Summary
Un método sencillo para obtener y mantener la madre de espermatogonias y las líneas de células progenitoras de ratones adultos se presenta aquí. El método utiliza las células de alimentación se originan en el compartimiento de células somáticas de los testículos de ratón adulto. Esta técnica es aplicable a las cepas de ratones comunes, incluyendo transgénicos, knock-out y knock-en ratones.
Abstract
Madre de espermatogonias y células progenitoras (SSC) de los testículos representan un ejemplo clásico de las células madre adultas de mamífero y preservar la fertilidad durante casi toda la vida del animal. Aunque los mecanismos precisos que gobiernan la auto-renovación y diferenciación in vivo son difíciles de estudio, los sistemas se han desarrollado varios previamente para propagar las ESC murinas in vitro usando una combinación de medios de cultivo especializados y células alimentadoras 1-3.
La mayoría de las incursiones in vitro sobre la biología de las ESC han derivado líneas celulares de los recién nacidos, posiblemente debido a la dificultad en la obtención de líneas de células adultas 4. Sin embargo, el testículo continúa madurando hasta ~ 5 semanas de edad en la mayoría de las cepas de ratón. En el periodo post-natal período, los cambios dramáticos se producen en la arquitectura de los testículos y en la biología de las células somáticas y de espermatogénesis, incluyendo alteraciones en los niveles de expresión de numerosas células madre relacionadogenes. Por lo tanto, neonatalmente derivados de las líneas SSC no completamente puede recapitular la biología de las ESC adultos que persisten después de los testículos adultos ha alcanzado un estado estable.
Hay varios factores que han dificultado la producción de líneas de CSS históricamente adultos. En primer lugar, la proporción de células madre funcionales puede disminuir durante la edad adulta, ya sea debido a factores intrínsecos o extrínsecos 5,6. Además, como con otras células madre adultas, que ha sido difícil para enriquecer las SSC suficientemente partir de células adultas testiculares totales sin utilizar una combinación de inmunoselección u otras estrategias de clasificación 7. Estrategias comúnmente empleadas incluyen el uso de ratones criptórquidos como una fuente de células donantes debido a una mayor proporción de células madre para otros tipos de células 8. Sobre la base de la hipótesis de que la eliminación de las células somáticas de la cultura inicial altera las interacciones con el nicho de células madre, que son esenciales para la supervivencia SSC, previamente desarrollado métodos para derivar l adultoines que no requieren inmunoselección o donantes criptórquidos sino más bien emplear enriquecimiento de serie de las ESC en cultivo, denominado en lo sucesivo SESC 2,3.
El método se describe a continuación implica un procedimiento sencillo para derivar líneas SSC adultos mediante la disociación de adulto donante túbulos seminíferos, seguido de plaqueo de las células en los alimentadores que comprenden una línea de células del estroma testicular (JK1) 3. A través de pasada en serie, fuertemente adherente, contaminando las células germinales no se agotan a partir del cultivo de enriquecimiento concomitante de SSC. Los cultivos producidos de esta manera contienen una mezcla de espermatogonias en diferentes estadios de diferenciación, que contienen las ESC, en base a largo plazo la capacidad de auto-renovación. El quid de la SESC método es que permite a CSC para hacer la difícil transición de la auto-renovación en vivo a largo plazo de la auto-renovación in vitro en un microambiente radicalmente diferente, produce a largo plazo las líneas de cooperación Sur-Sur, libre de contaminacióncélulas somáticas, y permite así la posterior manipulación experimental de las ESC.
Protocol
1. Preparación de células de alimentación
Tenga en cuenta que todos los reactivos descritos a continuación deben ser preparados en forma estéril (ver Tablas 1 y 2). Este protocolo emplea la línea celular JK1 (célula Biolabs, Inc., catálogo # CBA-315) como alimentadores que es un derivado transformado de células adultas de ratón testiculares somáticos y se ha descrito en otra parte 3. Tenga en cuenta también que todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices institucionales y reglamentos.
- JK1 células pueden mantenerse en cultivo y se usaron con éxito como alimentadores hasta el paso 39. Cultura JK1 células en una placa de cultivo de 100 mm celular (BD Falcon, catálogo # 353003) con 10 ml de medio de filtro esterilizado alimentador crecimiento (DMEM suplementado con 10% suero bovino fetal [FBS], 2 mM L-glutamina y antibióticos). Cuando el cultivo alcanza el 95% de confluencia, dividir las celdas 1:06 -1:10 ratio.
