Summary
Visualiseren individuele cellen in dicht opeengepakte weefsels, zoals terminal Schwann-cellen (SC) op neuromusculaire verbindingen (NMS), is een uitdaging. "Sequential foto-bleken" laat de afbakening van een enkele terminal SC's, bijvoorbeeld in de triangularis sterni spier explantatie, een handige zenuw-spier voorbereid, indien sequentiële bleken kan worden gecombineerd met time-lapse imaging en
Abstract
Sequential foto-bleken is een niet-invasieve manier om afzonderlijke SC label aan de NMJ. De NMS is de grootste synaps van de zoogdieren zenuwstelsel en heeft gediend als leidraad model om synaptische structuur en functie te bestuderen. In de muis NMS motor axon terminals vormen krakeling-achtig contact sites met spiervezels. De motor axon en de terminal zijn ommanteld door SCS. In de afgelopen decennia zijn verschillende transgene muizen werden gegenereerd om motorneuronen en SC's te visualiseren, bijvoorbeeld Thy1-XFP 1 en PLP-GFP muizen 2, respectievelijk.
Langs de motor axonen, worden myeliniserende axonale SC's gerangschikt in niet-overlappende internodiën, gescheiden door knopen van Ranvier, om sprongsgewijze actiepotentiaal voortplanting mogelijk te maken. In tegenstelling, terminal SC's op de synaps zijn gespecialiseerde gliale cellen, die te bewaken en te bevorderen neurotransmissie, verteren puin en gids regenererende axonen. NMS zijn strak gedekt door tot een half dozijn niet-myelinating terminal SC's - deze kunnen echter niet afzonderlijk worden opgelost door middel van lichtmicroscopie, omdat ze in direct contact membraan 3.
Verschillende benaderingen bestaan om individueel visualiseren terminal SC. Geen van deze zijn onberispelijk, dat wel. Bijvoorbeeld, kleurstof vullen, waarbij enkele cellen worden gespietst met een kleurstof gevulde micro-elektrode, vereist het vernietigen van een gelabelde cel alvorens in een tweede. Dit is niet compatibel met de volgende time-lapse opnames 3. Multispectrale "Brainbow" etikettering van SCS is bereikt door combinatorische expressie van fluorescerende eiwitten 4. Deze techniek heeft waarin verschillende transgenen en wordt begrensd door het expressiepatroon van de promoters gebruikt. In de toekomst zou expressie van "photo-schakelbare" eiwitten in SCS nog een andere alternatieve 5. Hier presenteren we sequentiële foto-bleken, waarbij enkele cellen worden gebleekt, en hun imago verkregen door aftrekking. Wij gelovendat deze benadering - vanwege het gemak en de veelzijdigheid - is een blijvende Naast technologie de neurowetenschapper palet, vooral omdat het kan worden gebruikt in vivo en overgebracht naar andere celtypen lokalisaties of soorten 6.
In het volgende protocol, ingegaan op de toepassing van de sequentiële bleken en de daaropvolgende confocale time-lapse microscopie op klem SC's in triangularis sterni spier explantaten. Deze dunne, oppervlakkige en gemakkelijk ontleed zenuw-spier voorbereiding 7,8 nuttig is gebleken voor studies van NMJ ontwikkeling, fysiologie en pathologie 9. Tot slot leggen we uit hoe de triangularis sterni spier bereid is na fixatie uit te voeren gecorreleerd met een hoge resolutie confocale beeldvorming, immunohistochemie of ultrastructurele examens.
Protocol
1. Triangularis Sterni Explantatie (figuur 1)
Timing: 15 minuten.
- Bereid chirurgische instrumenten: 2 paar tangen, 1 schaar, 1 paar van de lente schaar, 1 weefselkweek schotel (10-cm). Vooraf geborreld (minimum voor 15 min) gekoelde (4 ° C) Ringer's oplossing met 5% CO 2/95% O2. Vul 15-cm weefselkweek schotel met ijs en dek deze af met metalen plaat. Bereid dissectie microscoop en plaats de 15-cm schaal met ijs onder de scope dissectie om het explantaat koelen tijdens dissectie.
