Summary
Un metodo semplice per ottenere e mantenere spermatogoni staminali e linee di cellule progenitrici da topi adulti è presentato qui. Il metodo utilizza cellule di alimentazione provenienti dal compartimento delle cellule somatiche del testicolo di topo adulto. Questa tecnica è applicabile ai ceppi di topi comuni, tra cui transgenici, knock-out e knock-nei topi.
Abstract
Staminali spermatogoni e cellule progenitrici (SSC) del testicolo rappresentano un classico esempio di cellule staminali di mammifero e preservare la fertilità per quasi tutta la vita dell'animale. Mentre i precisi meccanismi che governano self-renewal e la differenziazione in vivo sono difficili da studio, vari sistemi sono stati sviluppati in precedenza per propagare SSC murini in vitro utilizzando una combinazione di terreni di coltura e le cellule specializzate alimentazione 1-3.
La maggior parte in incursioni in vitro sulla biologia della SSC hanno linee cellulari derivate da neonati, probabilmente a causa della difficoltà di ottenere linee di cellule adulte 4. Tuttavia, il testicolo continua a maturare fino a ~ 5 settimane di età in ceppi maggior parte dei mouse. Nel primo periodo post-natale, si verificano cambiamenti drammatici nell'architettura dei testicoli e nella biologia delle cellule somatiche e sia spermatogenesi, incluse alterazioni nei livelli di espressione di cellule staminali numerosi correlatageni. Pertanto, neonatale-derivati linee SSC potrebbero non ricapitolare la biologia della SSC adulti che persistono dopo che il testicolo adulto ha raggiunto uno stato stazionario.
Diversi fattori hanno ostacolato la produzione di linee per adulti SSC storicamente. In primo luogo, la proporzione di cellule staminali funzionali può diminuire durante l'età adulta, a causa di fattori intrinseci o estrinseci 5,6. Inoltre, come con altre cellule staminali adulte, è stato difficile per arricchire SSCs sufficientemente da cellule adulte totale testicolari senza utilizzare una combinazione di immunoselezione o altre strategie di smistamento 7. Strategie comunemente impiegati comprendono l'uso di topi criptorchidi come fonte di cellule del donatore a causa di un alto rapporto di cellule staminali per altri tipi di cellule 8. Basata sull'ipotesi che la rimozione di cellule somatiche dalla coltura iniziale interrompe interazioni con la nicchia delle cellule staminali che sono essenziali per la sopravvivenza SSC, abbiamo precedentemente sviluppato metodi per derivare l adultoines che non richiedono immunoselezione o donatori criptorchidi ma piuttosto impiegano arricchimento di serie SSC nella cultura, di seguito denominata SESC 2,3.
Il metodo descritto di seguito comporta una semplice procedura per derivare adulti linee SSC dissociandosi adulto donatore tubuli seminiferi, seguito da placcatura su linee di cellule comprendenti una linea di cellule stromali testicolare (JK1) 3. Attraverso seriale passaging, fortemente aderente, contaminando le cellule germinali non sono esaurite dalla coltura con arricchimento concomitante di SSC. Culture prodotti in questo modo contengono una miscela di spermatogoni a diversi stadi di differenziazione, che contengono SSCS, basato su lungo termine capacità di rinnovamento del sé. Il punto cruciale del metodo SESC è che consente CSS per rendere la difficile transizione da self-renewal in vivo a lungo termine di auto-rinnovamento in vitro in un microambiente radicalmente diverso, produce a lungo termine linee SSC, libero di contaminarecellule somatiche, e consentendo in tal modo la successiva manipolazione sperimentale di SSC.
Protocol
1. Preparazione di cellule feeder
Si noti che tutti i reagenti descritti di seguito devono essere preparati in modo sterile (vedi tavole 1 e 2). Questo protocollo utilizza la linea JK1 cella (Cell Biolabs, Inc., catalogo # CBA-315) come alimentatori che è un derivato trasformata di topo adulto testicolari cellule somatiche ed è stato descritto altrove 3. Si noti inoltre che tutte le procedure di polizia devono essere eseguite in conformità con le linee guida istituzionali e dei regolamenti.
