Seriële Verrijking van spermatogonia stam-en progenitorcellen (SSC's) in cultuur voor het afleiden van lange termijn Adult Mouse SSC Lines

Summary

Een eenvoudige methode voor het afleiden van en onderhouden van SSC en stamceltransplantatie lijnen van volwassen muizen wordt hier gepresenteerd. De werkwijze gebruikt voedingscellen afkomstig van de somatische cel compartiment van de volwassen muis testis. Deze techniek is voor het gemeenschappelijk muizenstammen, inclusief transgene, knock-out en knock-in muizen.

Abstract

SSC en progenitorcellen (SSC) van de testis zijn een klassiek voorbeeld van volwassen zoogdier stamcellen en behouden vruchtbaarheid bijna de levensduur van het dier. Hoewel de precieze mechanismen die zelfvernieuwing en differentiatie regeren in vivo zijn uitdagend om te studeren, zijn er verschillende systemen zijn eerder ontwikkeld voor muriene SSC's in vitro met behulp van een combinatie van gespecialiseerde cultuurmedia en feeder cellen ^{1 tot 3} propageren.

De meeste in vitro uitstapjes naar de biologie van SSCs zijn afgeleide cellijnen van pasgeborenen, mogelijk vanwege de moeilijkheid om volwassen cellijnen ^4. De testis verder te rijpen tot ~ 5 weken oud in de meeste muizenstammen. In de vroege postnatale periode dramatische veranderingen in de architectuur van de testis en de biologie van zowel somatische cellen en spermatogenese, met inbegrip van wijzigingen in expressieniveaus van tal stamcel-gerelateerdegenen. Daarom kan neonataal afgeleide SSC lijnen niet volledig herhalen de biologie van volwassen SSC's die blijven bestaan ​​na de volwassen testis heeft bereikt een steady state.

Verschillende factoren hebben gehinderd de productie van volwassen SSC lijnen historisch. Ten eerste kan de verhouding van functionele stamcellen afnemen in volwassenheid, hetzij door intrinsieke of extrinsieke factoren ^5,6. Zoals met andere volwassen stamcellen, was het moeilijk voldoende verrijking van SSCs totale volwassen zaadcellen zonder een combinatie van immunoselectie of sorteren strategieën ^7. Gewoonlijk toegepast omvatten het gebruik van cryptorchide muizen als bron van donor cellen door een hogere verhouding van stamcellen om andere celtypen ^8. Gebaseerd op de hypothese dat de verwijdering van somatische cellen van het oorspronkelijke kweek interacties met de stamcellen niche die essentieel zijn voor overleving SSC verstoort, we eerder ontwikkelde methoden voor het afleiden volwassen lines die geen immunoselectie of cryptorchide donoren, maar eerder in dienst seriële verrijking van SSC's in de cultuur, hierna te noemen SESC ^2,3.

De hieronder beschreven methode brengt een eenvoudige procedure voor het afleiden van volwassen SSC lijnen door dissociëren volwassen donor testes, gevolgd door platen van cellen op feeders bestaat uit een testiculaire stromale cellijn (JK1) ^3. Door middel van seriële passage, sterk hechtende, niet-vervuilende kiemcellen worden uitgeput uit de cultuur met bijkomende verrijking van SSC's. Culturen die op deze wijze een mengsel van spermatogonia in verschillende stadia van differentiatie, die bevatten SSCs, gebaseerd op lange termijn zelfvernieuwing vermogen. De kern van de SESC methode is dat het SSC's in staat stelt om de moeilijke overgang van zelf-vernieuwing in vivo te maken op de lange termijn zelfvernieuwing in vitro in een radicaal andere micro-omgeving, produceert lange termijn SSC lijnen, vrij van verontreinigendesomatische cellen, en op basis waarvan daaropvolgende experimentele manipulatie van SSC.

Protocol

1. Bereiding van voedingscellen

Merk op dat alle reagentia hieronder beschreven worden bereid in steriele wijze (zie tabellen 1 en 2). Dit protocol maakt gebruik van de JK1 cellijn (Cell Biolabs, Inc, catalogus # CBA-315) als feeders die een getransformeerde afgeleide van volwassen muis testiculaire somatische cellen en elders is ³ beschreven. Merk ook op dat alle dierlijke procedures moeten worden uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele richtlijnen en voorschriften.

