Summary
En enkel metode for å utlede og vedlikeholde spermatogonial stilk og progenitor cellelinjer fra voksne mus er presentert her. Metoden utnytter mater celler stammer fra det somatiske celle kupé av de voksne mus testis. Denne teknikken gjelder vanlige musestammer, inkludert transgene, knock-out, og knock-i mus.
Abstract
Spermatogonial stilk og progenitor celler (SSCS) av testis representerer et klassisk eksempel på voksne pattedyrceller stamceller og bevare fruktbarheten for nesten levetiden av dyret. Mens de nøyaktige mekanismene som styrer selvfornyelse og differensiering in vivo er utfordrende å studere, har ulike systemer blitt utviklet tidligere for å spre murine SSCS in vitro ved hjelp av en kombinasjon av spesialiserte kultur media og mater celler 1-3.
De fleste in vitro forays i biologi SSCS har avledet cellelinjer fra nyfødte, muligens på grunn av problemer med å skaffe voksne cellelinjer 4. Men fortsetter testis å modne frem ~ 5 ukers alder i de fleste muselinjer. I den tidlige barsel, dramatiske endringer i arkitekturen av testis og i biologi både somatiske og spermatogenic celler, inkludert endringer i uttrykket nivåer av mange stamcelle-relatertegener. Derfor kan neonatally-avledet SSC linjer ikke fullt rekapitulere biologi voksne SSCS som vedvarer etter at voksen testis har nådd en stabil tilstand.
Flere faktorer har hindret produksjonen av voksne SSC linjer historisk. Først, kan andelen av funksjonelle stamceller minke under voksenlivet, enten på grunn av indre eller ytre faktorer 5,6. Videre, som med andre voksne stamceller, har det vært vanskelig å berike SSCS tilstrekkelig fra total voksne testikkelceller uten å bruke en kombinasjon av immunoselection eller andre sortering strategier 7. Vanligvis benyttes strategier omfatter bruk av cryptorchid mus som en kilde for donorceller grunnet en høyere andel av stamceller til andre celletyper 8. Basert på hypotesen om at fjerning av somatiske celler fra den første kulturen forstyrrer interaksjoner med stamcelleforskningen nisje som er avgjørende for SSC overlevelse, vi tidligere utviklet metoder for å utlede voksen lines som ikke krever immunoselection eller cryptorchid givere, men heller ansette seriell anrikning av SSCS i kultur, heretter kalt SESC 2,3.
Metodene beskrevet under innebærer en enkel prosedyre for å utlede voksen SSC linjer ved dissociating voksen donor seminiferøse tubuli, etterfulgt av plettering av celler på forer består av en testicular stromal cellelinje (JK1) 3. Gjennom seriell passaging, sterkt tilhenger, forurensende ikke-kjønnsceller er oppbrukt fra kultur med samtidig anrikning av SSCS. Kulturer produsert på denne måten inneholder en blanding av spermatogonier på ulike stadier av differensiering, inneholder hvilke SSCS, basert på langsiktig selvtillit fornyelse evne. Crux av SESC metoden er at den gir SSCS ta den vanskelige overgangen fra selvfornyelse in vivo til langsiktig selvfornyelse in vitro i en radikalt annerledes mikromiljøet, produserer langsiktige SSC linjer, uten forurensendesomatiske celler, og dermed setter påfølgende eksperimentell manipulasjon av SSCS.
Protocol
1. Utarbeidelse av Feeder Cells
Vær oppmerksom på at alle reagenser som er beskrevet nedenfor bør være forberedt på sterile mote (se tabell 1 og 2). Denne protokollen sysselsetter JK1 cellelinje (Cell Biolabs, Inc., katalog # CBA-315) som forer som er en transformert derivat av voksen mus testikler somatiske celler og har blitt beskrevet andre steder 3. Også oppmerksom på at alle dyr prosedyrer skal utføres i samsvar med institusjonelle retningslinjer og regler.