- JK1 cellule possono essere mantenute in coltura e usato con successo come alimentatori fino al passaggio 39. Cultura JK1 cellule in un piatto di coltura cellulare 100 mm (BD Falcon, catalogo # 353.003) con 10 ml di mezzo alimentatore sterilizzata a filtro crescita (DMEM supplementato con 10% di siero fetale bovino [FBS], 2 mM L-glutammina e antibiotici). Quando la cultura raggiunge il 95% di confluenza, dividere le celle 1:06 -1:10 rapporto.
- Estrarre il supporto dal confluente JK1 mono alimentatore cellastrato.
- Lavare strato di cellule una volta con PBS senza calcio e magnesio.
- Aggiungi preriscaldato tripsina / EDTA, 1x (0,05% trypsin/0.53 mM EDTA; Corning Cellgro, catalogo # 25-051-CI), e incubare a 37 ° C per 5-10 minuti.
- Inattivare la tripsina con un volume uguale di mezzo di crescita alimentatore. Raccogliere le cellule e centrifugare a 300 xg per 5 min. Risospendere le cellule in terreno di crescita alimentatore.
- Pre-coat multi-pozzetti piastre cella aggiungendo abbastanza 0,4% soluzione di gelatina per coprire il bene e togliere dopo 5 min a temperatura ambiente.
- Piatto ~ 250 cellule per millimetro 2 in gelatina rivestita con piastra di coltura cellulare (ad esempio, in formato a 48 pozzetti o 6-bene). Incubare coltura a 37 ° C per 16 a 24 ore.
- Togliere terreno di coltura da pozzi. ATTENZIONE: Per inattivare crescita cellulare, aggiungere una soluzione fresca di mitomicina-C a 10 ug / ml diluito in DMEM a ciascun pozzetto (200 pl / pozzetto di una piastra da 48 pozzetti). Mitomicina-C è tossico. Maneggiate e smaltite con cura. Incubare a37 ° C per 4 h.
- Rimuovere mitomicina-C soluzione da cellule. Lavare 3 volte con DMEM prima placcatura cellule staminali.
- Rimuovere DMEM dall'alimentatore cellule pozzetti e aggiungere abbastanza cellule staminali media (100 pl / pozzetto di una piastra da 48 pozzetti, vedi Tabella 3) per prevenire l'essiccamento delle mangiatoie durante passaging. Aggiungi CSS lo stesso giorno, come descritto di seguito nelle sezioni 3.1 o 3.4, utilizzando le dimensioni indicate di pozzetti contenenti alimentatori.
2. La dissociazione del tessuto mouse Testicolo ottenere cellule germinali dei donatori
- Harvest testicoli di topo adulto in modo sterile e memorizzare temporaneamente i testicoli in una capsula di Petri coperto (senza liquido aggiunto). Il piatto deve posto immediatamente in ghiaccio per evitare essiccazione e mantenere la vitalità cellulare.
- Utilizzando una pinza sottile sterili e una forbice fine in una cappa di coltura cellulare, fare una incisione trasversale nella tunica albuginea completamente senza sezionare il testicolo (cioè tagliato ~ ½ - ¾ distanza through) e usare il forcipe per spremere tubuli seminiferi in un angolo della piastra, tunica degli scarti e dei tessuti allegato. Tenere piastra su ghiaccio in tutto per tenere il tessuto fresco, mantenendo così la sua integrità e prevenire l'evaporazione.
- Rapidamente tritare tubuli con le forbici a molla sottili almeno 3 minuti al testicolo, mantenendo piastra su ghiaccio.
- Raccogliere i frammenti di tubuli in un tubo da 50 ml e lavare in ~ 40 ml di siero refrigerati PBS / 1% di albumina bovina.