- Eliminar el medio de confluente JK1 mono célula alimentadoracapa.
- Lavar la capa de células una vez con PBS sin calcio y magnesio.
- Añadir precalentado tripsina / EDTA, 1x (0,05% trypsin/0.53 mM EDTA; Corning Cellgro, catálogo n º 25-051-CI), y se incuba a 37 ° C durante 5-10 minutos.
- Inactivar la tripsina con un volumen igual de medio de crecimiento alimentador. Recoger las células y se centrifuga a 300 xg durante 5 min. Volver a suspender las células en un medio alimentador de crecimiento.
- Capa Pre-placas de múltiples pocillos de cultivo celular mediante la adición de suficiente solución de gelatina 0,4% para cubrir el pozo y eliminar después de 5 min a temperatura ambiente.
- Placa de ~ 250 células por mm 2 en recubierta con gelatina placa de cultivo celular (por ejemplo, formato 48-y 6 o bien-). Incubar cultivo a 37 ° C durante 16 a 24 h.
- Retire el medio de cultivo de los pozos. PRECAUCIÓN: Para inactivar el crecimiento de células, añadir una solución fresca de mitomicina C a 10 ug / ml diluidos en DMEM a cada pocillo (por ejemplo 200 l / pocillo de una placa de 48 pocillos). Mitomicina-C es tóxica. Manipule y deseche con cuidado. Incubar a37 ° C durante 4 horas.
- Eliminar mitomicina-C solución de células. Lavar 3 veces con DMEM antes de células madre de galvanoplastia.
- Eliminar DMEM alimentador de células pocillos y añadir suficiente medio de células madre (100 l / pocillo de una placa de 48 pocillos; véase la Tabla 3) para prevenir la desecación de los comederos durante pasajes. Añadir SSC el mismo día, como se describe a continuación en las secciones 3,1 o 3,4, usando tamaños indicados de los pocillos que contienen alimentadores.
2. La disociación de ratón tejido testicular para obtener células germinales de los donantes
- Cosecha de testículos de ratones adultos en forma estéril y almacenar temporalmente los testículos en una cubierta de placa de Petri (sin adición de líquido). El plato debe colocaron inmediatamente en hielo para prevenir la desecación y mantener la viabilidad celular.
- Utilizando pinzas estériles finos y una tijera bien en una campana de cultivo de células, hacer una incisión transversal en la túnica albugínea completamente sin seccionar el testículo (es decir, cortado ~ ½ - ¾ distancia Through) y usar fórceps para exprimir los túbulos seminíferos en una esquina de la placa; túnica de descarte y el tejido adjunto. Mantenga la placa de hielo en todas partes para mantener el tejido refrigerados, manteniendo así su integridad y prevenir la evaporación.
- Pique rápidamente túbulos con tijeras finas de resorte al menos 3 min por testículo, mientras se mantiene la placa en hielo.
- Recoger los fragmentos tubulares en un tubo cónico de 50 ml y se lava en ~ 40 ml de suero refrigerado PBS / 1% de albúmina bovina.
- Centrifugar a 60 xg durante 10 minutos para separar fragmentos de los túbulos de los espermatozoides y los escombros. Desechar el sobrenadante.
- En un tubo cónico de 15 ml, resuspender el sedimento en 3 ml por testículo de pre-calentado tampón de disociación (DMEM, 0,05% de tripsina, 0,03% de colagenasa tipo I, 80% U / ml de DNAsa I y 0,5 albúmina de suero bovino; Ver Tabla 2 para detalles más específicos de tampón de disociación).
- Colocar el tubo cónico horizontalmente en un bastidor en un conjunto agitador a 150 rpm a 37 ° C durante 15 min para maximizar unagitation.
- Centrifugue a 60 xg durante 10 minutos para separar las células individuales de trozos no disociadas.
- Guardar los trozos de pellets que contienen hasta el siguiente paso. Recoger el líquido sobrenadante de la Etapa 2,8 y añadir 3 ml de DMEM/10% de suero fetal bovino para neutralizar tampón de disociación. Coloque el tubo en hielo temporalmente.
- Repita los pasos 2,6 a 2,7 con el salvado de pellets desde el paso 2.9 para volver a digerir los trozos que quedan después del paso 2.8.
- Añadir un volumen igual de FBS DMEM/10% para neutralizar tampón de disociación.
- Recombine suspensión de la etapa 2,11 con suspensión de células salvado de paso 2,9. Centrifugar durante 5 min a 300 x g.
- Resuspender el sedimento en medio de células madre en un volumen de 16 ml por cada par de testículos (ver Tabla 3).