- JK1 celler kan opprettholdes i kultur og brukt med hell som forer opp til passasjen 39. Kultur JK1 celler i en 100 mm cellekultur parabolen (BD Falcon, katalog # 353003) med 10 ml filter-sterilisert mater dyrkningsmedium (DMEM supplert med 10% føtalt bovint serum [FBS], 2 mM L-glutamin og antibiotika). Når kulturen er 95% samløpet, dele cellene 01:06 -1:10 ratio.
- Fjern medium fra konfluent JK1 mater celle monolag.
- Vask cellelaget gang med PBS uten kalsium og magnesium.
- Legg forvarmede trypsin / EDTA, 1x (0,05% trypsin/0.53 mM EDTA; Corning Cellgro, katalog # 25-051-CI), og inkuber ved 37 ° C i 5-10 min.
- Inaktivere trypsin med et likt volum av mater vekstmedium. Samle celler og sentrifuger ved 300 xg i 5 minutter. Resuspendere cellene i mater vekstmedium.
- Pre-coat flerbrønns cellekultur plater ved å tilsette nok 0,4% gelatinoppløsning for å dekke brønnen og fjerne etter 5 minutter ved romtemperatur.
- Plate ~ 250 celler per mm 2 i gelatin-belagt cellekultur plate (f.eks 48-brønn eller 6-brønns). Inkuber kultur ved 37 ° C i 16 til 24 timer.
- Fjern kulturmedium fra brønner. FORSIKTIG: å inaktivere cellevekst, legge en frisk oppløsning av mitomycin-C ved 10 ug / ml fortynnet i DMEM til hver brønn (dvs. 200 ul / brønn for en 48 brønns plate). Mitomycin-C er giftig. Håndter og kast den med omhu. Inkuber ved37 ° C i 4 timer.
- Fjern mitomycin-C-løsning fra cellene. Vask 3 ganger med DMEM før plating stamceller.
- Fjern DMEM fra materen celler brønner og legger nok stamcelle medium (100 ul / brønn i en 48 brønns plate, se tabell 3) for å hindre uttørking av forer under passaging. Legg SSCS samme dag, som beskrevet nedenfor i avsnitt 3.1 eller 3.4, ved hjelp av angitte størrelser av brønner inneholdende matere.
2. Dissosiasjon av Mouse testikler Tissue skaffer Donor kjønnsceller
- Harvest voksen mus testikler i sterile mote og midlertidig lagring av testiklene i en dekket petriskål (uten væske tilsatt). Parabolen må plasseres umiddelbart på is for å hindre koagulasjon og opprettholde celle levedyktighet.
- Bruke sterile fin pinsett og en fin scissor i cellekultur hette, lage en tverrgående snitt i tunica albuginea uten helt transecting testis (dvs. kutt ~ ½ - ¾ avstand through) og bruke pinsett for å presse ut sædproduserende tubuli i et hjørne av platen, kast tunika og festet vev. Hold platen på isen hele tiden for å holde vev kjølt, og dermed opprettholde sin integritet og hindre fordamping.
- Raskt hakke tubuli med fine våren saks minst 3 min per testikkel, samtidig plate på is.
- Samle tubule fragmenter i en 50 ml konisk rør og vask i ~ 40 ml kjølt PBS / 1% bovint serumalbumin.
- Sentrifuger ved 60 xg i 10 minutter for å skille tubule fragmenter fra sædceller og rusk. Kast supernatant.
- I en 15 ml konisk rør, resuspender pelleten i 3 ml per testikler av forvarmede dissosiasjon buffer (DMEM, 0,05% trypsin, 0,03% kollagenase type I, 80 U / ml DNAse I og 0,5% bovint serumalbumin, se tabell 2 for mer spesifikke detaljer dissosiasjon buffer).
- Plasser koniske røret horisontalt i et stativ i en shaker satt til 150 rpm ved 37 ° C i 15 min for å maksimere engitation.
- Spinner ned ved 60 xg i 10 minutter for å skille enkeltceller fra undissociated biter.
- Lagre pellet inneholdende biter inntil neste trinn. Samle supernatant fra trinn 2.8 og tilsett 3 ml DMEM/10% føtalt bovint serum for å nøytralisere dissosiasjon buffer. Plasser røret på is midlertidig.
