Summary
Visualisering individuelle celler i tætpakkede væv, såsom terminale Schwann-celler (SCS) i neuromuskulære junctions (NMJs), er udfordrende. "Sekventiel fotoblegende" tillader afgrænse enkelt terminal SCS, for eksempel i triangularis sterni muskel eksplantation, en bekvem nerve-muskel forberedelse, hvor sekventiel blegning kan kombineres med time-lapse imaging og
Abstract
Sekventiel fotoblegende giver en ikke-invasiv måde at mærke individuelle SCs på NMJ. Den NMJ er den største synapsen af det mammale nervesystem og har fungeret som ledende model til at studere synaptisk struktur og funktion. I muse NMJs motor axon terminaler i kringle-lignende kontakt sites med muskelfibre. Motoren axon og dens terminal er beklædt med SCs. I de sidste årtier er adskillige transgene mus blevet genereret at visualisere motorneuroner og SCS, for eksempel Thy1-XFP 1 og PLP-GFP-mus 2, hhv.
Langs motoriske axoner, er myelinerende axonale SCs anbragt i ikke-overlappende staengelled, adskilt af knudepunkter i Ranvier, så saltatory virkningspotentiale formering. I modsætning hertil er terminale SCs ved synapsen specialiserede gliaceller, der overvåger og fremme neurotransmission, fordøje debris og vejledning regenererende axoner. NMJs er tæt dækket med op til et halvt dusin ikke-myeldelse terminale SCs - disse imidlertid ikke individuelt løses ved lysmikroskopi, når de er i direkte kontakt med membranen 3.
Adskillige fremgangsmåder eksisterer til individuelt at visualisere terminale SCs. Ingen af disse er fejlfri, selv om. For eksempel kræver farvestof fyldning, hvis enkelte celler bliver spiddet med et farvestof fyldt mikroelektrode, ødelægger et mærket celle før fyldning af en anden. Dette er ikke foreneligt med efterfølgende tidsforskudte optagelser 3. Multispektral "Brainbow" mærkning af SCs er opnået ved hjælp af kombinatorisk ekspression af fluorescerende proteiner 4. Denne teknik kræver at kombinere flere transgener, og er begrænset af ekspressionsmønsteret af de anvendte promotorer. I fremtiden kan udtryk af "foto-omstillelige" proteiner i SCs være endnu et alternativ 5. Her præsenterer vi sekventiel fotoblegende, hvor enkelte celler bleges, og deres image fås ved subtraktion. Vi menerat denne tilgang - på grund af dens lethed og alsidighed - betegner en varig over neurolog teknologi paletten, især da den kan anvendes in vivo og overføres til andre celletyper, anatomiske steder eller arter 6.
I det følgende protokol, detalje vi anvendelsen af sekventielle blegning og efterfølgende konfokal time-lapse mikroskopi til terminal SCs i triangularis sterni muskel eksplantater. Denne tynde, overfladiske og nemt dissekeret nerve-muskel forberedelse 7,8 har vist sig anvendelige til undersøgelser af NMJ udvikling, fysiologi og sygdomslære 9. Endelig vil vi forklare hvordan den triangularis sterni musklen fremstilles efter fiksering at udføre korreleret høj opløsning konfokal billedbehandling, immunhistokemi eller ultrastrukturelle undersøgelser.
Protocol
1. Triangularis sterni Eksplantation (figur 1)
Timing: 15 min.
- Forbered kirurgiske instrumenter: 2 par pincet, 1 saks, 1 par af foråret saks, 1 vævsdyrkningsskål (10-cm). Pre-boblet (minimum i 15 min) afkølet (4 ° C) Ringers opløsning med 5% CO2 / 95% O2. Fyld 15-cm vævsdyrkningsskål med is og dække det med metalplade. Forberede dissektion mikroskop og anbring den 15-cm skål med is under dissektion anvendelsesområdet for at afkøle eksplantatet under dissektion.