- Centrifugare a 60 xg per 10 min per separare frammenti tubulari da spermatozoi e detriti. Gettare il surnatante.
- In una provetta conica da 15 ml, risospendere il pellet in 3 ml per testis di pre-riscaldato dissociazione buffer (DMEM, 0,05% tripsina, collagenasi tipo I 0,03%, 80% U / ml di DNasi I e 0,5 albumina di siero bovino; Vedi Tabella 2 per i dettagli più specifici di dissociazione buffer).
- Posizionare il tubo conico orizzontalmente in un rack in un insieme agitatore a 150 rpm a 37 ° C per 15 minuti per massimizzare unagitation.
- Centrifugare a 60 xg per 10 min per separare singole cellule di pezzi non dissociato.
- Salvare i pezzi di pellet contenenti fino alla fase successiva. Raccogliere il supernatante dal passo 2,8 e aggiungere 3 ml DMEM/10% di siero fetale bovino per neutralizzare buffer di dissociazione. Porre la provetta in ghiaccio temporaneamente.
- Ripetere il passaggio 2,6-2,7 con il pellet salvato dal punto 2.9 a ri-digerire pezzi rimanenti dopo la fase 2.8.
- Aggiungere un volume uguale di DMEM/10% FBS per neutralizzare tampone di dissociazione.
- Sospensione ricombinare dal punto 2,11 con sospensione cellulare salvato dal punto 2.9. Centrifugare per 5 minuti a 300 x g.
- Risospendere il pellet in media di cellule staminali in un volume di 16 ml per ogni coppia di testicoli (vedi Tabella 3).
3. Placcatura di sospensione cellulare testicolare
- Piastra 2 ml di sospensione cellulare per pozzetto in un 6-pure cellule feeder piastra contenente mitoticamente-inattivato con mitomicina-C e posto in un incubatore per colture cellulari a 37 ° C in 5% CO 2.
- Dopo 48 ore, mezzo aspirato, aggiungere 2 ml di terreno fresco e tornare alla incubatrice.
- Dopo 48 ore, aggiungere 0,5 ml di terreno fresco di cellule staminali in ciascun pozzetto e tornare alla incubatrice.
- Dopo 48 ore, successivamente nutrire le cellule tre volte alla settimana, successivamente segue come di grandi dimensioni, fino a quando le colonie discrete (> 50 cellule) appaiono (entro 7 a 21 giorni). Per prima e la seconda alimentazione di ogni settimana (ad esempio, Lunedi e Mercoledì) rimuovere circa il 50% del mezzo e aggiungere di nuovo il 50% in volume di terreno fresco. Per l'alimentazione terzo (ad es Venerdì), aspirare tutte di medie e sostituire con 2 ml di terreno fresco. Questo approccio si basa sul razionale che completi evitare cambiamenti medi minimizza le fluttuazioni nelle concentrazioni di segnali paracrini che vengono secrete nel mezzo di coltura 9.
4. Picking Colony per primo passaggio
- Estrarre il supporto dalle colonie pozzi contenenti da diversi passaggi e aggiungere fresco medio di cellule staminali.
- Identificare le colonie con un obiettivo 10x. Con il microscopio leggermente de-focalizzato, colonie SSC a bordo del pozzo apparirà come macchie luminose omogenee, comprendenti cellule 11-12 micron molti diametro, in cui è difficile o impossibile distinguere i confini delle singole celle, poiché le cellule appaiono fusi insieme (Figura 1A). Non SSC colonie possono apparire più scuro, più granulare, o meno omogeneo, con bordi distinguibili (Figura 1A, nel riquadro).
- Utilizzando una punta di 200 microlitri pipetta, con il set pipetteman a 50 microlitri, togli prima la media dal pozzo ed espellere a bagnare la punta. Poi, delicatamente spostare la colonia con la punta prima di ritirare rapidamente 50 microlitri di terreno di spostare la colonia di aspirazione nella punta (Figura 1B).