3. Revestimiento de suspensión de células de testículo
- Placa de 2 ml de la suspensión celular por pocillo en una placa de 6-y que contiene células alimentadoras-mitóticamente inactivados con mitomicina-C y colocar en una incubadora de cultivo celular a 37 ygrados; C en 5% CO 2.
- Después de 48 horas, el medio aspirado, añadir 2 ml de medio fresco y volver a la incubadora.
- Después de 48 horas, añadir 0,5 ml de medio fresco de células madre a cada pocillo y retorno a la incubadora.
- Después de 48 h, posteriormente se alimentan a las células tres veces por semana a partir de entonces como sigue hasta que las colonias grandes y discretas (> 50 células) aparecen (dentro de 7 a 21 días). Por primera y segunda alimentación de cada semana (por ejemplo, Lunes y Miércoles) eliminar ~ 50% del medio y añadir de nuevo 50% en volumen de medio fresco. Para la alimentación tercero (por ejemplo, viernes), aspirar todo el medio y reemplazarlo con 2 ml de medio fresco. Este enfoque se basa en el razonamiento de que la evitación de cambios de medio completo minimiza fluctuaciones en las concentraciones de paracrina señales que son secretados al medio de cultivo 9.
4. Colony Picking primer paso para
- Eliminar el medio de los pocillos con colonias que se passaged y añadir medio fresco de células madre.
- Identificar las colonias utilizando un objetivo de 10x. Con el microscopio ligeramente de-centrado, colonias SSC en el borde del pozo aparecerá como homogéneas brillantes racimos, que constan de muchas células de 11-12 micras de diámetro, en las que es difícil o imposible de discernir los bordes de las celdas individuales, ya que las células aparecen fusionados juntos (Figura 1A). Non-SSC colonias pueden aparecer más oscuras, más granular, o menos homogénea, con fronteras perceptibles (Figura 1A, cuadro).
- Utilizando una punta de pipeta 200 l, con el conjunto pipetteman a 50 l, en primer lugar tomar medio del pozo y expulsar a mojar la punta. A continuación, empujar suavemente la colonia con la punta antes de que la suspensión rápida 50 l de medio para desalojar la colonia por succión en la punta (Figura 1B).
- Expulsar el medio que contiene la colonia en un pocillo de una placa de 48-y que contiene células inactivadas de alimentación con 100 l de medio de células madre (Figura 1C).
- Repita el paso4,3 y agregar hasta 8 colonias en el mismo pozo sin igual a 500 l por pocillo.
- Repetir los pasos desde 4,3 hasta 4,5 para preparar pozos adicionales de la placa de 48 pocillos con colonias pasaje SSC.
- Wells estará listo para dividir en 7-14 días o después de grandes cúmulos de hasta 500 células han surgido (Figura 1D).
5. La expansión posterior y Propagación de las ESC por trituración
- Las células en el paso uno debe ser subcultivado en alimentadores frescos después de hasta 14 días a una relación de división de 1:2 durante los primeros 3 pasajes y luego 01:04-01:06 (cada 7 días) después de la siguiente manera. Suavemente triturar colonias en marcha un pozo semi-confluentes (por ejemplo, ~ 300.000 SSC / pocillo de 6-así placa) con una punta de pipeta de 1 ml por medio de lavado a través de las células. Las colonias pueden observarse desprendimiento. Demasiada fuerza con la corriente de líquido hará que las células no deseadas de alimentación a salir también.
- Recoger las células se muelen en un tubo cónico y se centrifuga a 300 xg durante5 min. Nota: Un paso tripsinización puede ser añadido de forma segura aquí si se desea por el investigador.
- Aspirar el sobrenadante y volver a suspender en medio fresco de células madre a fondo por pipeteo hacia arriba y hacia abajo para interrumpir colonias.
- SSC placa en células alimentadoras recién preparados inactivados con mitomicina-C como se describe en la sección 1.
- Alimentar a las células tres veces por semana como sigue. Para la alimentación primero y segundo (por ejemplo, Lunes y Miércoles) añadir 50% en volumen de medio fresco. Para la alimentación tercero (por ejemplo, viernes), aspirar todo el medio y reemplazarlo con 2 ml de medio fresco. Las placas se hacen confluentes en 7-10 días. Los cultivos deben estar compuesta de células germinales> 98% (es decir, <1% la contaminación de células somáticas) después de pasajes 5-7, basado en la inmunotinción (por ejemplo, utilizando el murino de células germinales marcador GCNA) para distinguir las células germinales a partir de células somáticas 10. Nota: Estos métodos fueron desarrollados en cumplimiento de las normas y requisitos establecidos por la Instituciónal Cuidado de Animales y el empleo Comisión en el Weill Cornell Medical College.