1. JK1 cellen kunnen in cultuur worden gehouden en met succes gebruikt als voeders tot doorgang 39. Cultuur JK1 cellen in een 100 mm celkweekschaal (BD Falcon, catalogus # 353003) met 10 ml filter gesteriliseerd feeder groeimedium (DMEM aangevuld met 10% foetaal bovine serum [FBS], 2 mM L-glutamine en antibiotica). Wanneer de cultuur 95% confluentie bereikt, splitsen de cellen 1:06 -1:10 verhouding.
2. Verwijder medium van samenvloeiende JK1 feeder cel monolaag.
3. Eenmaal wassen met cellaag PBS zonder calcium en magnesium.
4. Voeg voorverwarmde trypsine / EDTA, 1x (0,05% trypsin/0.53 mM EDTA; Corning Cellgro, catalogus nr. 25-051-CI), en incuberen bij 37 ° C gedurende 5-10 minuten.
5. Inactiveren trypsine met een gelijk volume van feeder groeimedium. Verzamel cellen en centrifugeer bij 300 xg gedurende 5 minuten. Resuspendeer cellen in feeder groeimedium.
6. Grondlaag multi-well platen celkweek door toevoegen van voldoende 0,4% gelatine oplossing te dekken de put en na 5 min bij kamertemperatuur verwijderen.
7. Plaat ~ 250 cellen per ^mm2 in gelatine beklede celkweekplaat (bijv. 48-well of 6-well formaat). Incubeer kweek bij 37 ° C gedurende 16 tot 24 uur.
8. Verwijder kweekmedium uit putten. WAARSCHUWING: celgroei inactiveren, voeg een verse oplossing van mitomycine-C bij 10 ug / ml verdund in DMEM aan elk putje (bijv. 200 ul / putje van een 48 well plaat). Mitomycine-C is giftig. Worden gehanteerd en afgevoerd met zorg. Incubeer bij37 ° C gedurende 4 uur.
9. Verwijderen mitomycine-C oplossing van cellen. 3 keer wassen met DMEM vóór plating stamcellen.
10. Verwijderen van DMEM voedingscellen putjes en voeg genoeg stamcellen medium (100 ul / putje van een 48 well plaat, zie Tabel 3) om uitdroging van de voedingsdraden te voorkomen tijdens passage. Voeg SSC's op dezelfde dag, zoals hieronder beschreven in de punten 3.1 en 3.4, met behulp van de aangegeven maten van putjes die feeders.

2. Dissociatie van de muis testis weefsel te Donor Germ cellen te verkrijgen

1. Oogst volwassen muis testes in steriele mode en tijdelijk de testikels op te slaan in een overdekte petrischaal (zonder vloeistof toegevoegd). De schotel moet onmiddellijk op ijs geplaatst om uitdroging te voorkomen en te onderhouden cellevensvatbaarheid.
2. Met behulp van steriele fijne tang en een boete schaar in een celkweek kap, maak een dwarse snede in de tunicaalbuginea zonder volledig doorsnijden van de testis (dat wil zeggen, gesneden ~ ½ - ¾ afstand thrdoorgedreven) en gebruik een tang om squeeze out testes in een hoek van de plaat; aflegstapel tunica en een aangrenzende weefsel. Houd plaat op ijs gedurende houden weefsel gekoeld, met behoud van de integriteit en het voorkomen van verdamping.
3. Snel gehakt buisjes met fijne lente schaar minstens 3 minuten per testis, terwijl plaat op ijs.
4. Verzamel de tubulus fragmenten in een 50 ml conische buis en wassen ~ 40 ml koud PBS / 1% bovine serum albumine.
5. Centrifugeer bij 60 xg gedurende 10 min om tubulus fragmenten scheiden van spermatozoa en vuil. Gooi supernatant.
6. In een 15 ml conische buis, resuspendeer de pellet in 3 ml per testis van voorverwarmde dissociatie buffer (DMEM, 0,05% trypsine, 0,03% collagenase type I, 80 U / ml DNAse I en 0,5% runderserumalbumine, zie Tabel 2 voor meer specifieke details van dissociatie buffer).
7. Horizontale positie de conische buis in een rek in een shaker ingesteld op 150 rpm bij 37 ° C gedurende 15 minuten een maximalegitation.
8. Spin down bij 60 xg gedurende 10 min te scheiden afzonderlijke cellen van gedissocieerde brokken.
9. Sla de pellet met brokken tot de volgende stap. Verzamel supernatant uit stap 2.8 en 3 ml DMEM/10% foetaal runderserum dissociatie buffer te neutraliseren. Plaats buis op ijs tijdelijk.
10. Herhaal stap 2,6 tot 2,7 met de opgeslagen pellet van stap 2,9 tot opnieuw verteren brokken die overblijven na stap 2.8.
11. Voeg een gelijk volume van DMEM/10% FBS dissociatie buffer te neutraliseren.
12. Recombineren schorsing vanaf stap 2,11 met opgeslagen celsuspensie vanaf stap 2.9. Centrifugeer gedurende 5 min bij 300 x g.
13. Hersuspendeer pellet in stamcellen medium in een volume van 16 ml per paar testes (zie tabel 3).

