Summary
このような神経筋接合部（NMJs）で端末シュワン細胞（SCS）と密集した組織内の個々の細胞を可視化に挑戦している。 "シーケンシャル光退色"漂白シーケンシャルはタイムラプスイメージングと組み合わせることができますオトガイ三角胸骨筋の外植片、便利な神経筋標本において、例えば、単一のターミナルSCを、輪郭を描くことができ、
Abstract
光退色シーケンシャルNMJで個々のSCにラベルを非侵襲的な方法を提供します。 NMJは、哺乳動物の中枢神経系の最大のシナプスで、シナプスの構造と機能を研究するためのモデルを導く務めている。マウスNMJsモーター軸索末端の筋肉の繊維とプレッツェル状の接触部位を形成する。モーター軸索とその端子は、SCSによって覆われている。過去数十年にわたって、いくつかのトランスジェニックマウスは、それぞれTHY1-XFP 1、PLP-GFPマウス2例えば、運動ニューロンおよびSCを可視化するために生成されています。
運動軸索に沿って、軸索のミエリンSCは跳躍活動電位の伝播を可能にするために、ランヴィエ絞輪で区切られた、非重複節間に配置されている。これとは対照的に、シナプスの端末SCは監視と神経伝達を促進し、破片やガイド再生軸索を消化する特殊なグリア細胞である。 NMJsはしっかり半ダース非myelまでで覆われているターミナルSCをinating -彼らが直接膜接触3にあるように、これらは、しかし、個々に、光学顕微鏡では解決できません。
いくつかのアプローチは、個別の端末SCを可視化するために存在しています。これらのどれとはいえ、完璧なありません。例えば、単一の細胞が色素充填微小電極で突き刺さアール染料充填は、2つ目を充填する前に標識した細胞を破壊する必要があります。これにより、その後の時間経過の録音3と互換性がありません。 SCのマルチスペクトル"Brainbow"標識は、蛍光タンパク質の組み合わせ式4を使用することによって達成されてきた。しかし、この手法にはいくつかの導入遺伝子を組み合わせることが必要であり、使用されるプロモーターの発現パターンによって制限されます。将来的には、SCの中で"光切替可能な"タンパク質の発現は、さらに別の代替5かもしれない。ここでは、順次、光退色単一の細胞が漂白されている場所、および減算によって得られたそれらのイメージを提示する。我々は信じているこのアプローチという-その使いやすさと汎用性に起因する-それがインビボで使用され、他の細胞型、解剖学的部位や種6に転送することができ、特にとして、神経科学者の技術パレットに恒久加算を表しています。
オトガイ三角胸骨筋の外植片で端末のSCに、以下のプロトコルでは、我々は詳細漂白シーケンシャルおよびその後の共焦点タイムラプス顕微鏡法の適用を。これは、薄い表面的で簡単に解剖神経筋標本7,8 NMJ開発学、生理学、病理学9の研究のために有用であることが証明されました。最後に、我々はオトガイ三角胸骨筋が相関の高分解能共焦点イメージング、免疫組織化学や超微細構造検査を実行するために固定した後に準備される方法を説明します。
Protocol
1。オトガイ三角胸骨外植片（ 図1）
タイミング：15分。
- 鉗子の2ペア、はさみの1ペア、春のはさみの1ペア、1組織培養皿（10センチ）：手術器具を準備します。 （15分間以上）事前バブリング冷却（4℃）を5％CO 2/95％O 2でリンゲル液。氷で15cmの組織培養皿を記入し、金属板とそれをカバーしています。解剖顕微鏡を準備し、解剖時に外植片を冷却するために、解剖用スコープの下に氷で15 cmの皿を置きます。
- 致死量のイソフルラン過剰摂取（または犠牲の他の承認された方法）によって、マウスを麻酔。外植片の毛皮の汚染を防止するために、70％エタノールでマウスを吹き付けます。 SCは漂白のために、我々は軸索の同時可視化のためTHY1-OFP3またはTHY1-Membow13には交雑可能PLP-GFPマウスを使用していました。
- 大きなはさみのペアを使用して、の正中切開を作る胸骨と肋骨の下縁に平行な2つの切開の上の皮膚。
- 大きなはさみのペアを使用すると、皮膚を除去腹壁を開き、脊柱に戻ってすべての道を胸郭に切開が平行する。その後、胸骨の筋肉の挿入に近い切開を行うことで、胸筋を切っ解剖。
- ただ剣状軟骨下オープン横隔膜をカットし、その沿岸に沿って挿入ダイアフラムをオフに解剖する。
- 鉗子のセットと剣状突起によって胸郭を保持し、できるだけ近い彼らの挿入を可能な限り、脊柱から肋骨を切断開始。左と右のカットは胸骨柄に向かって心臓より収束する必要があります。主要な血管（特に鎖骨下静脈）切断避けるようにしてください。優れた視認性を鉗子で剣状突起上に保持しながら優しく準備を持ち上げることによって達成されます。