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Representative Results
La aparición de paso por cero de tipo salvaje, las colonias adultas SSC después de 7 días se muestra en la figura 1. Tridimensionales colonias están compuestas de una capa de células planas unidas a los alimentadores o de la matriz extracelular subordinado depositados por los alimentadores con múltiples capas de las ESC que crecen en la parte superior. Mientras las ESC sanos son brillantes refráctil y de manera uniforme 11 a 12 m de diámetro, los bordes de las celdas son difíciles de distinguir y el tamaño de las colonias puede ser altamente variable, tanto en el pozo y entre pozos preparados a partir de diferentes ratones. Visualización de las colonias es ayudado por un microscopio de fase con una pantalla digital y un plano focal ligeramente de-centrada, lo que mejora el contraste entre las colonias SSC altamente homogéneos y contaminación de las células somáticas que están presentes en la pronta aprobación (0-2) culturas y hacer no formar colonias herméticamente (ver Figura 1A recuadro). Tenga en cuenta que la morfología de las células de alimentación cambiará gradualmente after conmutación de DMEM/10% de contener medio de cultivo celular después de la inactivación con mitomicina-C.It es también importante observar que la suspensión inicial de células no se filtra o se tensa, porque grumos residuales de células somáticas se cree que aumentar la supervivencia de las SSC en el momento de la siembra inicial y no debe ser retirado hasta que las colonias se establecen SSC. Pasada en serie (> veces 5-7) es necesario para purificar las células germinales a cerca de homogeneidad (> 98%) y agotan residuales células somáticas. Si experimentos posteriores específicamente requerirá enriquecimiento de células madre a partir de la población total de las células germinales en el cultivo, entonces la selección de células utilizando bolas inmunomagnéticas o citometría de flujo se puede emplear para la purificación adicional, por ejemplo, detener el enriquecimiento de células se puede conseguir usando anticuerpos contra Thy1 , CD9, α6 integrina y otros 11. La identidad de las ESC se confirmó posteriormente mediante inmunofenotipo, la expresión génica, y por trasplante, desde transplantatanálisis de iones es el único medio para evaluar definitivamente la cantidad de células madre funcionales auténticas, 12,13.
Figura 1. Morfología de las primeras colonias de CSS, las células del estroma testicular y alimentadores. A, Aspecto de las nacientes colonias SSC a 5 días después de placas inicial. El recuadro muestra los monocitos contaminantes-como las células somáticas en una cultura cero pasaje. B, selección y recolección de las colonias individuales para el paso primero (~ 14 días) en placas de 48 pocillos. La estructura de negro es la punta de la pipeta. C, Aspecto del inactivadas JK1 células alimentadoras. D, grandes colonias antes de la rutina subcultivo. Las flechas indican las colonias SSC. Barra de escala en A es de 100 micras (inserción, 50 m) y en el TB es de 200 m.
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Discussion
Este método para derivar las ESC adultos con testículos adultos derivados de células de alimentación es robusto y ha tenido éxito cuando comunes orígenes genéticos (por ejemplo FVB, C57BL6 y mixtos 129SV/C57Bl/6) y diferentes cepas mutantes fueron empleados 2,3,7,14. De hecho, el microambiente creado por el sistema de cultivo es suficiente para superar algunas de las barreras genéticas a mantener las SSC adultos in vivo (por ejemplo, en el caso de PLZF - / - de los animales) 7. Mientras que empleamos JK1 células como alimentadores, no transformadas adultos testiculares de células somáticas también se puede utilizar con la misma eficacia como células JK1 2,3.
SESC fue diseñado para obtener de manera eficiente a largo plazo para adultos líneas de CSS. Desafortunadamente, la alta eficiencia se consigue con una compensación por la siguiente razón. Una limitación notable del procedimiento es que la omisión de una etapa de filtrado o el esfuerzo en el momento de la siembra inicial y la manipulación de la que EL PROCEDIMIENTOe implica, que puede afectar a la supervivencia celular, puede provocar una variabilidad sustancial en el número de células chapada de pozo a pozo, que se opone a la cuantificación efectiva en la fase inicial de la formación de colonias. Sin embargo, los ensayos cuantitativos se pueden realizar con cultivos de paso ligeramente más tarde en cuyo momento puede ser una suspensión de células individuales fácilmente preparadas por tripsinización estándar (> pasaje 5-7).