- Letalt anesthetize musen ved isofluran overdosis (eller enhver anden godkendt metode til aflivning). Sprøjte mus med 70% ethanol for at forhindre pels kontaminering af eksplantatet. For SC blegning, brugte vi PLP-GFP-mus, som kan krydses til Thy1-OFP3 eller Thy1-Membow13 til samtidig visualisering af Axon.
- Ved hjælp af parret af store saks, foretage en midtlinjeincision forhuden over brystbenet og to indsnit er parallelle med den nedre kant af brystkassen.
- Brug par store saks, fjern skindet, skal du åbne bugvæggen, og gøre indsnit parallelt med brystkassen hele vejen tilbage til rygsøjlen. Derefter dissekere off brystmusklerne ved at gøre indsnit tæt på musklen insertion ved brystbenet.
- Skær membranen åben lige under formet som et sværd brusk og dissekere off membranen langs dens kystnære indrykninger.
- Hold brystkassen ved formet som et sværd proces med et sæt pincet, begynde at skære ribbenene fra rygsøjlen, så tæt som muligt på deres indrykninger. De venstre og højre nedskæringer bør konvergere over hjertet mod manubrium sterni. Prøv at undgå at skære store blodkar (især de subclavia vener). Bedre synlighed opnås ved forsigtigt at løfte forberedelse, mens du holder fast formet som et sværd proces med en pincet.
- Lav en tværgående snit lige under manubrium sterniog overføres eksplantatet til 10 cm skål med afkølet 5% CO2 / 95% O2-boblet Ringers opløsning. Placer 10 cm skål på metalpladen, der dækker 15 cm vævsdyrkningsskål fyldt med is. Alle yderligere skridt bør ske under dissektion mikroskop.
- Ved hjælp af små fjeder saks fjerne resterne af thymus, lungehinden membran (indvendig) og brystmuskler (uden for, Figur 1B-D).
- Til at passe eksplantatet til 3,5-cm skål, dissekere off alle ribberne, der ikke indsætte til brystbenet. Dette gøres bedst ved hjælp af små foråret saks og skære vævet i mellem ribbenene (Figur 1E).
- Nål triangularis sterni nerve-muskel eksplantat i Sylgard overtrukket 3,5 cm vævsdyrkningsskål ved hjælp minutien stifter (forkortet til <4 mm, figur 1G). To stifter skal gå igennem bruskagtige (hvid) dele af brystbenet. Indsæt mindst to tappe gennem ribbenene både på venstre og højre side af the explant sigter efter de blødere bruskagtige dele og undgå ribbenene under eller tæt på triangularis muskel. Jo flere ben der anvendes, desto bedre (vi bruger typisk 8-10). Som du pin ned forberedelse, så sørg for at ribberne er lidt spredt, fastsættelse af musklen ind i en lidt strakt position.
- Valgfrit: Visualiser synaptiske sites containing acetylcholinreceptorer ved tilsætning bungarotoxin koblet til Alexa-farvestoffer (koncentration på 0,8 ug / ml i 5% CO2 / 95% O2-boblet Ringers opløsning). Inkuber pinned eksplantat i Sylgard belagt skål i 15-20 minutter ved stuetemperatur og derefter vaskes flere gange med 5% CO2 / 95% O2-boblet Ringers opløsning.
2. Blegning SCS og valgfrie Time-lapse mikroskopi (figur 2)
Timing: 30 - 45 min + optional 1 - 5 timer for tidsforskydningen.
- Overførsel 3,5 cm Sylgard-belagte skål til et konfokalt mikroskop udstyret with en argon laser (488 nm bølgelængde) og nedsænkning i vand mål (4x, 0,13 NA, 20x, 0,5 NA og 100x, 1,0 NA eller 60x, 0,9 NA).