- Gjenta trinn 02.06 til 02.07 med den lagrede pellet fra trinn 2,9 til re-fordøye biter igjen etter trinn 2.8.
- Legg et tilsvarende volum med DMEM/10% FBS for å nøytralisere dissosiasjon buffer.
- Rekombinerer suspensjon fra trinn 2,11 med lagret cellesuspensjon fra trinn 2.9. Sentrifuger i 5 minutter ved 300 x g.
- Gjensuspender pellet i stamcelleforskningen medium i et volum på 16 ml per par av testiklene (se tabell 3).
3. Plating av Testicular cellesuspensjon
- Plate 2 ml cellesuspensjon per brønn i en 6-brønners plate som inneholder mater celler mitotisk-inaktivert med mitomycin-C og plasser i en cellekultur inkubator ved 37 &grader, C i 5% CO 2.
- Etter 48 timers, aspirat medium, tilsett 2 ml friskt medium og gå tilbake til inkubatoren.
- Etter 48 hr, tilsett 0,5 ml frisk stamcelle medium til hver brønn og returnere til inkubatoren.
- Etter 48 timer, deretter mate cellene tre ganger per uke etterpå slik til store, diskret kolonier (> 50 celler) vises (innen 7 til 21 dager). For første og andre mate hver uke (f.eks mandag og onsdag) fjern ~ 50% av mediet, og legge tilbake 50% etter volum av friskt medium. For tredje fôring (f.eks fredag), aspirer alle medium og erstatte med 2 ml friskt medium. Denne tilnærmingen er basert på den begrunnelsen at unngåelse av fullstendig medium endringer minimerer svingninger i konsentrasjoner av parakrine signaler som skilles i kulturmediet 9.
4. Koloni Plukke for First Passage
- Fjern medium fra brønner som inneholder kolonier som skal passaged og legge friske stamceller medium.
- Identifisere kolonier med en 10x objektiv. Med mikroskopet litt de-fokusert, vil SSC kolonier ved kanten av brønnen vises som homogene lyse klumper, som består av mange 11-12 mikrometer diameter celler, hvor det er vanskelig eller umulig å skjelne de individuelle celle grenser, siden cellene vises smeltet sammen (figur 1A). Non-SSC kolonier kan være mørkere, mer detaljert, eller mindre homogent, med discernable grenser (figur 1A, innfelt).
- Ved hjelp av en 200 ul pipettespiss med pipetteman satt til 50 ul, først ta opp medium fra brønnen og fordrive å fukte tips. Deretter skubber kolonien med spissen før hurtig uttak 50 ul av medium for å løsne kolonien ved sug inn i tuppen (figur 1B).
- Utvise medium inneholdende kolonien inn en brønn i en 48-brønns plate som inneholder inaktiverte mater celler med 100 ul av stamcelle medium (figur 1C).
- Gjenta trinn4,3 og legge opp til 8 kolonier til samme brønn uten å overskride 500 ul per brønn.
- Gjenta trinn 04.03 til 04.05 for å forberede ytterligere brønner fra 48 brønners plate med passasje en SSC kolonier.
- Brønner vil være klar til å splitte i 7-14 dager eller etter store klumper av opptil 500 celler har dukket (figur 1D).
5. Etterfølgende ekspansjon og Passaging av SSCS etter Utgnidning
- Cellene ved passasje en bør subkultiveres på fersk feeders etter opptil 14 dager ved et deleforhold på 1:2 for de 3 første passasjer og deretter 01:04-01:06 (hver 7. dag) deretter som følger. Forsiktig triturate kolonier off en semi-sammenflytende vel (f.eks ~ 300000 SSCS / brønn av seks-brønners plate) med en 1 ml pipettespiss ved vasking medium over cellene. Kolonier kan sees demontere. For mye kraft med strømmen av væske vil føre til uønskede mater celler å komme av for.
- Samle triturert celler i et konisk rør og sentrifuger ved 300 xg i5 min. Merk: En trypsinisering trinn kan trygt legges her hvis ønsket av utprøver.