- Espellere il supporto contenente la colonia in un pozzetto di una piastra a 48 pozzetti contenenti cellule feeder inattivate con 100 pl di mezzo di cellule staminali (Figura 1C).
- Ripetere il passaggio4.3 e aggiungere fino a 8 colonie per il bene stesso, senza superare 500 microlitri per pozzetto.
- Ripetere i passaggi 4,3-4,5 per preparare pozzi della piastra da 48 pozzetti con passaggio uno colonie SSC.
- Wells sarà pronto a dividere in 7-14 giorni o dopo grandi gruppi di fino a 500 cellule sono emerse (Figura 1D).
5. Successiva espansione e passaging di SSC per triturazione
- Cellule al passaggio uno dovrebbe essere subcoltura su alimentatori fresche dopo fino a 14 giorni a una rapporto di divisione di 1:2 per i primi 3 passaggi e poi 1:04-01:06 (ogni 7 giorni) successivamente come segue. Delicatamente triturare colonie fuori un semi-confluente pozzetto (es. ~ 300.000 SSC / pozzetto della piastra da 6 pozzetti) con una punta di pipetta 1 ml lavando media tra le celle. Le colonie possono essere visti distacco. Forzare troppo con il flusso di liquido causerà cellule feeder indesiderate a venire fuori troppo.
- Raccogliere cellule triturato in una provetta conica e centrifugare a 300 xg per5 min. Nota: Un passo tripsinizzazione può essere tranquillamente aggiunto qui, a discrezione del ricercatore.
- Aspirare il surnatante e risospendere in mezzo fresco di cellule staminali da fondo pipettando su e giù per distruggere le colonie.
- SSC piastra su cellule di alimentazione preparati al momento inattivati con mitomicina-C, come descritto nella sezione 1.
- Alimentare cellule tre volte alla settimana come segue. Per l'alimentazione prima e la seconda (ad esempio, Lunedi e Mercoledì) aggiungere 50% in volume di terreno fresco. Per l'alimentazione terzo (ad es Venerdì), aspirare tutte di medie e sostituire con 2 ml di terreno fresco. Le piastre saranno confluenti in 7-10 giorni. Le colture devono essere costituiti da cellule germinali> 98% (vale a dire, <1% di cellule somatiche contaminanti) dopo passaggi 5-7, basato su immunocolorazione (ad esempio, utilizzando il murino della cellula germinale marcatore GCNA) per distinguere le cellule germinali a partire da cellule somatiche 10. Nota: Questi metodi sono stati sviluppati in conformità alle norme e ai requisiti stabiliti dall'IstituzioneCura degli animali e al comitato di uso al Weill Cornell Medical College.
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Representative Results
La comparsa di passaggio per lo zero di tipo selvatico, adulti colonie SSC dopo 7 giorni è mostrato in Figura 1. Tridimensionali colonie sono costituiti da uno strato di cellule piatte attaccate agli alimentatori o della matrice extracellulare underling depositati dagli alimentatori con strati multipli di SSCs crescono sopra. Mentre SSCs sani sono luminose e rifrangenti uniformemente 11-12 micron di diametro, i bordi delle celle sono difficili da distinguere e la dimensione delle colonie possono essere altamente variabile, sia all'interno del pozzo e tra pozzetti preparate da topi differenti. Visualizzazione delle colonie è aiutato da un microscopio a fase con un display digitale e un piano leggermente de-focalizzato focale, che esalta il contrasto tra altamente omogenei colonie SSC e contaminanti cellule somatiche presenti nel passaggio precoce (0-2) culture e fare non formano colonie, serrato (si veda la Figura 1A riquadro). Notare che la morfologia delle cellule feeder cambierà gradualmente after passaggio da DMEM/10% di arginare terreno di coltura cellulare dopo inattivazione con mitomicina-C.It è anche importante notare che la sospensione cellulare iniziale non viene filtrato o teso, perché ciuffi residui di cellule somatiche sono pensati per favorire la sopravvivenza di SSC a il tempo di placcatura iniziale e non deve essere rimosso fino colonie SSC sono stabiliti. Serial passaging (> 5-7 volte) è necessario per purificare le cellule germinali alla quasi omogeneità (> 98%) e riducono residue cellule somatiche. Se esperimenti successivi saranno specificatamente richiedono arricchimento di cellule staminali dalla popolazione totale di cellule germinali nella cultura, allora la selezione cella utilizzando sfere immunomagnetiche o citometria di flusso possono essere impiegati per ulteriore purificazione, per esempio, cellule staminali arricchimento può essere ottenuta utilizzando anticorpi contro Thy1 , CD9, α6 integrina e altri 11. L'identità di SSC deve essere successivamente confermata utilizzando immunofenotipizzazione, espressione genica, e da trapianto, in quanto transplantatanalisi di ioni è l'unico mezzo per valutare definitivamente la quantità di cellule staminali, autentici funzionali 12,13.