- Dodelijk verdoven de muis door isofluraan overdosering (of een andere goedgekeurde methode van het offer). Spuit de muis met 70% ethanol om bont verontreiniging van het explantaat te voorkomen. Voor SC bleken, gebruikten we Plp-GFP muizen, die kan Thy1-OFP3 of Thy1-Membow13 worden gekruist voor gelijktijdige visualisatie van de axon.
- Met het paar grote schaar, een incisie vande huid over het borstbeen en twee insnijdingen evenwijdig aan de onderrand van de ribbenkast.
- Met behulp van de paar grote schaar, verwijder de huid, opent de buikwand, en maak incisies parallel aan de ribbenkast helemaal terug aan de wervelkolom. Dan ontleden van de borstspieren door het maken van insnijdingen in de buurt van de spier insertie op het borstbeen.
- Snijd het diafragma geopend net onder de zwaardvormig kraakbeen en ontleden uit het membraan langs de ribben inserties.
- Die de ribbenkast van de zwaardvormig proces met een set van forceps, start het snijden van de ribben van de wervelkolom, zo dicht mogelijk bij hun inserties. De linker en rechter bezuinigingen moeten convergeren boven het hart naar de manubrium sterni. Probeer te voorkomen dat het snijden van grote bloedvaten (vooral de subclavia aderen). Beter zicht wordt bereikt door voorzichtig op te tillen van de bereiding terwijl op de zwaardvormig proces met een pincet.
- Maak een dwarse snede net onder de manubrium sternien breng het explantaat in de 10 cm schaal met gekoelde 5% CO 2/95% O2 fijnbellige Ringer's oplossing. Plaats de 10-cm schotel op de metalen plaat die de 15-cm weefselkweek schotel gevuld met ijs. Alle verdere stappen moeten worden gedaan onder de dissectie microscoop.
- Met behulp van kleine lente schaar verwijderen van de resten van de thymus, pleura, membraan (binnen) en borstspieren (buiten; Figuur 1B-D).
- Om de explantatie te passen aan de 3,5-cm schotel, ontleden korting op alle de ribben die niet te plaatsen om het borstbeen. Dit kan het beste gebeuren met behulp van kleine lente schaar en het snijden van het weefsel tussen ribben (figuur 1E).
- Speld de triangularis sterni zenuw-spier explantaat in de Sylgard gecoate 3,5-cm weefselkweek schotel met minutien pennen (ingekort tot <4 mm; figuur 1G). Twee pennen moeten gaan door middel van kraakbeen (wit) delen van het borstbeen. Steek ten minste twee pennen door de ribben zowel links en rechts van ee explantaat streven naar de zachtere kraakbeen delen en het vermijden van de ribben onder of dicht bij de triangularis spier. Hoe meer pennen worden gebruikt, hoe beter (we gebruiken meestal 8-10). Zoals je vast te pinnen de voorbereiding, zorg ervoor dat de ribben enigszins worden gespreid, de vaststelling van de spier in een licht uitgerekte positie.
- Optioneel: Visualiseer synaptic sites die acetylcholinereceptoren door toevoeging bungarotoxin gekoppeld met Alexa kleurstoffen (concentratie van 0,8 ug / ml in 5% CO2 / 95% O 2 fijnbellige Ringer's oplossing). Incubeer gespelde explant in Sylgard gecoate schaal gedurende 15-20 minuten bij kamertemperatuur en vervolgens verschillende malen wassen met 5% CO 2/95% O2 fijnbellige Ringer's oplossing.
2. Bleken SC's en optionele Time-lapse microscopie (figuur 2)
Timing: 30 - 45 min + optioneel 1 tot 5 uur voor time lapse.
- Transfer 3,5-cm Sylgard-gecoate schaal van een confocale microscoop uitgerust humorh een argon-laser (488 nm golflengte) en water onderdompeling doelstellingen (4x, 0,13 NA, 20x, 0,5 NA en 100x, 1,0 NA of 60x, 0,9 NA).