3. Plating van testiculaire celsuspensie

1. Plaat 2 ml celsuspensie per putje in een 6-wells plaat met voedingscellen mitotisch geïnactiveerd met mitomycine-C en in een celkweek incubator bij 37 ° C in _5% CO2.
2. Na 48 uur, aspiraat medium, voeg 2 ml vers medium en terug te keren naar incubator.
3. Na 48 uur voeg 0,5 ml vers stamcellen medium aan elk putje en de incubator.
4. Na 48 uur later voeden cellen drie keer per week daarna als volgt tot grote discreet kolonies (> 50 cellen) lijken (binnen 7 tot 21 dagen). Voor de eerste en tweede voeden elke week (bijv. maandag en woensdag) te verwijderen ~ 50% van de middelgrote en terug 50% toe te voegen door het volume van vers medium. Voor derde voeding (bijv. vrijdag), zuigen alle middelgrote en te vervangen door 2 ml vers medium. Deze benadering is gebaseerd op de gedachte dat het vermijden van compleet medium veranderingen concentratieschommelingen van paracriene signalen die worden uitgescheiden in het kweekmedium ⁹ minimaliseert.

4. Colony Picking voor First Passage

1. Verwijderen medium uit putjes die kolonies worden gepasseerd door vers medium stamcellen.
2. Identificeer kolonies met een 10x objectief. Met de microscoop lichte de-gericht, zal SSC kolonies aan de rand van de put verschijnen als heldere homogene massa's, uit vele 11-12 urn diameter cellen waarin het moeilijk of onmogelijk om de individuele cel grenzen onderscheiden, omdat de cellen verschijnen samengesmolten (Figuur 1A). Niet-SSC kolonies lijken donkerder, meer gedetailleerde of minder homogeen, met waarneembare grenzen (Figuur 1A, inzet).
3. Met een 200 pi pipetpunt met pipetteman ingesteld op 50 ul eerst up medium uit de put en verdrijven de tip bevochtigen. Dan voorzichtig verschuiven de kolonie met de punt voor snel trekken 50 ul medium om de kolonie verdrijven door zuiging in de tip (Figuur 1B).
4. Verdrijf het medium dat de kolonie in een putje van een 48-wells plaat met geïnactiveerde feeder cellen met 100 pl stamcellen medium (Figuur 1C).
5. Herhaal stap4.3 en maximaal 8 kolonies met dezelfde goed zonder meer dan 500 ul per putje.
6. Herhaal de stappen 4,3 tot 4,5 om extra putten van de 48 wells-plaat te bereiden met doorgang een SSC kolonies.
7. Wells klaar te splitsen in 7-14 dagen of na grote massa tot 500 cellen ontstaan ​​(Figuur 1D).

5. Latere Uitbreiding en passage van de SSC's door Trituratie

1. Cellen bij passage men moet worden voortgekweekt op vers na feeders tot 14 dagen bij een split verhouding van 1:2 voor de eerste 3 passages en 1:04-01:06 (elke 7 dagen) daarna als volgt. Voorzichtig vermalen kolonies uit een semi-confluente well (bv. ~ 300.000 SSC / putje 6-well plaat) met een 1 ml pipet door wasmedium over de cellen. Kolonies zichtbaar los. Te veel kracht de vloeistofstroom zal ongewenste feeder cellen te loskomen.
2. Verzamel getritureerd cellen in een conische buis en gecentrifugeerd bij 300 g gedurende5 min. Opmerking: Een behandeling met trypsine stap kan hier veilig worden toegevoegd indien gewenst door de onderzoeker.
3. Zuig supernatant en in zoet stamcel medium opnieuw te suspenderen door het grondig en neer te pipetteren om kolonies te verstoren.
4. Plaat SSC's op vers bereid feeder cellen geïnactiveerd met mitomycine-C, zoals beschreven in hoofdstuk 1.
5. Voeden cellen drie keer per week als volgt. Voor de eerste en tweede voeding (bijv. maandag en woensdag) voeg 50% van het volume van vers medium. Voor derde voeding (bijv. vrijdag), zuigen alle middelgrote en te vervangen door 2 ml vers medium. Platen zullen confluent in 7-10 dagen. Culturen moet bestaan ​​uit> 98% kiemcellen (di <1% contaminerende somatische cellen) na 5-7 passages op basis van immunokleuring (bijv. met gebruik van muriene kiemcel marker GCNA) van geslachtscellen onderscheiden van somatische cellen ^10. Opmerking: Deze methoden zijn ontwikkeld in overeenstemming met de voorschriften en vereisten die door de instelling te stellenAl Animal Care en gebruik Comite op Weill Cornell Medical College.