Figura 1. Morfologia delle prime colonie SSC, testicoli cellule stromali e alimentatori. A, Aspetto di nascenti colonie SSC ~ 5 giorni dopo la placcatura iniziale. Spettacoli Inset contaminanti monociti-come le cellule somatiche in una cultura pari a zero. Passaggio B, di selezione e di raccolta delle singole colonie per primo passaggio (~ 14 giorni) in 48 pozzetti. La struttura nera è la punta della pipetta. C, Aspetto di inattivate JK1 cellule di alimentazione. D, numerose colonie prima subcoltura di routine. Le frecce indicano le colonie SSC. Barra di scala in A è di 100 micron (ad incasso, 50 micron) e in BD è di 200 micron.
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Discussion
Questo metodo per derivare SSC adulti con adulti testicolo derivate da cellule di alimentazione è robusto ed è riuscita quando comuni background genetico (ad esempio FVB, C57Bl6 e misti 129SV/C57Bl/6) e diversi ceppi mutanti sono stati impiegati 2,3,7,14. Infatti, il microambiente creato dal sistema di coltura è sufficiente a superare alcune delle barriere genetiche per mantenere SSCs adulti in vivo (ad esempio nel caso di PLZF - / - animali) 7. Mentre impieghiamo JK1 celle come alimentatori, non trasformate adulti testicolari cellule somatiche può essere utilizzato anche con pari efficacia come JK1 cellule 2,3.
SESC è stato progettato per ottenere in modo efficiente a lungo termine adulti linee SSC. Sfortunatamente, l'elevata efficienza viene ottenuta con un trade-off per il seguente motivo. Una notevole limitazione della procedura è che l'omissione di una fase di filtraggio o tensione al momento della placcatura iniziale e la manipolazione che l'immissioe comporta, che può influenzare la sopravvivenza cellulare, può causare una sostanziale variabilità nel numero delle cellule piastrate da pozzetto a pozzetto, che preclude quantificazione efficace nella fase iniziale di formazione di colonie. Tuttavia, analisi quantitative può essere eseguita con colture passaggio leggermente posteriore momento in cui una sospensione singola cellula possono essere facilmente preparati mediante tripsinizzazione standard (> passaggio 5-7).
Poiché SSCs adulto in coltura può essere espanso e mantenuto pressoché all'infinito, questo protocollo consente la produzione efficiente di linee cellulari che possono essere utilizzati successivamente in un modo simile ad altre colture primarie stabilite o linee cellulari (ossia analisi di espressione genica e proteica o espressione ectopica di un gene di interesse). Tuttavia, è essenziale confermare infine risultati utilizzando analisi trapianto come standard o un altro saggio surrogato convalidato, come il saggio di formazione di cluster SSC 12,15.