- ちょうど胸骨柄下に横カットを行うそして冷却した5％CO 2/95％O 2バブリングリンゲル液と10cmの皿に植片を移す。氷で満たされた15cmの組織培養皿を覆う金属板の上に10cmの皿を置きます。すべてのさらなるステップは、解剖顕微鏡下で行われるべきである。
- 小さ な春のはさみを使用すると、胸腺、胸膜、横隔膜（内側）と胸筋（; 図1B-Dの外側）の残骸を削除。
- 3.5 cmのシャーレに植に合わせて、胸骨に挿入しないで全てのリブをオフに解剖する。これは、最高の小さな春のはさみを使用して、肋骨（ 図1E）の間に組織を切断する実行されます。
- minutienピンを使用して、シルガードコーティングされた3.5 cmの組織培養皿（; 図1G <4ミリメートルに短縮）にオトガイ三角胸骨神経筋外植片をピン。 2つのピンは、胸骨の軟骨（白）部分を介して行く必要があります。両方の目の左側と右側の肋骨を介して、少なくとも2つのピンを挿入しますeの外植片は、柔らかい軟骨部分を狙ってと下の肋骨を回避またはオトガイ三角筋の近隣にあります。以上のピンが使用されている、より良い（我々は一般的に8月10日を使用します）。あなたが準備を突き止めるように、わずかに伸ばした位置に筋肉を固定し、リブがやや広がっていることを確認してください。
- オプション：Alexa色素（5％CO 2/95％O 2バブリングリンゲル液では0.8μg/ mlの濃度）に結合ブンガロトキシンを追加することにより、アセチルコリン受容体を含有するシナプス部位を視覚化します。室温で15〜20分間シルガードコーティングされた皿の中で固定された外植片を培養するには、次いで、5％CO 2/95％O 2バブリングリンゲル液で数回洗浄する。
2。漂白SCとオプションタイムラプス顕微鏡（ 図2）
タイミング：30から45分+オプション1 - 経過時間は5時間。
- 共焦点顕微鏡装備ウィットへの転送3.5-CMシルガードコーティングされた料理をhのアルゴンレーザー（488nmの波長）と水浸対物レンズ（4倍、0.13 NA; 20倍、0.5のNAと100倍、1.0 NAまたは60倍、0.9 NA）。
- タイムラプス顕微鏡用オプション ：インサート加熱リングに3.5 cmのシルガードコーティングされた皿、灌流システムおよび温度プローブ（ 図2A）をインストールします 。それらのどれもが植、皿またはシルガードコーティングのリムに触れないことを確認します。 ℃、33から35に試料を加熱細胞は漂白ステップ間の少ないダイナミクスを示すようにSCは時間経過せずに漂白するため、室温では、優れています。
- 4倍の空気を目的とオトガイ三角胸骨筋の神経支配のパターンを観察し、オトガイ三角胸骨終板帯を見つける。 20Xディッピングコーン客観的に切り替えて、終板帯（領域を覆うリブは良い候補である）内の表在領域を探し始める。個々NMJsをチェックするために100倍以上60倍ディッピングコーン目標に目的を変更します。理想的には、いくつかのSCで覆われていると非常にsuperfic位置していますNMJですially（ 図2B）。あなたが漂白後タイムラプスイメージングを実行する場合は、相対的に収量を増やすために一緒に閉じている3 NMJsまで選択。
- 光退色、個々のSC（ 図2B）の前に、NMJの共焦点画像を取得する。 （フル分解能イメージング、オリンパスFV1000顕微鏡上などでは、100倍、1.0 NA対物およびピクセルあたり〜0.1μmのナイキスト限られたサンプリングをもたらす2.5ズームを使用しています。）
- "パーク"集中5秒（あるいはそのようなオリンパスの顕微鏡の "竜巻スキャン"機能として使用することができます興味のある小さな領域での効率的なスキャンパターンのために最大限の電力を使用して、SCの核に488 nmのレーザービーム;我々は共焦点顕微鏡を使用するように、レーザーは1.0のNAを目的とし、488nmで、故に画像共役面に焦点を当てたとされる、直径<0.5μm）である。セルと裁判官漂白結果に再フォーカス。 GFPのレベルが削減されるまで、必要に応じて繰り返し、再びステップを漂白する場合近いバックグラウンドレベルにd。 （ 図2C）漂白後の画像を取得する。それは漂白地域は、2つのセルのオーバラップの外側にあることを確認することが重要である - オーバーラップがある場合、2番目のセルに漂白することは明らかであろう。