- Optioneel voor time-lapse microscopie: Insert 3,5-cm Sylgard-gecoate schaal in verwarmings-ring, installeer superfusie systeem en temperatuursensor (Figuur 2A). Zorg ervoor dat geen van hen de explantatie, de rand van de schaal of de Sylgard coating aan te raken. Verwarm het monster tot 33-35 ° C. Voor SC bleken zonder time-lapse, kamertemperatuur is beter, als cellen vertonen minder dynamiek tussen bleken stappen.
- Met een 4x lucht objectieve observeren innervatie patroon van triangularis sterni spieren en vind triangularis sterni eindplaat band. Schakel over naar 20x dompelen-cone objectieve en ga op zoek naar oppervlakkige regio's binnen de eindplaat band (gebieden bovenliggende ribben zijn goede kandidaten). Wijzig doelstelling om 100x of 60x dompelen-conus doel om na te gaan op individuele NMS. Ideaal is een NMJ dat wordt gedekt door een aantal SC's en ligt zeer superficially (Figuur 2B). Als het uitvoeren van time-lapse imaging na het bleken, tot selecteren 3 NMS die relatief dicht bij elkaar om de opbrengst te verhogen.
- Verwerven een confocaal beeld van de NMJ voor foto-bleken individuele SCS (figuur 2B). (Voor de volledige resolutie beeldvorming, bijvoorbeeld op een Olympus FV1000 microscoop, gebruik dan een 100x, 1,0 NA objectieve en 2,5 zoom, wat resulteert in Nyquist-beperkte bemonstering van ~ 0,1 micrometer per pixel.)
- "Park" de 488 nm laserbundel centraal op de kern van een SC met maximale kracht gedurende 5 seconden (respectievelijk een efficiënte scan patroon in een klein gebied van belang worden gebruikt, zoals "tornado scan" functie op een Olympus microscoop; als we een confocale microscoop, de laser is gericht op het beeld-conjugaat vliegtuigen en dus bij 488 nm met een doelstelling van 1,0 NA, <0,5 urn in diameter). Opnieuw concentreren op de cel en rechter bleken resultaat. Herhaal indien nodig bleektrap weer tot GFP niveaus te verminderend tot bijna achtergrondniveaus. Acquire een beeld na het bleken (figuur 2C). Het is cruciaal om te zorgen dat de gebleekte gebied buiten van overlapping tussen twee cellen - als er overlap, zal bleken in een tweede cel duidelijk.
- Herhaal stap hierboven totdat alle, maar een SC worden gebleekt (figuur 2D-E). De laatste "ongebleekt" SC is geschikt voor confocale time-lapse microscopie. Reconstrueren enkele cellen door aftrekking van beelden, bijvoorbeeld met behulp van Photoshop-software, om enkele SC morfologie en grondgebied (figuur 2F) af te bakenen. Wees ervan bewust dat het aftrekken van twee magiërs ruis (bijvoorbeeld door ze te importeren in opeenvolgende "lagen" in Photoshop en vervolgens om de boven-kanaal "verschil" in het drop-down menu aan de bovenkant van de kanalen tab) toevoegt. Dit kan worden omzeild door gebruik te maken van de "Ontvlekken"-functie op de kanalen vóór aftrek en bijsnijden weg elke achtergrond die duidelijk niet afkomstig is uit degebleekt cel. Om contrast te optimaliseren, kan het nodig zijn om de helderheid van de twee kanalen in de "niveaus" venster passen. De resulterende beeld van de gebleekte cel is de boven op het origineel beeld van een synaps, pseudo-gekleurd in een unieke tint en transparant gemaakt op het grondgebied van de gebleekte cel kleur in de oorspronkelijke afbeelding (van het doen van dit voor alle gebleekt en de laatste , ongebleekt cellen het beeld weergegeven in figuur 2F resultaten).
- Optioneel: Start confocale time-lapse microscopie na het bleken op een na alle SC's. Een foto op vaste tijdstippen (bijvoorbeeld elke 5 tot 10 min). Gebruik zo weinig mogelijk stroom laser. Tot 3 NMJs kan worden afgebeeld op dezelfde sessie.