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Disclosures
MS riceve canoni da Weill Cornell Medical College di attraverso una licenza to Cell Biolabs, Inc. per la distribuzione JK1 cellule.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dal New York State Department of Health (C026878). MS è stato a New York Stem Cell Foundation-Druckenmiller Fellow. Sostenuto in parte da assegno di ricerca n ° 5-FY11-571 dal March of Dimes Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Corning | 10-013 | Diluent for dissociation buffer |
| Trypsin/EDTA | Mediatech | 25-051-CI | |
| Stem cell base medium (StemPro-34) | Life Technologies | 10639-011 | Requires supplementation as per Shinohara et al. (2003)* |
| Stem cell medium supplements | various | see Table 3 | Requires supplementation as per Shinohara et al. (2003)* |
| JK1 cells | Cell Biolabs, Inc. | CBA-315 | Can substitute with adult testicular stromal cells as per Seandel et al. (2007) |
| mitomycin-C (CAUTION) | Sigma-Aldrich | M4287 | Toxic; Handle with care. |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | 0.4% solution in water |
| EVOS xl digital inverted microscope | Advanced Microscopy Group | - | |
| Table 1. Specific reagents and equipment. *See Table 3 |
|||
| DMEM | Corning | 10-013 | Diluent for dissociation buffer |
| trypsin (1:250) | Life Technologies | 27250-018 | Dissociation buffer: Final 0.05% wt/vol |
| collagenase, type I, 235 U/ml | Worthington | CLS1 235 | Dissociation buffer: Final 0.03% wt/vol |
| DNAse I | Sigma-Aldrich | DN25 | Dissociation buffer: Final 80 U/ml |
| bovine serum albumin | ICP Bio | ABRE-100g | Dissociation buffer: Final 0.5% wt/vol |
| Table 2. Dissociation buffer | |||
| StemPro-34 SFM | Life Technologies | 10639-011 | |
| StemPro-34 Nutrient supplement | Life Technologies | 10639-011 | |
| Additional supplements** | |||
| Non-essential amino acids | Sigma-Aldrich | M7145 | 1X |
| MEM Vitamin solution | Life Technologies | 11120-052 | 1X |
| L-glutamine | Mediatech | 25-005 | 2 mM |
| bovine serum albumin | ICP Bio | ABRE | 0.50% |
| Antibiotic-Antimycotic Solution | Mediatech | 30-004-CI | 1X |
| D(+)glucose | Sigma-Aldrich | G8769 | 6 mg/ml |
| β-estradiol | Sigma-Aldrich | E2758 | 30 ng/ml |
| progesterone | Calbiochem | 5341 | 60 ng/ml |
| fetal bovine serum | variable | n/a | 1% |
| bovine holo-transferrin | Sigma-Aldrich | T1283 | 100 μg/ml |
| insulin | Gemini Bio-Products | 700-112P | 25 μg/ml |
| human GDNF | Life Technologies | PHC7041 | 10 ng/ml |
| human bFGF | Life Technologies | PHG0023 | 10 ng/ml |
| mouse EGF | Life Technologies | PHG0313 | 20 ng/ml |
| putrescine | Research Organics | 0778P | 60 μM |
| sodium Selenite | Sigma-Aldrich | S5261 | 30 nM |
| pyruvic acid | Alfa Aesar | A13875 | 30 μg/ml |
| DL-lactic acid | J.T. Baker | 0196-04 | 1 μg/ml |
| β-mercapt–thanol | Life Technologies | 21985-023 | 50 μM |
| ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | 100 μM |
| D-biotin | Sigma-Aldrich | B4639 | 10 μg/ml |
| Table 3. Stem cell medium | |||
| *Note: Add supplements below before using medium. Filter sterilize and keep it at 4 °C. The medium is stable for at least 2 weeks. | |||
| **We have employed different manufacturers, formulations, and/or lot numbers of these reagents without any apparent deleterious effects. In general, cell culture grade reagents should be employed. | |||
References
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