- Valgfri for time-lapse mikroskopi: Indsæt 3,5-cm Sylgard-belagt fad til varme ring, installere superfusionssystem og temperaturføler (figur 2A). Sørg for, at ingen af dem rører eksplantatet, kanten af skålen eller Sylgard belægning. Opvarmes prøven til 33 til 35 ° C. For SC blegning uden time-lapse, er stuetemperatur bedre, som celler vis færre dynamik mellem blegning trin.
- Med en 4x luft mål observere innervation mønster af triangularis sterni muskel og finde triangularis sterni endeplade band. Skift til 20x dyppe-kegle mål og begynde at lede efter overfladiske regioner i endepladen båndet (områder overliggende ribben er gode kandidater). Skift mål til 100x eller 60x dyppe-kegle målsætning om at kontrollere, om de enkelte NMJs. Ideal er en NMJ der er omfattet af flere SCs og ligger meget superficially (figur 2B). Hvis du udfører time-lapse imaging efter blegning, skal du vælge op til 3 NMJs der ligger relativt tæt sammen for at øge udbyttet.
- Erhverve et konfokalt billede af NMJ før fotoblegende individuelle SCS (figur 2B). (For fuld opløsning billeddannelse, fx på et Olympus FV1000 mikroskop, skal du bruge en 100x, 1,0 NA objektiv og 2,5 zoom, hvilket resulterer i Nyquist-begrænset prøvetagning af ~ 0,1 um per pixel.)
- "Parkerer" 488 nm laserstråle centralt på kernen af en SC hjælp af maksimale strøm i 5 sekunder (alternativt en effektiv skannemønster i en lille område af interesse, kan anvendes, såsom "tornado scan"-funktionen på et Olympus mikroskop; som vi bruger en konfokal mikroskop, er laseren fokuseret ind i image-konjugerede fly og dermed ved 488 nm med et mål på 1,0 NA, <0,5 um i diameter). Re-fokuserer på cellen og dommer blegning resultat. Om nødvendigt at gentage blegetrin igen indtil GFP-niveauer er at reducered til næsten baggrundsniveauer. Hente et billede efter blegning (figur 2C). Det er kritisk at sikre, at den blegede region ligger uden om overlapning mellem to celler - hvis der er overlapning, vil blegning i en anden celle være indlysende.
- Gentag trin ovenfor, indtil alle på nær en SC bleges (Figur 2D-E). Den sidste "ubleget" SC er velegnet til konfokal time-lapse mikroskopi. Rekonstruere enkelte celler ved subtraktion af billeder, ved brug af f.eks Photoshop-software, for at afgrænse enkelt SC morfologi og territorium (figur 2F). Vær opmærksom på at trække to magikere tilføjer støj (f.eks ved at importere dem i træk "lag" i Photoshop og derefter indstille den øverste kanal til "forskel" i drop down menuen øverst i kanalerne fane). Dette kan omgås ved at bruge "Pletfjerning" funktionen på de kanaler inden fradrag og beskæring væk enhver baggrund, der naturligvis ikke stammer frableget celle. For at optimere Derimod kan det være nødvendigt at justere lysstyrken af de to kanaler i "niveau" vinduet. Det resulterende billede af den blegede celle er overlejret på det originale billede af en synapse, pseudo-farvet i en unik nuance og gøres gennemsigtig at farve område blegede celle i det originale billede (i at gøre dette for alle bleget og den sidste , ubleget celler billedet vist i figur 2F resultater).
- Valgfrit: Start konfokal time-lapse mikroskopi efter blegning alle undtagen én SCs. Tage et billede med faste intervaller (for eksempel hver 5-10 minutter). Bruge så lidt lasereffekt som muligt. Op til 3 NMJs kan afbildes på den samme session.
- Lav et kort over de tidsforkortet NMJs ved at tage et billede på 100x uden zoom, så billederne i regionen ved hjælp af 20x og 4x mål (Figur 2G-I). Denne "kort", for at finde NMJs efter immunhistokemi af en fast muskel.