- すべてが1つのSCが（ 図2D-E）が漂白されるまで、上記の手順を繰り返します。最後の "無漂白" SCは、共焦点タイムラプス顕微鏡観察に適しています。画像の減算により単一細胞を再構築する、 例えば 、単一のSC形態および領土（ 図2F）を記述するために、Photoshopソフトウェアを使用しています。 2メイジを減算すると、ノイズ（Photoshopでの連続した"層"でインポートしてから、チャンネルタブの上部にあるドロップダウンメニューで" 差 "を最チャンネルを設定することによって、 例えば ）が追加されますので注意してください。これは減算前のチャンネルで" 輪郭以外をぼかす "機能を使用して、明らかに由来しない任意のバックグラウンドを離れてトリミングすることによって回避できます漂白された細胞。コントラストを最適化するためには、 " レベル "ウィンドウには2つのチャンネルの明るさを調整する必要がある場合があります。漂白された細胞の結果のイメージは、シナプスの元の画像に重畳ユニーク色相の擬似色とすべての漂白、最後にこれをやってから元の画像（漂白におけるセルの領域を着色するために透明になります、無漂白の細胞図2F結果に示された画像）。
- オプション：すべてが1つのSCを漂白した後、共焦点タイムラプス顕微鏡スタート。一定の間隔（例えば、5〜10分）で画像を取る。できるだけ少ないレーザーパワーとして使用します。最大3 NMJsは、同じセッションで撮像することができる。
- その後、ズームなしで100倍で20倍、4倍の目標を（ 図2G-I）を用いて地域の画像を画像を撮影して、時間経過NMJsの地図を作る。この "地図"は、固定筋の免疫組織化学に続くNMJsを見つけるために必要とされる。
- イメージ用処理、最大強度の予測に個々の画像を変換してTIFF形式で保存します。スタックにすべてのz投影された時間のポイントを組み合わせるとxyに合わせ、 例えばフィジーの"stackreg"プラグイン10（オープンソースソフトウェアImageJのに基づいて、パッケージ、国立衛生研究所）を用いて行った。
3。固定および免疫組織化学（ 図3）
タイミング：宿泊。
- 慎重にピンを除去することにより、少なくとも15ミリリットル4％PFAを含む50mlの反応管に外植片を転送します。氷上で1時間オトガイ三角胸骨筋を含む前胸壁をポストフィックス。少なくとも10分間PBS中の0.1 Mグリシン（残留固定液を急冷し、それ故にバックグラウンドを減らすため）で固定した組織を洗浄します。サンプルはこの時点で保存され、後で処理することができます。
- 0.01MのPBSで満たされた10cmのシルガードコート組織培養皿に固定された外植片を転送します。 1 Siと台形形状を切り出す胸骨、骨と軟骨の遷移を介して他のデパラレル - これは、その表面上にオトガイ三角筋を含んでいます。水平方向（ すなわちトランス胸骨）オトガイ三角筋の尾側端は自由にアクセスできるようにカットして下部肋骨を取り外します（ 図3A-D）。
- 台形の上部（ 図3E）にピンとして皮下注射針を挿入します。優しく筋肉の尾コーナーに保持し、マイクロメスと針を用いて表面にオトガイ三角筋を削除するには、1mlシリンジと鉗子に添付皮下注射針を使用します。カットは胸壁の面に平行に作られていることを確認してください。筋肉の尾の部分がリリースされたら、胸壁を通して筋肉以下のピンのような別の皮下注射針を挿入します-これは準備を固定し、鉗子（ 図3F）を使用して筋肉に優しいプルを発揮することができます。あなたは、コネTISSを切っているように、UEの挿入、 "ピール"離れて胸部の筋肉。春のはさみで最後尾添付ファイルをカットします。ピンセットを用いて、脂肪や血管の残骸を削除。神経を離れてリッピングしないように注意してください注：ライブと固定された組織で作業するためのツールや食器のセットを別々に使用してください。
- 室温でシェーカーで1時間ブロッキング溶液中に組織サンプルを転送することによって、免疫組織化学（標準のプロトコルを使用して）を起動します。染色のための可能な限り最小の容積は、96ウェルプレートを用いて200μlです。
- 4℃で一晩ブロッキング溶液を1ウェルあたり200μlの、°シェーカー上でCで希釈した一次抗体を適用します。
- 0.01MのPBS中で10分間、3回洗浄します。
- ブロッキング溶液で希釈し、室温で1〜2時間に適した二次抗体を適用します。
- 0.01MのPBS中で10分間、3回洗浄します。
- 退色防止媒体（ 例えば Vectashield）とカバースリップでマウントします。
