. GFP) i denna inställning kan vara fördelaktigt. Emellertid har en kompromiss mellan effektiv blekning och stabil avbildning som finns, beroende på de önskade resultaten (t.ex. enstaka bild kontra tidsförlopp av de återstående icke-blekt celler).
Det finns ett antal begränsningar för tekniken, dock. Man avser användningen av en explanteras (och följaktligen axotomiserade) muskel, vilken begränsar den bildgivande perioden. I tidigare studier har vi funnit att - beroende på den fråga som studien - kan det triangularis sterni explantatet användas för maximalt 3-6 timmar. Ändå kan sekventiell fotoblekningsreaktion användas in vivo, övervinna denna begränsning under förutsättning att provet är tillräckligt kan stabiliseras för att erhålla bilder som kan dras av. Två ytterligare aspekter måste hållas i minnet vid analys data från den sekventiella blekning tillvägagångssätt: (i) Fototoxicitet kan förändra SC-dynamik, som kIlling en terminal SC resulterar i snabb expansion av dess grannar 11. Så rimlighetskontroller bör ingå, t.ex. mäta summan av expansioner och retraktioner i en stabil synaps. I genomsnitt bör befolkningen i avbildade kaster inte signifikant växa eller krympa. (Ii) morfologi av alla utom den sista SC erhålls genom subtraktion bilden. Kvaliteten på en sådan bild beroende på den erhållna blekning kontrasten. Detta uppnås i allmänhet lättare ljusare mus linjer. Till exempel arbetar PLP-GFP bättre än S100-GFP 12. Bild subtraktion tillägger buller, så de sista kaster generellt avslöjas närmare än de andra (särskilt också, som post-hoc avbildning efter fixering gör användning av höga numeriska mål bländarvärden olja). Därför bör en morfologisk egenskap endast accepteras som verkliga, om den är synlig i "sista" SCS, liksom i blekta sådana.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi vill tacka Manuela Budak, Ljiljana Marinkovi och Kristina Wullimann för utmärkt tekniskt stöd. Vi tackar W. Macklin för åstadkommande PLP-GFP möss. TM stöds av Institutet för avancerade studier (Technische Universität München), av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Sonderforschungsbereich SFB 596), av Alexander-von-Humboldt-stiftelsen och den nationella finansiär ("Bundesministerium für Bildung und Forschung" ) inom ramen för ERA-Net NEURON "iPSoALS" och "2-photon imaging". TM och MB stöds av Centrum för integrerad Protein Science (München). PM stöddes av Graduate School of Technische Universität München (TUM-GS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70% (vol/vol) ethanol solution | Roth | T913.1 | in spray bottle |
| isoflurane | Forene, Abbott | any other approved anaesthetic can be used for lethal anaesthesia | |
| transgenic mice (Plp-GFP) | to be obtained from cited sources | ||
| dissection microscope with cold-light illumination | Olympus SZ51 | equipped with Schott KL 1500 LCD | |
| forceps #2 | Fine Science Tools | 11233-20 | |
| forceps #5 | Fine Science Tools | 11295-00 | |
| scissors, large medical | Fine Science Tools | 14108-09 | |
| scissors, small angled spring | Fine Science Tools | 15033-09 | |
| in-line heater | Warner Instruments | SF-28 | |
| heating ring for 3.5-cm dishes | Warner Instruments | 64-0110 DH-35 | |
| two channel temperature control system | Warner Instruments | TC-344B | |
| superfusion pump system | custom-built | ||
| 15-cm tissue culture dish | Sarstedt | 83.1803.003 | filled with ice and covered by metal plate |
| 10-cm tissue culture dish | Sarstedt | 83.1802.003 | with oxygenated Ringer's solution |
| 3.5-cm tissue culture dish | Sarstedt | 83.1800.003 | filled with Sylgard polymer |
| Sylgard polymer | Dow Corning | Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | |
| confocal microscope | Olympus | FV1000 | with argon laser |
| 50-ml reaction tube | Sarstedt | 62.547.254 PP | |
| 4% PFA in PBS | Sigma | P6148 | |
| cannula 0.5 mm x 25 mm | Neolab | E-1510 | |
| syringe 1 ml | Neolab | E-1496 | |
| synaptophysin antibody | Invitrogen | 18-0130 | rabbit |
| secondary antibody | Invitrogen | A-11012 | Alexa 594 |
| 24-well plate | Sarstedt | 83.1836 | |
| 0.01 M PBS | Sigma | P4417 | |
| 0.1 M glycine in PBS | Roth | 3790.1 | |
| coverslips | Neolab | E-4132 | |
| slides | Neolab | E-4121 | |
| Vectashield | Vector labs | H-1000 | |
| minutien pins ×10 | Fine Science Tools | 26002-20 | shortened to < 4 mm |
| α-Bungarotoxin coupled to Alexa 594 | Invitrogen (Molecular Probes) | B-13423 | |
| Blocking Solution | |||
| 0.01 M PBS | |||
| 0.2% Triton-X100 | Roth | 3051.3 | |
| 10% Normal Goat Serum | Abcam | ab7481 | |
| 1% bovine serum albumin | Sigma | A7030 | |
| Ringer bubbled with 95% O2 /5% CO2 |
|||
| 125 mM NaCl | Sigma | S7653 | |
| 2.5 mM KCl | Sigma | P9333 | |
| 1.25 mM NaH2PO4 | Sigma | S8282 | |
| 26 mM NaHCO3 | Sigma | S6297 | |
| 2 mM CaCl2 | Sigma | 21114 | |
| 1 mM MgCl2 | Sigma | 63020 | |
| 20 mM glucose | Sigma | G7528 | |
Table 1. Specific reagents and equipments. |
|||
References
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Mallon, B. S., Shick, H. E., Kidd, G. J., Macklin, W. B. Proteolipid promoter activity distinguishes two populations of NG2-positive cells throughout neonatal cortical development. J. Neurosci. 22, 876-885 (2002).
- Brill, M. S., Lichtman, J. W., Thompson, W., Zuo, Y., Misgeld, T. Spatial constraints dictate glial territories at murine neuromuscular junctions. The Journal of cell biology. 195, 293-305 (2011).
- Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450, 56-62 (2007).
- Thompson, W. J., et al. Transgenic mice with photoswitchable GFP in Schwann cells. Society for Neuroscience. Program 241, (2008).
- Williams, P. R., et al. In vivo development of outer retinal synapses in the absence of glial contact. J. Neurosci. 30, 11951-11961 (2010).
- Kerschensteiner, M., Reuter, M. S., Lichtman, J. W., Misgeld, T. Ex vivo imaging of motor axon dynamics in murine triangularis sterni explants. Nat. Protoc. 3, 1645-1653 (2008).
- McArdle, J. J., et al. Advantages of the triangularis sterni muscle of the mouse for investigations of synaptic phenomena. J. Neurosci. Methods. 4, 109-115 (1981).
- Marinkovi, P., et al. Axonal transport deficits and degeneration can evolve independently in mouse models of amyotrophic lateral sclerosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 4296-4301 (2012).
- Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans Image Process. 7, 27-41 (1998).
- Brill, M. S., Lichtman, J. W., Thompson, W., Zuo, Y., Misgeld, T. Spatial constraints dictate glial territories at murine neuromuscular junctions. The Journal of cell biology. 195, 293-305 (2011).
- Zuo, Y., et al. Fluorescent proteins expressed in mouse transgenic lines mark subsets of glia, neurons, macrophages, and dendritic cells for vital examination. J. Neurosci. 24, 10999-11009 (2004).