- For billedetforarbejdning, konvertere individuelle billeder til maksimumslysstyrke fremskrivninger og gemme i TIFF-format. Kombiner alle z-projekterede tid-point i en stak og justere i xy, fx ved hjælp af "stackreg" plugin 10 i Fiji (en pakke baseret på open source software ImageJ, National Institutes of Health).
3. Fiksering og Immunhistokemi (figur 3)
Timing: Overnight.
- Overfør eksplantatet i en 50 ml reaktionsrør, der indeholder mindst 15 ml 4% PFA ved omhyggeligt at fjerne stifterne. Post-fastsætte den forreste thorax væg indeholdende triangularis sterni musklen i 1 time på is. Skyl fikseret væv med 0,1 M glycin i PBS (at standse resterende fiksativ og dermed reducere baggrunden) i mindst 10 min. Prøver kan opbevares på dette tidspunkt og behandles senere.
- Overførsel fast explant til en 10 cm Sylgard coated vævskulturskål fyldt med 0,01 M PBS. Udskær en trapez form med en side parallelt med brystbenet, og den anden gennem knogle-til-brusk overgange - det indeholder triangularis muskel på sin overflade. Fjern nederste ribben med en vandret (dvs. trans-sternal) skåret således, at den kaudale ende af triangularis muskel kan frit tilgængelige (Figur 3A-D).
- Indsætte en kanyle som en stift ind i den øvre del af trapez (fig. 3E). Anvende en kanyle fastgjort til en 1 ml sprøjte og pincet til at fjerne triangularis muskel på overfladen ved forsigtigt at holde på en kaudal hjørne af musklen og under anvendelse af nålen som en mikro-skalpel. Sørge for, at udskæringer foretages parallelt med planet af den thorakale væg. Når den bageste del af musklen er frigivet, indsætte et andet hypodermisk nål som en tap under musklen gennem thorax væggen - det immobiliserer fremstillingen og tillader at udøve et let træk på musklen med pincet (figur 3F). Som du skærer bindevæv Tissue indsættelser, "skræl" væk muskel fra brystkassen. Skær sidste caudal vedhæftet fil med fjeder saks. Fjern fedt og blodkar resterne ved hjælp af pincet. Vær forsigtig med ikke at rippe væk nerverne Bemærk:. Brug separate sæt af værktøjer og retter til at arbejde med levende og faste væv.
- Start immunhistokemi (under anvendelse af en standardprotokol) ved at overføre vævsprøver i blokeringsopløsning i 1 time på et rysteapparat ved stuetemperatur. Mindst mulige volumen for farvningen er 200 ul under anvendelse af en 96-brønds plade.
- Anvendes primært antistof fortyndet i blokeringsopløsning, 200 pi per well, natten over ved 4 ° C på et rysteapparat.
- Vaskes i 0,01 M PBS tre gange i 10 min.
- Anvende passende sekundært antistof i 1-2 timer ved stuetemperatur, fortyndet med blokerende opløsning.
- Vaskes i 0,01 M PBS tre gange i 10 min.
- Monter i anti-fading medium (f.eks Vectashield) og dækglas.