- 磁性金属板の上に置いてスライド上に場所の磁石4℃で数時間または一晩のために平らにするために、サンプルのマニキュアでシール。
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Representative Results
イメージング皿の準備オトガイ三角胸骨植片の例を図1Gに示されている。オトガイ三角筋は筋線維のいくつかの層からのみ構成されていますので、この外植片は、イメージングNMJs エクスビボのために特に適している。これは、いずれかのSC（PLP-GFPの2）および/ または軸索（THY1-XFP 1）を強調するトランスジェニックマウス系統由来の外植片から高解像度の画像を得ることができる。高品質のイメージングのための重要な要因には、（i）筋線維の損傷を防止するための植準備中にオトガイ三角筋に触れて回避する、（ii）（> 37（ⅲ）過熱していないサンプル、深さに関連した収差を低減する表面的で平らなシナプスを選択注意深くサンプルを触れないように灌流チューブおよび温度プローブを配置する（V）だけでなく、K;°C）とサンプルがよく酸素を維持し、（iv）は、潜在的にドリフトや振動を低減するために撮像中に灌流を停止ドリフトを防ぐために乾燥した皿の裏側をeeping、（vi）のコントラストを最大にするために、オフターゲットのSCで "担保"信号損失を避けて漂白包括的なバランス。外植片が破損し、不健康であれば筋肉のけいれんと軸索の断片化は、頻繁に観測された現象である。共焦点スタックのぼやけ予測の準備結果の不安定性。しかし、一度説明シーケンシャル光漂白技術が十分に機能し、それはかなりの詳細（ 図2F）で、単一のターミナルSCの形態を明らかにする。単一の端末SCの形態が明らかに非常に驚くべきことができ、簡単に漂白前に予測されていません。また、NMJ内でSCの運動性の程度は、単一細胞を標識することなく明らかにすることはできません。
ライブ顕微鏡に続いて、オトガイ三角胸骨の外植片は、関心のある任意のマーカー（ 図3）に固定し、染色することができます。このためには、ライブ画像化された細胞は、クレアマップを使用して、バックトラッキングすることができますあらかじめテッド（ 図2G-I）と固定された組織で高解像度でスキャン。免疫組織化学のために、一般的に標準的な方法を使用することができます - ここで注意点が1つの抗体の浸透が非常に有髄軸索に限られており、非常に長い抗体のインキュベーション時間を必要とすることができるという事実である。繰り返しになりますが、表面的なNMJsを選択するとうまく固定筋（神経をリッピングなし）から脂肪残留物を除去すると、この落とし穴を回避するのに役立ちます。
図1。オトガイ三角胸骨植片の準備。（）オトガイ三角神経筋外植片を準備するには、マウスを完全に前胸壁を（概略的にマウスに重畳）解剖することが必要である。ちょうど郭清後（B）の前部胸壁。 （
s/ftp_upload/4460/4460fig3.jpg "/>
図3。固定NMJの固定オトガイ三角胸骨筋と画像の解剖。シルガードでコーティングされた細胞培養皿の中で、PBS中の（）固定オトガイ三角胸骨の植。 （BD）のオトガイ三角胸骨筋を分離するために、スプリングハサミで行わ切り取ります。 （EG）オトガイ三角胸骨筋を含む外植片のピンニングと表面から筋肉を取り除く。 図2に結像された非常にNMJの（H、I）固定ビュー。アレクサ647に結合されたブンガロトキシンとアセチルコリン受容体（赤色）と抗シナプトフィジン抗体（白）と、シナプス小胞の染色は拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。
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Discussion
ここに提示され、SC漂白方法は、簡単で高速かつ汎用性があります：（i）はそれは、単一の導入遺伝子をもとに共焦点顕微鏡によって、単一のSC形態とダイナミクスを明らかにすることができます-追加の対立を必要とする疾患モデルとアプローチなどを組み合わせたときに重要な利点である。解剖から固定には半日で行うことができるように（ii）の方法は、迅速である。それはこのような細胞切除、イメージング小器官、電気生理学や免疫組織化学などの他の方法と組み合わせることができますように（ⅲ）出願件数は、広いです。さらに、ネズミNMJsでSCにここに提示されたアプローチは、他の細胞、組織、または種に一般化することができる - ゼブラフィッシュにおける関連技術の応用の一例は、参考文献6に示されている。また、GFP以外の蛍光タンパク質は、例えばYFP又はCFPのために、漂白とタイムラプス顕微鏡に使用することができます。我々は、SCS、bleachiでこれらの蛍光タンパク質を使用していないものの軸索のngは、この設定ではあまり安定した蛍光タンパク質（ 例えば CFP）が有利で あることを示しています。しかし、漂白効率的かつ安定的なイメージングの間の妥協点は、目的の結果（残りの未漂白の細胞、例えば単一の画像対タイムラプス）に応じて、発見されなければなりません。