- Maak een kaart van de time-verjaarde NMS door het nemen van een beeld op 100x zonder zoom, dan beelden van de regio met behulp van 20x en 4x doelstellingen (figuur 2G-I). Deze "kaart" is nodig om na NMJs immunohistochemie een vaste spier vinden.
- Voor het imago vanverwerking, converteren individuele beelden in maximale intensiteit projecties en op te slaan in tiff-formaat. Combineer alle z-verwachte tijdstippen in een stack en uitlijnen in xy, bijvoorbeeld met behulp van de "stackreg" plugin 10 in Fiji (een pakket op basis van de open source software ImageJ, National Institutes of Health).
3. Fixatie en immunohistochemie (figuur 3)
Timing: Overnachting.
- Breng het explantaat in een 50 ml reageerbuis met ten minste 15 ml 4% PFA door zorgvuldig verwijderen van de pennen. Post-fix de voorste thoraxwand met de triangularis sterni spier gedurende 1 uur op ijs. Spoel gefixeerd weefsel met 0,1 M glycine in PBS (om residueel fixeermiddel dus doof en verminderen achtergrond) gedurende ten minste 10 minuten. Monsters kunnen worden opgeslagen op dit punt en later verwerkt.
- Overdracht vaste explant een 10-cm Sylgard beklede weefselkweekplaat gevuld met 0,01 M PBS. Knip een trapeziumvorm met een side evenwijdig aan het borstbeen en de andere door het bot naar kraakbeen overgangen - dit bevat de triangularis spier op het oppervlak. Onderste ribben met een horizontale (dwz trans-sternum) afgesneden zodat het caudale einde van de triangularis spier vrij toegankelijk (Figuur 3A-D).
- Plaats een injectienaald als een pen in het bovenste deel van het trapezium (figuur 3E). Gebruik een hypodermische naald bevestigd aan een 1 ml spuit en de forceps triangularis spier verwijderen op het oppervlak voorzichtig vasthoudt caudale hoek van de spier en met de naald als een micro-scalpel. Zorg ervoor dat bezuinigingen parallel worden gemaakt op het vlak van de thoraxwand. Zodra de caudale deel van de spier wordt losgelaten, plaats een andere injectienaald als een speld onder de spier door de thoraxwand - deze immobiliseert de voorbereiding en maakt het uitoefenen van een zachte ruk aan de spier met behulp van een pincet (Figuur 3F). Als u het snijden bindweefsel tissue inserties, "schil" weg van de spier van de thorax. Snijd laatste caudale aanhechting met de lente schaar. Verwijder vet en bloedvaten restanten behulp van een tang. Wees voorzichtig niet te scheuren weg de zenuwen. Opmerking: Gebruik aparte sets van gereedschappen en gerechten voor het werken met levende en vaste weefsel.
- Start immunohistochemie (met een standaard protocol) door overdracht weefselmonsters in blokkeringsoplossing gedurende 1 uur op een schudinrichting bij kamertemperatuur. Klein mogelijk volume kleuring 200 pi met een 96-well plaat.
- Toepassing primair antilichaam verdund in blokkeeroplossing, 200 ul per putje, overnacht bij 4 ° C op een schudder.
- Wassen in 0,01 M PBS driemaal gedurende 10 minuten.
- Toepassing geschikt secundair antilichaam gedurende 1-2 uur bij kamertemperatuur verdund in blokkeeroplossing.
- Wassen in 0,01 M PBS driemaal gedurende 10 minuten.
- Monteer in anti-fading medium (bijv. Vectashield) en dekglaasje aan.