- Placer slide på magnetisk metalplade, sted magnet på toppenaf prøven til at flade i et par timer eller natten over ved 4 ° C. Seal med neglelak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et eksempel på en triangularis sterni eksplantat klar til billeddannelse parabol er vist i figur 1G. Dette eksplantat er især egnet til billeddannelse NMJs ex vivo som triangularis musklen kun består af et par lag af muskelfibre. Dette gør det muligt at opnå billeder med høj opløsning fra eksplantater afledt fra transgene muselinjer at fremhæve enten SCs (PLP-GFP 2) og / eller axoner (Thy1-XFP 1). Kritiske faktorer for høj billedkvalitet omfatter: (i) undgå at røre triangularis muskler under eksplantat præparat til at forhindre muskelfiber skade, (ii) udvælgelse af overfladiske og flade synapser at reducere dybde-associerede aberrationer, (iii) ikke overophedning prøven (> 37 ° C) og fastholde prøven godt iltet, (iv) potentielt stoppe superfusionsapparatet under billedbehandling for at reducere afdrift eller vibration, (v) omhyggeligt at placere superfusionssystem slange og temperaturfølere at undgå at berøre prøven, samt keeping undersiden af skålen tørt for at undgå afdrift, (vi) balancering omfattende blegning med at undgå "collateral" signaltab i off-target SCs for at maksimere kontrasten. Muskeltrækninger og axon fragmentering er hyppigt forekommende fænomener, hvis eksplantatet er beskadiget og usundt. Ustabilitet af præparatet resulterer i uskarpe fremskrivninger af konfokale stakke. Men når beskrevne sekventielle fotoblegende teknik fungerer godt, det afslører morfologi enkelt terminal SC i detaljer (figur 2F). Den viste morfologi enkelt terminal SCs kan være ganske overraskende og ikke let forudsiges før blegning. Endvidere kan graden af SC motilitet i NMJ ikke videregives uden mærkning af enkelte celler.
Efter levende mikroskopi, kan den triangularis sterni eksplantatet kan fikseres og farves for enhver markør af interesse (Figur 3). For dette, lever afbildede celler kan spores tilbage ved hjælp af kort CreaTed forhånd (Figur 2G-I) og scannet ved høj opløsning i det faste væv. Generelt standardmetoder til immunohistokemi kan anvendes - en advarsel her er den kendsgerning, at antistof indtrængning kan være ret begrænset i myelinerede axoner og kræver meget lange antistof inkubationstider. Igen, vælger overfladiske NMJs og fjerne fedt rester fra den faste muskler godt (uden at flå nerverne) hjælper til at undgå denne faldgrube.
Figur 1. Triangularis sterni eksplantat præparat. (A) Til fremstilling af triangularis nerve-muskel eksplantat, er det nødvendigt at dissekere den komplette anterior thorax væg af mus (skematisk overlejret på en mus). (B) Anterior thorax væggen lige efter dissektion. (
s/ftp_upload/4460/4460fig3.jpg "/>
Figur 3. Dissektion af den faste triangularis sterni muskel og image fast NMJ. (A) Fast triangularis sterni eksplantat i PBS i cellekultur fad belagt med Sylgard. (BD) Klipper udført med fjeder saks til at isolere triangularis sterni muskel. (EG) Taning af eksplantat stykke indeholder triangularis sterni muskel og fjerne muskel fra overfladen. (H, I) Fast betragtning af den meget NMJ der blev afbildet i figur 2. Farvning for acetylcholin receptorer med bungarotoxin koblet til Alexa 647 (rød) og for synaptiske vesikler med en anti-synaptophysin antistof (hvid). Klik her for at se større figur .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
SC blegning metode, der præsenteres her er enkel, hurtig og alsidig: (i) Den gør det muligt at afsløre en enkelt SC morfologi og dynamik ved konfokal mikroskopi baseret på en enkelt transgen - hvilket er en betydelig fordel, når man kombinerer den tilgang med f.eks sygdomsmodeller, der kræver yderligere alleler . (Ii) Fremgangsmåden er hurtig, fra dissektion til fiksering den kan udføres på en halv dag. (Iii) Antallet af ansøgninger er bred, da det kan kombineres med andre metoder, såsom celle ablationer, billedbehandling organeller, elektrofysiologi eller immunhistokemi. Endvidere kan den fremgangsmåde, præsenteres her til SCS på murine NMJs generaliseres til andre celler, væv eller arter - et eksempel på en anvendelse af en beslægtet teknik i zebrafisk er præsenteret i reference 6. Også andre fluorescerende proteiner foruden GFP kan anvendes til blegning og tidsforskydningen mikroskopi, fx YFP eller CFP. Mens vi ikke har brugt disse fluorescerende proteiner i SCS, bleaching af axoner viser, at en mindre stabil fluorescerende protein (f.eks CFP) i denne indstilling kan være fordelagtigt. Imidlertid et kompromis mellem effektiv blegning og stabil billeddannelse skal findes, afhængig af de ønskede resultater (f.eks enkelt billede vs time-lapse af de resterende ikke-blegede celler).