多くの制限は、しかし、技術にあります。一つは撮像期間を制限植し（したがってaxotomized）筋肉の使用にも関する。研究対象の質問に応じて - - オトガイ三角胸骨の外植片は3から6時間の最大値を使用することができますこれまでの研究で我々はそれを発見した。それでも、光退色シーケンシャルがインビボで使用することができ、この制限を克服すると、サンプルが十分に差し引くことができる画像を得るために安定させることができる提供した。シーケンシャル漂白アプローチから得られたデータを分析する際には、さらに2つの側面は、心に留めておく必要があります：（i）の光毒性をkとして、SCのダイナミズムを変えることができる隣国11の急速な拡大で端子SC結果をilling。妥当性チェックが含まれるべきであるので、 例えば、安定したシナプスにおける展開と撤回の合計を測定する。平均して、画像化されたSCの人口は大幅に拡大または縮小しないでください。 （ii）すべての形態が、最後のSCは画像減算することによって得られる。そのような画像の品質が得られる漂白コントラストに依存します。これは一般的に明るくマウス系統で容易に達成される。例えば、PLP-GFPは12 S100-GFPよりも効果的です。画像減算はノイズを付加し、最後のSCは、一般的に他のものより詳細に明らかにされるので、（特に、また、 事後イメージングなどの後に固定高開口油の目標を使用できます。）それは "最後の" SCS内だけでなく、漂白のもので表示されている場合はそれゆえ、形態学的特徴のみ、実数として受け入れるべきである。
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Disclosures
特別な利害関係は宣言されません。
Acknowledgments
私たちは、優れた技術支援にマヌエラBudak、Ljiljana MarinkoviとクリスティーナWullimannに感謝したいと思います。我々は、PLP-GFPマウスを提供するためのW·マックリンに感謝します。アレクサンダー·フォン·フンボルト財団、国家助成機関（ "エリーゼのためBundesministerium Bildung undのForschung"により、TMはドイツ学術振興（Sonderforschungsbereich SFB 596 DFG）による高等研究所（ミュンヘン工科大学）によってサポートされています）ERA-Netのニューロン "iPSoALS"と "2光子イメージング"の枠インチTMとMBが統合蛋白質科学研究センター（ミュンヘン）によってサポートされています。 PMは、ミュンヘン工科大学（TUM-GS）の大学院によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70% (vol/vol) ethanol solution | Roth | T913.1 | in spray bottle |
| isoflurane | Forene, Abbott | any other approved anaesthetic can be used for lethal anaesthesia | |
| transgenic mice (Plp-GFP) | to be obtained from cited sources | ||
| dissection microscope with cold-light illumination | Olympus SZ51 | equipped with Schott KL 1500 LCD | |
| forceps #2 | Fine Science Tools | 11233-20 | |
| forceps #5 | Fine Science Tools | 11295-00 | |
| scissors, large medical | Fine Science Tools | 14108-09 | |