Representative Results

Het uiterlijk van passage nul wild type, een volwassene SSC kolonies na 7 dagen figuur 1. Driedimensionale kolonies bestaan ​​uit een laag van platte cellen aan de stroomvoorziening of ondergeschikte extracellulaire matrix afgezet door de feeders met meerdere lagen SSCs groeien geplaatst. Terwijl gezonde SSCs zijn licht en uniform refractiele 11-12 urn diameter, de celranden zijn moeilijk te onderscheiden en de grootte van de kolonies kunnen zeer variabel, zowel binnen de put en tussen wells bereid uit verschillende muizen. Visualisatie van de kolonies wordt geholpen door een fase microscoop met een digitaal display en een licht de gerichte focal plane, waarbij het contrast tussen zeer homogene SSC kolonies en verontreinigende somatische cellen die aanwezig zijn in vroege passage (0-2) culturen en doen verbetert vormen geen strak ingepakte kolonies (zie figuur 1A kader). Merk op dat de morfologie van de voedingscellen geleidelijk af veranderenter overschakelen van DMEM/10% tot celkweekmedium voort na inactivatie met mitomycine-C.It is ook belangrijk op te merken dat de aanvankelijke celsuspensie niet gefilterd of gespannen, omdat residuele massa's van somatische cellen wordt gedacht dat ze de overleving van SSC's te verbeteren op de initiële platen en mag niet worden verwijderd totdat SSC kolonies vastgesteld. Serial passage (> 5-7 keer) is vereist om de geslachtscellen zuiveren tot bijna homogeniteit (> 98%) en residuele somatische cellen te verminderen. Indien latere experimenten vereisen specifiek verrijking van stamcellen uit de totale populatie van kiemcellen in de kweek, dan wordt cel selectie met immunomagnetische kralen of flowcytometrie worden gebruikt voor verdere zuivering, bijvoorbeeld stamcellen verrijking kan worden verkregen met behulp van antilichamen tegen Thy1 , CD9, α6 integrine en andere ^11. De identiteit van SSCs moet vervolgens worden bevestigd met immunofenotypering, genexpressie en transplantatie omdat transplantation-analyse is de enige manier om definitief te beoordelen van de hoeveelheid authentieke, functionele stamcellen ^12,13.

Figuur 1. Morfologie van de vroege SSC kolonies, testiculaire stromale cellen en feeders. A, Uiterlijk van ontluikende SSC kolonies ~ 5 dagen na de eerste plating. Inzet toont contaminerende monocyt-achtige somatische cellen in een passage nul cultuur. B, selectie en plukken van individuele kolonies eerste doorgang (~ 14 dagen) in 48-well platen. De zwarte structuur is de pipetpunt. C, Uiterlijk van geïnactiveerde JK1 feeder-cellen. D, Grote kolonies voorafgaand aan de routine subcultuur. Pijlen geven SSC kolonies. Schaalbalk in A is 100 urn (inset, 50 pm) en BD is 200 urn.

Discussion

Deze methode voor het afleiden van volwassen SSC's met volwassen testis afgeleide feeder-cellen is robuust en is erin geslaagd om als gemeenschappelijke genetische achtergronden (bv. FVB, C57Bl6 en gemengde 129SV/C57Bl/6) en verschillende mutante stammen werden gebruikt ^2,3,7,14. In feite is de micro die door het cultuurstelsel voldoende is om een deel van de genetische belemmeringen handhaven volwassen SSC in vivo (bijvoorbeeld bij plzf ^{- / -} dieren) overwinnen ^7. Terwijl we gebruik JK1 cellen feeders kunnen niet-getransformeerde volwassen testiculaire somatische cellen ook worden gebruikt met even doeltreffend als JK1 cellen ^2,3.