- Plaats dia op magnetische metalen plaat, plaats magneet op de topvan het monster gedurende enkele uren of overnacht bij 4 ° plat C. Seal met nagellak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een voorbeeld van een triangularis sterni explant gereed voor imaging schaal is weergegeven in figuur 1G. Dit explant is bijzonder geschikt voor imaging NMJs ex vivo als triangularis spier slechts bestaat uit een paar lagen van spiervezels. Dit maakt het verkrijgen van hoge resolutie beelden van explantaten uit transgene muizenlijnen die respectievelijk SCS (PLP-GFP 2) en / of axons (Thy1-XFP 1). Kritieke factoren voor hoge beeldkwaliteit omvatten: (i) voorkomen raken triangularis spier tijdens explant preparaat spiervezel letsel, (ii) het selecteren oppervlakkig en plat synapsen diepte-geassocieerde aberraties te reduceren, (iii) niet oververhit het monster (> 37 ° C) en het houden van het monster goed zuurstofrijk, (iv) eventueel de superfusie stoppen tijdens beeldvorming om drift of trillingen te verminderen; (v) zorgvuldig plaatsen van superfusie buizen en temperatuur sensoren om te voorkomen dat het aanraken van de steekproef, alsook keeping de onderkant van de schotel droog drift te voorkomen; (vi) het balanceren van uitgebreide bleken met het vermijden van "collateral" signaalverlies in off-target SC's om het contrast te maximaliseren. Spiertrekkingen en axon fragmentatie worden vaak waargenomen verschijnselen, als de explantatie is beschadigd en ongezond. Instabiliteit van het preparaat resulteert in een wazige projecties van confocale stapels. Echter, zodra de beschreven sequentiële foto-bleken techniek werkt goed, het toont de morfologie van een enkele terminal SC in aanzienlijk detail (figuur 2F). De onthulde morfologie van een enkele terminal SC's kan heel verrassend en wordt niet gemakkelijk voorspeld voor bleken. Bovendien kan de mate van beweeglijkheid SC in de NMJ niet verspreid zonder etikettering enkele cellen.
Na live-microscopie, kan de triangularis sterni explantatie worden gefixeerd en gemerkt voor een marker van belang (figuur 3). Voor deze, live belichte cellen kunnen worden getraceerd terug met behulp van de kaart created vooraf (figuur 2G-I) en gescand met hoge resolutie in het vaste weefsel. Algemeen standaardmethoden voor immunohistochemie kan worden gebruikt - een nadeel is het feit dat antilichaam penetratie kan vrij beperkt in gemyelineerde axonen en vereist lange incubatietijden antilichaam. Nogmaals, het kiezen van oppervlakkige NMS en het verwijderen van vet resten van de vaste spieren goed (zonder scheuren van de zenuwen) helpt om deze valkuil te vermijden.
Figuur 1. Triangularis sterni explant preparaat. (A) De triangularis zenuw-spier explant moet de volledige voorste borstwand van de muis (schematisch bovenop een muis) ontleden bereiden. (B) Anterior thoraxwand net na dissectie. (
s/ftp_upload/4460/4460fig3.jpg "/>
Figuur 3. Dissectie van de vaste triangularis sterni spieren en het imago van de vaste NMJ. (A) Vaste triangularis sterni explantatie in PBS in cel cultuur schotel bedekt met Sylgard. (BD) Knipt uitgevoerd met veer schaar om triangularis sterni spieren te isoleren. (EG) Pinning van explantatie stuk met triangularis sterni spier en het verwijderen van de spieren van het oppervlak. (H, I) Vaste Gezien de zeer NMJ die is afgebeeld in figuur 2. Kleuring voor acetylcholine receptoren met bungarotoxin gekoppeld aan Alexa 647 (rood) en voor de synaptische blaasjes met een anti-synaptofysine antilichaam (wit). Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De SC bleken methode hier gepresenteerde is eenvoudig, snel en veelzijdig: (i) Het maakt onthullend enkele SC morfologie en dynamiek door confocale microscopie op basis van een enkel transgen - en dat is een belangrijk voordeel bij het combineren van de benadering, die bijv. met de ziekte van modellen die extra allelen nodig . (Ii) De werkwijze is snel, zoals dissectie van de fixatie kan worden uitgevoerd in een halve dag. (Iii) Het aantal toepassingen is breed, als het kan worden gecombineerd met andere werkwijzen, zoals mobiele ablaties, imaging organellen, elektrofysiologie of immunohistochemie. Daarnaast kan de hier gepresenteerde benadering voor SCS bij muizen NMJs worden gegeneraliseerd naar andere cellen, weefsels of species - een voorbeeld van een toepassing van een verwante techniek in zebravis wordt in referentie 6. Ook andere fluorescerende eiwitten naast GFP kan worden gebruikt voor het bleken en time lapse microscopie, bijvoorbeeld YFP en CFP. Hoewel we niet gebruikt deze fluorescerende eiwitten in SCS bleaching van axonen blijkt dat een minder stabiel fluorescent eiwit (bijvoorbeeld CFP) in deze instelling kan voordelig zijn. Echter, een compromis tussen efficiënte bleken en stabiele weergave worden gevonden, afhankelijk van de gewenste resultaten (bv. enkelvoudige versus time-lapse van de resterende ongebleekte cellen).