Der er en række begrænsninger for teknikken, dog. Man angår anvendelsen af en eksplanteret (og dermed axotomized) muskel, hvilket begrænser det billeddannende periode. I tidligere undersøgelser har vi fundet, at - alt efter forespørgsel under undersøgelsen - den triangularis sterni eksplantatet kan anvendes til et maksimum på 3-6 timer. Alligevel kan sekventiel fotoblegende anvendes in vivo, at overvinde denne begrænsning forudsat prøven kan være tilstrækkeligt stabiliseret til opnåelse af billeder, som kan trækkes. To yderligere aspekter skal holdes for øje, når man analyserer data fra den sekventielle blegning tilgang: (i) Fototoksicitet kunne ændre SC dynamik, som kIlling en terminal SC resulterer i hurtig ekspansion af sine naboer 11. Så plausibilitetskontrol bør medtages, f.eks måle summen af udvidelser og tilbagetrækninger i en stabil synapse. I gennemsnit bør befolkningen i afbildede SCs ikke signifikant vokse eller krympe. (Ii) Morfologien af alle undtagen den sidste SC opnås ved billedet subtraktion. Kvaliteten af et sådant billede afhænger af den opnåede blegning kontrasten. Dette opnås generelt lettere i lysere muselinjer. For eksempel arbejder PLP-GFP bedre end S100-GFP 12. Billede subtraktion tilføjer støj, så de sidste SCS er generelt afsløret mere detaljeret end de andre (især også, som post-hoc imaging efter fiksering tillader brug høj numerisk blænde olie målsætninger). Derfor bør en morfologisk træk kun accepteres som ægte, hvis det er synligt i "sidste" SCS, såvel som i bleget dem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Manuela Budak, Ljiljana Marinkovi og Kristina Wullimann for fremragende teknisk bistand. Vi takker W. Macklin til tilvejebringelse af PLP-GFP-mus. TM er støttet af Institute of Advanced Studies (Technische Universität München), som Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Sonderforschungsbereich SFB 596), af Alexander-von-Humboldt-Fonden og den nationale bevilgende myndighed ("Bundesministerium für Bildung und Forschung" ) inden for rammerne af ERA-Net neuron "iPSoALS" og "2-foton billedbehandling". TM og MB understøttes af Center for Integreret Protein Science (München). PM blev støttet af Graduate School of Technische Universität München (TUM-GS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70% (vol/vol) ethanol solution | Roth | T913.1 | in spray bottle |
| isoflurane | Forene, Abbott | any other approved anaesthetic can be used for lethal anaesthesia | |
| transgenic mice (Plp-GFP) | to be obtained from cited sources | ||
| dissection microscope with cold-light illumination | Olympus SZ51 | equipped with Schott KL 1500 LCD | |
| forceps #2 | Fine Science Tools | 11233-20 | |
| forceps #5 | Fine Science Tools | 11295-00 | |
| scissors, large medical | Fine Science Tools | 14108-09 | |
| scissors, small angled spring | Fine Science Tools | 15033-09 | |
| in-line heater | Warner Instruments | SF-28 | |
| heating ring for 3.5-cm dishes | Warner Instruments | 64-0110 DH-35 | |
| two channel temperature control system | Warner Instruments | TC-344B | |
| superfusion pump system | custom-built | ||
| 15-cm tissue culture dish | Sarstedt | 83.1803.003 | filled with ice and covered by metal plate |
| 10-cm tissue culture dish | Sarstedt | 83.1802.003 | with oxygenated Ringer's solution |