Debido a que las SSC adultas en cultivo se puede expandir y mantener casi indefinidamente, este protocolo permite la producción eficaz de líneas celulares que pueden ser utilizados posteriormente en una manera similar a otros establecidos cultivos primarios o líneas celulares (es decir, análisis de expresión de genes y proteínas o la expresión ectópica de un gen de interés). Sin embargo, es esencial para confirmar finalmente los resultados utilizando análisis trasplante como el estándar de oro u otro sustituto ensayo validado, tal como el ensayo de formación de SSC clúster 12,15.
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Disclosures
MS cánones de Weill Cornell Medical College a través de una licencia para la célula Biolabs, Inc. para distribuir JK1 células.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por el Estado de Nueva York Departamento de Salud (C026878). SM fue un New York Stem Cell Foundation-Druckenmiller Fellow. Apoyado en parte por Beca de Investigación N º 5-FY11-571 de la March of Dimes Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Corning | 10-013 | Diluent for dissociation buffer |
| Trypsin/EDTA | Mediatech | 25-051-CI | |
| Stem cell base medium (StemPro-34) | Life Technologies | 10639-011 | Requires supplementation as per Shinohara et al. (2003)* |
| Stem cell medium supplements | various | see Table 3 | Requires supplementation as per Shinohara et al. (2003)* |
| JK1 cells | Cell Biolabs, Inc. | CBA-315 | Can substitute with adult testicular stromal cells as per Seandel et al. (2007) |
| mitomycin-C (CAUTION) | Sigma-Aldrich | M4287 | Toxic; Handle with care. |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | 0.4% solution in water |
| EVOS xl digital inverted microscope | Advanced Microscopy Group | - | |
| Table 1. Specific reagents and equipment. *See Table 3 |
|||
| DMEM | Corning | 10-013 | Diluent for dissociation buffer |
| trypsin (1:250) | Life Technologies | 27250-018 | Dissociation buffer: Final 0.05% wt/vol |
| collagenase, type I, 235 U/ml | Worthington | CLS1 235 | Dissociation buffer: Final 0.03% wt/vol |
| DNAse I | Sigma-Aldrich | DN25 | Dissociation buffer: Final 80 U/ml |
| bovine serum albumin | ICP Bio | ABRE-100g | Dissociation buffer: Final 0.5% wt/vol |
| Table 2. Dissociation buffer | |||
| StemPro-34 SFM | Life Technologies | 10639-011 | |
| StemPro-34 Nutrient supplement | Life Technologies | 10639-011 | |
| Additional supplements** | |||
| Non-essential amino acids | Sigma-Aldrich | M7145 | 1X |
| MEM Vitamin solution | Life Technologies | 11120-052 | 1X |
| L-glutamine | Mediatech | 25-005 | 2 mM |
| bovine serum albumin | ICP Bio | ABRE | 0.50% |
| Antibiotic-Antimycotic Solution | Mediatech | 30-004-CI | 1X |
| D(+)glucose | Sigma-Aldrich | G8769 | 6 mg/ml |
| β-estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 | 30 ng/ml |
| progesterone | Calbiochem | 5341 | 60 ng/ml |
| fetal bovine serum | variable | n/a | 1% |
| bovine holo-transferrin | Sigma-Aldrich | T1283 | 100 μg/ml |
| insulin | Gemini Bio-Products | 700-112P | 25 μg/ml |
| human GDNF | Life Technologies | PHC7041 | 10 ng/ml |
| human bFGF | Life Technologies | PHG0023 | 10 ng/ml |
| mouse EGF | Life Technologies | PHG0313 | 20 ng/ml |
| putrescine | Research Organics | 0778P | 60 μM |
| sodium Selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | 30 nM |
| pyruvic acid | Alfa Aesar | A13875 | 30 μg/ml |
| DL-lactic acid | J.T. Baker | 0196-04 | 1 μg/ml |
| β-mercapt–thanol | Life Technologies | 21985-023 | 50 μM |
| ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | 100 μM |
| D-biotin | Sigma-Aldrich | B4639 | 10 μg/ml |
| Table 3. Stem cell medium | |||
| *Note: Add supplements below before using medium. Filter sterilize and keep it at 4 °C. The medium is stable for at least 2 weeks. | |||
| **We have employed different manufacturers, formulations, and/or lot numbers of these reagents without any apparent deleterious effects. In general, cell culture grade reagents should be employed. | |||
References
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