Er zijn een aantal beperkingen aan de techniek, echter. Heeft betrekking op het gebruik van een geëxplanteerde (en dus axotomized) spier, die de imaging periode beperkt. In eerdere studies is gebleken dat - afhankelijk van de vraag in studie - de triangularis sterni explantaat kunnen worden gebruikt voor een maximum van 3-6 uur. Toch opeenvolgende foto-bleken kan worden gebruikt in vivo, het overwinnen van deze beperking mits het monster voldoende kan worden gestabiliseerd beelden dat kan worden afgetrokken verkrijgen. Twee andere aspecten moeten worden bewaard in het achterhoofd, bij de analyse van gegevens uit de opeenvolgende bleken aanpak: (i) Fototoxiciteit kon SC dynamiek te veranderen, als kullen een terminal SC resulteert in een snelle uitbreiding van zijn buren 11. Dus plausibiliteitscontroles moeten worden opgenomen, bijvoorbeeld het meten van de som van de uitbreidingen en intrekt in een stabiele synaps. Gemiddeld zou de bevolking van afgebeelde SC's niet significant groeien of krimpen. (Ii) De morfologie van alleen de laatste SC wordt verkregen door beeldsubstractie. De kwaliteit van een dergelijk beeld is afhankelijk van de verkregen bleken contrast. Dit wordt over het algemeen bereikt gemakkelijker in helderder muis lijnen. Bijvoorbeeld, PLP-GFP beter werkt dan S100-GFP 12. Afbeelding aftrekken voegt ruis, zodat de laatste SC's is over het algemeen geopenbaard in meer detail dan de anderen (in het bijzonder ook, als post-hoc imaging na fixatie mogelijk maakt met behulp van hoge numerieke apertuur olie doelstellingen). Daarom moet een morfologische eigenschap alleen geaccepteerd als echt, als deze zichtbaar in "last" SC, evenals in die gebleekt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
We willen graag Manuela Budak, Ljiljana Marinkovi en Kristina Wullimann bedanken voor een uitstekende technische bijstand. Wij danken W. Macklin voor het verstrekken van PLP-GFP muizen. TM wordt ondersteund door het Institute of Advanced Studies (Technische Universität München), door de Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG; Sonderforschungsbereich SFB 596), door de Alexander-von-Humboldt-stichting en door de nationale financiering agentschap ("Bundesministerium für Bildung und Forschung" ) in het kader van ERA-Net NEURON "iPSoALS" en "2-foton beeldvorming". TM en MB worden ondersteund door het Centrum voor Geïntegreerde Protein Science (München). PM werd gesteund door de Graduate School van de Technische Universität München (TUM-GS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70% (vol/vol) ethanol solution | Roth | T913.1 | in spray bottle |
| isoflurane | Forene, Abbott | any other approved anaesthetic can be used for lethal anaesthesia | |
| transgenic mice (Plp-GFP) | to be obtained from cited sources | ||
| dissection microscope with cold-light illumination | Olympus SZ51 | equipped with Schott KL 1500 LCD | |
| forceps #2 | Fine Science Tools | 11233-20 | |
| forceps #5 | Fine Science Tools | 11295-00 | |
| scissors, large medical | Fine Science Tools | 14108-09 | |
| scissors, small angled spring | Fine Science Tools | 15033-09 | |
| in-line heater | Warner Instruments | SF-28 | |
| heating ring for 3.5-cm dishes | Warner Instruments | 64-0110 DH-35 | |
| two channel temperature control system | Warner Instruments | TC-344B | |
| superfusion pump system | custom-built | ||
| 15-cm tissue culture dish | Sarstedt | 83.1803.003 | filled with ice and covered by metal plate |