| 3.5-cm tissue culture dish | Sarstedt | 83.1800.003 | filled with Sylgard polymer |
| Sylgard polymer | Dow Corning | Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | |
| confocal microscope | Olympus | FV1000 | with argon laser |
| 50-ml reaction tube | Sarstedt | 62.547.254 PP | |
| 4% PFA in PBS | Sigma | P6148 | |
| cannula 0.5 mm x 25 mm | Neolab | E-1510 | |
| syringe 1 ml | Neolab | E-1496 | |
| synaptophysin antibody | Invitrogen | 18-0130 | rabbit |
| secondary antibody | Invitrogen | A-11012 | Alexa 594 |
| 24-well plate | Sarstedt | 83.1836 | |
| 0.01 M PBS | Sigma | P4417 | |
| 0.1 M glycine in PBS | Roth | 3790.1 | |
| coverslips | Neolab | E-4132 | |
| slides | Neolab | E-4121 | |
| Vectashield | Vector labs | H-1000 | |
| minutien pins ×10 | Fine Science Tools | 26002-20 | shortened to < 4 mm |
| α-Bungarotoxin coupled to Alexa 594 | Invitrogen (Molecular Probes) | B-13423 | |
| Blocking Solution | |||
| 0.01 M PBS | |||
| 0.2% Triton-X100 | Roth | 3051.3 | |
| 10% Normal Goat Serum | Abcam | ab7481 | |
| 1% bovine serum albumin | Sigma | A7030 | |
| Ringer bubbled with 95% O2 /5% CO2 |
|||
| 125 mM NaCl | Sigma | S7653 | |
| 2.5 mM KCl | Sigma | P9333 | |
| 1.25 mM NaH2PO4 | Sigma | S8282 | |
| 26 mM NaHCO3 | Sigma | S6297 | |
| 2 mM CaCl2 | Sigma | 21114 | |
| 1 mM MgCl2 | Sigma | 63020 | |
| 20 mM glucose | Sigma | G7528 | |
Table 1. Specific reagents and equipments. |
|||
References
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Mallon, B. S., Shick, H. E., Kidd, G. J., Macklin, W. B. Proteolipid promoter activity distinguishes two populations of NG2-positive cells throughout neonatal cortical development. J. Neurosci. 22, 876-885 (2002).
- Brill, M. S., Lichtman, J. W., Thompson, W., Zuo, Y., Misgeld, T. Spatial constraints dictate glial territories at murine neuromuscular junctions. The Journal of cell biology. 195, 293-305 (2011).
- Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450, 56-62 (2007).
- Thompson, W. J., et al. Transgenic mice with photoswitchable GFP in Schwann cells. Society for Neuroscience. Program 241, (2008).
- Williams, P. R., et al. In vivo development of outer retinal synapses in the absence of glial contact. J. Neurosci. 30, 11951-11961 (2010).
- Kerschensteiner, M., Reuter, M. S., Lichtman, J. W., Misgeld, T. Ex vivo imaging of motor axon dynamics in murine triangularis sterni explants. Nat. Protoc. 3, 1645-1653 (2008).
- McArdle, J. J., et al. Advantages of the triangularis sterni muscle of the mouse for investigations of synaptic phenomena. J. Neurosci. Methods. 4, 109-115 (1981).
- Marinkovi, P., et al. Axonal transport deficits and degeneration can evolve independently in mouse models of amyotrophic lateral sclerosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 4296-4301 (2012).
- Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans Image Process. 7, 27-41 (1998).
- Brill, M. S., Lichtman, J. W., Thompson, W., Zuo, Y., Misgeld, T. Spatial constraints dictate glial territories at murine neuromuscular junctions. The Journal of cell biology. 195, 293-305 (2011).
- Zuo, Y., et al. Fluorescent proteins expressed in mouse transgenic lines mark subsets of glia, neurons, macrophages, and dendritic cells for vital examination. J. Neurosci. 24, 10999-11009 (2004).