- Aspirer supernatant og re-suspendere i frisk stamcelleforskningen medium ved grundig pipettere opp og ned for å forstyrre kolonier.
- Plate SSCS på nylagde mater celler inaktivert med mitomycin-C som beskrevet i punkt 1.
- Mate cellene tre ganger per uke som følger. For første og andre foring (f.eks mandag og onsdag) tilsett 50% etter volum av friskt medium. For tredje fôring (f.eks fredag), aspirer alle medium og erstatte med 2 ml friskt medium. Platene vil bli konfluent i 7-10 dager. Kulturer bør bestå av> 98% kjønnsceller (dvs. <1% forurensende somatiske celler) etter 5-7 passasjer, basert på farging (f.eks ved hjelp av murine bakterie celle markør GCNA) for å skille kjønnsceller fra somatiske celler 10. Merk: Disse metodene ble utviklet i samsvar med forskrifter og krav fastsatt av institusjonenal Animal Care og bruk komité ved Weill Cornell Medical College.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Utseendet av passasjen null villtype, er voksen SSC kolonier etter 7 dager er vist i figur 1. Tredimensjonale kolonier består av et lag av flate celler festet til forer eller streke ekstracellulære matrise avsatt av forer med flere lag av SSCS vokser på toppen. Mens friske SSCS er brightly refraktile og jevnt 11-12 um diameter, cellekantene er vanskelig å skille, og størrelsen av koloniene kan være svært variabel, både inne i og mellom brønner fremstilt fra forskjellige mus. Visualisering av koloniene blir hjulpet av en fase mikroskop med en digital skjerm og en litt de-fokusert fokusplan, noe som forbedrer kontrasten mellom høyt homogene SSC kolonier og forurensende somatiske celler som er tilstede i tidlig passasje (0-2) kulturer og gjøre ikke danne tett pakket kolonier (se figur 1A innfelt). Merk at morfologien av materen cellene endres gradvis after bytter fra DMEM/10% å demme cellekulturmedium etter inaktivering med mitomycin-C.It er også viktig å merke seg at den første cellesuspensjon ikke filtrert eller anstrengt, fordi gjenværende klumper av somatiske celler er antatt å øke overlevelse av SSCS på tidspunktet for innledende plating og bør ikke fjernes før SSC kolonier er etablert. Seriell passaging (> 5-7 ganger) er nødvendig for å rense de kjønnsceller til nær homogenitet (> 98%) og bryter restoljen somatiske celler. Dersom etterfølgende eksperimentene vil spesifikt krever berikelse av stamceller fra totalpopulasjonen av kjønnsceller i kultur, så celleutvalget hjelp immunomagnetiske perler eller strømningscytometri kan benyttes for ytterligere rensing, for eksempel, stamcelle berikelse kan oppnås ved hjelp av antistoffer mot Thy1 , CD9, α6 integrinet og andre 11. Identiteten SSCS bør senere bekreftet ved hjelp av immunfenotyping, genekspresjon, og etter transplantasjon, siden transplantation-analyse er den eneste måten å definitivt vurdere mengden av autentiske, funksjonelle stamceller 12,13.
Figur 1. Morfologi av tidlige SSC kolonier, testiklene stromale celler og matere. A, Utseende av begynnende SSC kolonier ~ 5 dager etter første platekledning. Innfelte viser forurensende monocytt-lignende somatiske celler i en passasje null kultur. B, utvalg og plukking av individuelle kolonier for første passasje (~ 14 dager) i 48-brønners plater. Den svarte strukturen er pipettespissen. C, Utseende av inaktiverte JK1 mater celler. D, Store kolonier før rutine subculturing. Pilene angir SSC kolonier. Målestokk i A er 100 mikrometer (innfelt, 50 mikrometer) og i BD er 200 mikrometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne metoden for å utlede voksne SSCS med voksne testis-avledet mater celler er robust og har lykkes når vanlige genetiske bakgrunn (f.eks FVB, C57Bl6 og blandet 129SV/C57Bl/6) og ulike mutantstammer var ansatt 2,3,7,14. Faktisk er mikromiljøet skapt av kulturen systemet tilstrekkelig til å overvinne noen av de genetiske barrierer til å opprettholde voksen SSCS in vivo (for eksempel ved av plzf - / - dyr) 7. Mens vi bruker JK1 celler som forer, kan ikke-transformerte voksne testikler somatiske celler også brukes med lik effekt som JK1 celler 2,3.