| scissors, small angled spring | Fine Science Tools | 15033-09 | |
| in-line heater | Warner Instruments | SF-28 | |
| heating ring for 3.5-cm dishes | Warner Instruments | 64-0110 DH-35 | |
| two channel temperature control system | Warner Instruments | TC-344B | |
| superfusion pump system | custom-built | ||
| 15-cm tissue culture dish | Sarstedt | 83.1803.003 | filled with ice and covered by metal plate |
| 10-cm tissue culture dish | Sarstedt | 83.1802.003 | with oxygenated Ringer's solution |
| 3.5-cm tissue culture dish | Sarstedt | 83.1800.003 | filled with Sylgard polymer |
| Sylgard polymer | Dow Corning | Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | |
| confocal microscope | Olympus | FV1000 | with argon laser |
| 50-ml reaction tube | Sarstedt | 62.547.254 PP | |
| 4% PFA in PBS | Sigma | P6148 | |
| cannula 0.5 mm x 25 mm | Neolab | E-1510 | |
| syringe 1 ml | Neolab | E-1496 | |
| synaptophysin antibody | Invitrogen | 18-0130 | rabbit |
| secondary antibody | Invitrogen | A-11012 | Alexa 594 |
| 24-well plate | Sarstedt | 83.1836 | |
| 0.01 M PBS | Sigma | P4417 | |
| 0.1 M glycine in PBS | Roth | 3790.1 | |
| coverslips | Neolab | E-4132 | |
| slides | Neolab | E-4121 | |
| Vectashield | Vector labs | H-1000 | |
| minutien pins ×10 | Fine Science Tools | 26002-20 | shortened to < 4 mm |
| α-Bungarotoxin coupled to Alexa 594 | Invitrogen (Molecular Probes) | B-13423 | |
| Blocking Solution | |||
| 0.01 M PBS | |||
| 0.2% Triton-X100 | Roth | 3051.3 | |
| 10% Normal Goat Serum | Abcam | ab7481 | |
| 1% bovine serum albumin | Sigma | A7030 | |
| Ringer bubbled with 95% O2 /5% CO2 |
|||
| 125 mM NaCl | Sigma | S7653 | |
| 2.5 mM KCl | Sigma | P9333 | |
| 1.25 mM NaH2PO4 | Sigma | S8282 | |
| 26 mM NaHCO3 | Sigma | S6297 | |
| 2 mM CaCl2 | Sigma | 21114 | |
| 1 mM MgCl2 | Sigma | 63020 | |
| 20 mM glucose | Sigma | G7528 | |
Table 1. Specific reagents and equipments. |
|||
References
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