| 10-cm tissue culture dish | Sarstedt | 83.1802.003 | with oxygenated Ringer's solution |
| 3.5-cm tissue culture dish | Sarstedt | 83.1800.003 | filled with Sylgard polymer |
| Sylgard polymer | Dow Corning | Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | |
| confocal microscope | Olympus | FV1000 | with argon laser |
| 50-ml reaction tube | Sarstedt | 62.547.254 PP | |
| 4% PFA in PBS | Sigma | P6148 | |
| cannula 0.5 mm x 25 mm | Neolab | E-1510 | |
| syringe 1 ml | Neolab | E-1496 | |
| synaptophysin antibody | Invitrogen | 18-0130 | rabbit |
| secondary antibody | Invitrogen | A-11012 | Alexa 594 |
| 24-well plate | Sarstedt | 83.1836 | |
| 0.01 M PBS | Sigma | P4417 | |
| 0.1 M glycine in PBS | Roth | 3790.1 | |
| coverslips | Neolab | E-4132 | |
| slides | Neolab | E-4121 | |
| Vectashield | Vector labs | H-1000 | |
| minutien pins ×10 | Fine Science Tools | 26002-20 | shortened to < 4 mm |
| α-Bungarotoxin coupled to Alexa 594 | Invitrogen (Molecular Probes) | B-13423 | |
| Blocking Solution | |||
| 0.01 M PBS | |||
| 0.2% Triton-X100 | Roth | 3051.3 | |
| 10% Normal Goat Serum | Abcam | ab7481 | |
| 1% bovine serum albumin | Sigma | A7030 | |
| Ringer bubbled with 95% O2 /5% CO2 |
|||
| 125 mM NaCl | Sigma | S7653 | |
| 2.5 mM KCl | Sigma | P9333 | |
| 1.25 mM NaH2PO4 | Sigma | S8282 | |
| 26 mM NaHCO3 | Sigma | S6297 | |
| 2 mM CaCl2 | Sigma | 21114 | |
| 1 mM MgCl2 | Sigma | 63020 | |
| 20 mM glucose | Sigma | G7528 | |
Table 1. Specific reagents and equipments. |
|||
References
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Mallon, B. S., Shick, H. E., Kidd, G. J., Macklin, W. B. Proteolipid promoter activity distinguishes two populations of NG2-positive cells throughout neonatal cortical development. J. Neurosci. 22, 876-885 (2002).
- Brill, M. S., Lichtman, J. W., Thompson, W., Zuo, Y., Misgeld, T. Spatial constraints dictate glial territories at murine neuromuscular junctions. The Journal of cell biology. 195, 293-305 (2011).
- Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450, 56-62 (2007).
- Thompson, W. J., et al. Transgenic mice with photoswitchable GFP in Schwann cells. Society for Neuroscience. Program 241, (2008).
- Williams, P. R., et al. In vivo development of outer retinal synapses in the absence of glial contact. J. Neurosci. 30, 11951-11961 (2010).
- Kerschensteiner, M., Reuter, M. S., Lichtman, J. W., Misgeld, T. Ex vivo imaging of motor axon dynamics in murine triangularis sterni explants. Nat. Protoc. 3, 1645-1653 (2008).
- McArdle, J. J., et al. Advantages of the triangularis sterni muscle of the mouse for investigations of synaptic phenomena. J. Neurosci. Methods. 4, 109-115 (1981).
- Marinkovi, P., et al. Axonal transport deficits and degeneration can evolve independently in mouse models of amyotrophic lateral sclerosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 4296-4301 (2012).
- Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans Image Process. 7, 27-41 (1998).
- Brill, M. S., Lichtman, J. W., Thompson, W., Zuo, Y., Misgeld, T. Spatial constraints dictate glial territories at murine neuromuscular junctions. The Journal of cell biology. 195, 293-305 (2011).
- Zuo, Y., et al. Fluorescent proteins expressed in mouse transgenic lines mark subsets of glia, neurons, macrophages, and dendritic cells for vital examination. J. Neurosci. 24, 10999-11009 (2004).