SESC is ontworpen om efficiënt te verkrijgen op lange termijn volwassen SSC lijnen. Helaas is de hoge efficiëntie bereikt met een trade-off om de volgende reden. Een opmerkelijke beperking van deze procedure is dat het weglaten van een filter of overbelasting stap bij de eerste platen en de manipulatie die de procedure omvat, die invloed kan hebben celoverleving, kan aanzienlijke verschillen in het aantal cellen uitgeplaat van tot goed dat effectieve kwantificering sluit het stadium van initiële kolonievorming. Echter, kwantitatieve bepalingen worden uitgevoerd met iets later passage cultures waarna een enkele celsuspensie gemakkelijk worden bereid door standaard trypsine (> passage 5-7).

Omdat volwassen SSCs in cultuur kan worden uitgebreid en vrijwel oneindig gehandhaafd, dit protocol kan de efficiënte productie van cellijnen die vervolgens kan worden op een vergelijkbare manier gebruikt om andere bestaande primaire kweken of cellijnen (IE gen en eiwitexpressie analyses of ectopische expressie van een gen van interesse). Niettemin is het essentieel om uiteindelijk bevestigen de resultaten met transplantatie analyse als de gouden standaard of een ander gevalideerd surrogaat assay, zoals SSC clustervorming assay ^12,15.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Corning	10-013	Diluent for dissociation buffer
Trypsin/EDTA	Mediatech	25-051-CI
Stem cell base medium (StemPro-34)	Life Technologies	10639-011	Requires supplementation as per Shinohara et al. (2003)*
Stem cell medium supplements	various	see Table 3	Requires supplementation as per Shinohara et al. (2003)*
JK1 cells	Cell Biolabs, Inc.	CBA-315	Can substitute with adult testicular stromal cells as per Seandel et al. (2007)
mitomycin-C (CAUTION)	Sigma-Aldrich	M4287	Toxic; Handle with care.
Gelatin	Sigma-Aldrich	G1890	0.4% solution in water
EVOS xl digital inverted microscope	Advanced Microscopy Group	-
Table 1. Specific reagents and equipment. *See Table 3
DMEM	Corning	10-013	Diluent for dissociation buffer
trypsin (1:250)	Life Technologies	27250-018	Dissociation buffer: Final 0.05% wt/vol
collagenase, type I, 235 U/ml	Worthington	CLS1 235	Dissociation buffer: Final 0.03% wt/vol
DNAse I	Sigma-Aldrich	DN25	Dissociation buffer: Final 80 U/ml
bovine serum albumin	ICP Bio	ABRE-100g	Dissociation buffer: Final 0.5% wt/vol
Table 2. Dissociation buffer
StemPro-34 SFM	Life Technologies	10639-011
StemPro-34 Nutrient supplement	Life Technologies	10639-011
Additional supplements**
Non-essential amino acids	Sigma-Aldrich	M7145	1X
MEM Vitamin solution	Life Technologies	11120-052	1X
L-glutamine	Mediatech	25-005	2 mM
bovine serum albumin	ICP Bio	ABRE	0.50%
Antibiotic-Antimycotic Solution	Mediatech	30-004-CI	1X
D(+)glucose	Sigma-Aldrich	G8769	6 mg/ml
β-estradiol	Sigma-Aldrich	E2758	30 ng/ml
progesterone	Calbiochem	5341	60 ng/ml
fetal bovine serum	variable	n/a	1%
bovine holo-transferrin	Sigma-Aldrich	T1283	100 μg/ml
insulin	Gemini Bio-Products	700-112P	25 μg/ml
human GDNF	Life Technologies	PHC7041	10 ng/ml
human bFGF	Life Technologies	PHG0023	10 ng/ml
mouse EGF	Life Technologies	PHG0313	20 ng/ml
putrescine	Research Organics	0778P	60 μM
sodium Selenite	Sigma-Aldrich	S5261	30 nM
pyruvic acid	Alfa Aesar	A13875	30 μg/ml
DL-lactic acid	J.T. Baker	0196-04	1 μg/ml
β-mercapt–thanol	Life Technologies	21985-023	50 μM
ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A4544	100 μM
D-biotin	Sigma-Aldrich	B4639	10 μg/ml
Table 3. Stem cell medium
*Note: Add supplements below before using medium. Filter sterilize and keep it at 4 °C. The medium is stable for at least 2 weeks.
**We have employed different manufacturers, formulations, and/or lot numbers of these reagents without any apparent deleterious effects. In general, cell culture grade reagents should be employed.