SESC designet for å effektivt få langsiktige voksne SSC linjer. Dessverre er høy effektivitet oppnås med en trade-off av følgende grunn. En merkbar begrensning av prosedyren er at utelatelsen av en filtrering eller straining trinn på tidspunktet for innledende Plating og manipulering at procedure innebærer, noe som kan påvirke celle overlevelse, kan forårsake betydelig variasjon i celle tall belagt fra brønn til godt, noe som utelukker effektiv kvantifisering på scenen for første koloni formasjon. Imidlertid kan kvantitative bestemmelser utføres med litt senere passasje kulturer ved hvilket tidspunkt en enkel cellesuspensjon kan lett fremstilles ved standard trypsinisering (> passasje 5-7).
Fordi voksne SSCS i kultur kan utvides og opprettholdt nesten uendelige, muliggjør denne protokollen en effektiv produksjon av cellelinjer som kan brukes senere på en lignende måte til andre etablerte primære kulturer eller cellelinjer (dvs. gen og protein expression analyser eller ektopisk uttrykk for et gen av interesse). Likevel er det viktig å slutt bekrefte resultater ved hjelp av transplantasjon analyse som gullstandarden eller annen validert surrogat analysen, som SSC klyngen formasjonen analysen 12,15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
MS får royalties fra Weill Cornell Medical College gjennom en lisens til Cell Biolabs, Inc. til å distribuere JK1 celler.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av New York State Department of Health (C026878). MS var en New York Stem Cell Foundation-Druckenmiller Fellow. Støttes delvis av Research Grant No 5-FY11-571 fra March of Dimes Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Corning | 10-013 | Diluent for dissociation buffer |
| Trypsin/EDTA | Mediatech | 25-051-CI | |
| Stem cell base medium (StemPro-34) | Life Technologies | 10639-011 | Requires supplementation as per Shinohara et al. (2003)* |
| Stem cell medium supplements | various | see Table 3 | Requires supplementation as per Shinohara et al. (2003)* |
| JK1 cells | Cell Biolabs, Inc. | CBA-315 | Can substitute with adult testicular stromal cells as per Seandel et al. (2007) |
| mitomycin-C (CAUTION) | Sigma-Aldrich | M4287 | Toxic; Handle with care. |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | 0.4% solution in water |
| EVOS xl digital inverted microscope | Advanced Microscopy Group | - | |
| Table 1. Specific reagents and equipment. *See Table 3 |
|||
| DMEM | Corning | 10-013 | Diluent for dissociation buffer |
| trypsin (1:250) | Life Technologies | 27250-018 | Dissociation buffer: Final 0.05% wt/vol |
| collagenase, type I, 235 U/ml | Worthington | CLS1 235 | Dissociation buffer: Final 0.03% wt/vol |
| DNAse I | Sigma-Aldrich | DN25 | Dissociation buffer: Final 80 U/ml |
| bovine serum albumin | ICP Bio | ABRE-100g | Dissociation buffer: Final 0.5% wt/vol |
| Table 2. Dissociation buffer | |||
| StemPro-34 SFM | Life Technologies | 10639-011 | |
| StemPro-34 Nutrient supplement | Life Technologies | 10639-011 | |
| Additional supplements** | |||
| Non-essential amino acids | Sigma-Aldrich | M7145 | 1X |
| MEM Vitamin solution | Life Technologies | 11120-052 | 1X |
| L-glutamine | Mediatech | 25-005 | 2 mM |
| bovine serum albumin | ICP Bio | ABRE | 0.50% |
| Antibiotic-Antimycotic Solution | Mediatech | 30-004-CI | 1X |
| D(+)glucose | Sigma-Aldrich | G8769 | 6 mg/ml |
| β-estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 | 30 ng/ml |
| progesterone | Calbiochem | 5341 | 60 ng/ml |
| fetal bovine serum | variable | n/a | 1% |
| bovine holo-transferrin | Sigma-Aldrich | T1283 | 100 μg/ml |
| insulin | Gemini Bio-Products | 700-112P | 25 μg/ml |
| human GDNF | Life Technologies | PHC7041 | 10 ng/ml |
| human bFGF | Life Technologies | PHG0023 | 10 ng/ml |
| mouse EGF | Life Technologies | PHG0313 | 20 ng/ml |
| putrescine | Research Organics | 0778P | 60 μM |
| sodium Selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | 30 nM |
| pyruvic acid | Alfa Aesar | A13875 | 30 μg/ml |
| DL-lactic acid | J.T. Baker | 0196-04 | 1 μg/ml |
| β-mercapt–thanol | Life Technologies | 21985-023 | 50 μM |
| ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | 100 μM |
| D-biotin | Sigma-Aldrich | B4639 | 10 μg/ml |
| Table 3. Stem cell medium | |||
| *Note: Add supplements below before using medium. Filter sterilize and keep it at 4 °C. The medium is stable for at least 2 weeks. | |||
| **We have employed different manufacturers, formulations, and/or lot numbers of these reagents without any apparent deleterious effects. In general, cell culture grade reagents should be employed. | |||
References
- Kanatsu-Shinohara, M., et al. Long-term proliferation in culture and germline transmission of mouse male germline stem cells. Biol. Reprod. 69, 612-616 (2003).
- Seandel, M., et al. Generation of functional multipotent adult stem cells from GPR125+ germline progenitors. Nature. 449, 346-350 (2007).
- Kim, J., Seandel, M., Falciatori, I., Wen, D., Rafii, S. CD34+ testicular stromal cells support long-term expansion of embryonic and adult stem and progenitor cells. Stem Cells. 26, 2516-2522 (2008).
- Ogawa, T., et al. Derivation and morphological characterization of mouse spermatogonial stem cell lines. Arch. Histol. Cytol. 67, 297-306 (2004).
- Schmidt, J. A., et al. In vivo and in vitro aging is detrimental to mouse spermatogonial stem cell function. Biology of Reproduction. 84, 698-706 (2011).
- Zhang, X., Ebata, K. T., Robaire, B., Nagano, M. C. Aging of male germ line stem cells in mice. Biology of Reproduction. 74, 119-124 (2006).
- Hobbs, R. M., Seandel, M., Falciatori, I., Rafii, S., Pandolfi, P. P. Plzf regulates germline progenitor selfrenewal by opposing mTORC1. Cell. 142, 468-479 (2010).
- Nagano, M., Ryu, B. Y., Brinster, C. J., Avarbock, M. R., Brinster, R. L. Maintenance of mouse male germ line stem cells in vitro. Biol. Reprod. 68, 2207-2214 (2003).
- Csaszar, E., et al. Rapid expansion of human hematopoietic stem cells by automated control of inhibitory feedback signaling. Cell Stem Cell. 10, 218-229 (2012).
- Enders, G. C., May, J. J. Developmentally regulated expression of a mouse germ cell nuclear antigen examined from embryonic day 11 to adult in male and female. 163, 331-340 (1994).
- Oatley, J. M., Brinster, R. L. Regulation of spermatogonial stem cell self-renewal in mammals. Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 263-286 (2008).
- Brinster, R. L., Zimmermann, J. W. Spermatogenesis following male germ-cell transplantation. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 91, 11298-11302 (1994).
- Tang, L., Rodriguez-Sosa, J. R., Dobrinski, I. Germ Cell Transplantation and Testis Tissue Xenografting in Mice. J. Vis. Exp. (60), e3545 (2012).
- Arnold, K., et al. Sox2(+) adult stem and progenitor cells are important for tissue regeneration and survival of mice. Cell Stem Cell. 9, 317-329 (2011).
- Yeh, J. R., Zhang, X., Nagano, M. C. Establishment of a short-term in vitro assay for mouse spermatogonial stem cells. Biology of Reproduction. 77, 897-904 (2007).
